番茄液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶抑制蛋白克隆、生物信息學及表達分析

許洋，程遠，阮美穎，王榮青，葉青靜，姚祝平，周國治，劉樂承，萬紅建*

(1.長江大學 園藝園林學院，湖北 荊州 434000；2.農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風險防控國家重點實驗室 浙江省農(nóng)業(yè)科學院 蔬菜研究所 中澳作物改良中心，浙江 杭州 310021)

蔗糖轉(zhuǎn)化酶(invertase，INV)是糖代謝的關(guān)鍵酶，可將蔗糖分解為葡萄糖和果糖，在植物的初級代謝、生長發(fā)育和響應(yīng)逆境脅迫等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[1-2]。蔗糖轉(zhuǎn)化酶依據(jù)亞細胞定位，可分為3類：細胞壁轉(zhuǎn)化酶(cell wall invertase，CWIN)，液泡轉(zhuǎn)化酶(vacuolar invertase，VIN)和細胞質(zhì)轉(zhuǎn)化酶(cytoplasmic invertase，CIN)。依據(jù)酶催化反應(yīng)的最適pH值劃分，CWIN和VIN同屬于酸性轉(zhuǎn)化酶，且在翻譯后水平受各自轉(zhuǎn)化酶抑制蛋白的調(diào)節(jié)。其中，調(diào)控VIN轉(zhuǎn)錄翻譯后活性的抑制子為液泡轉(zhuǎn)化酶抑制因子(vacuolar invertase inhibitor，VIF)，調(diào)節(jié)CWIN表達的為細胞壁轉(zhuǎn)化酶抑制因子(cell wall invertase inhibitor，CWIH)。轉(zhuǎn)化酶抑制因子是一組能通過蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用而抑制酸性轉(zhuǎn)化酶活性的小多肽[3]，且該基因僅存在于表達模式多樣的高等植物中[4]，在調(diào)節(jié)蔗糖代謝、調(diào)控植物的生長發(fā)育方面發(fā)揮著重要作用。

轉(zhuǎn)化酶抑制因子的存在已在多種植物中被證實，如煙草[5]、擬南芥[6]、玉米[7]、番茄[8-9]、馬鈴薯[10]、辣椒[11]、梨[12]、桃[13]和萱草[14]等。轉(zhuǎn)化酶抑制因子是一種小分子蛋白質(zhì)，分子量為15～23 ku，由4個保守的半胱氨酸殘基組成[1，15]。它通過與酸性轉(zhuǎn)化酶相互作用，調(diào)控轉(zhuǎn)化酶的活性，在糖信號傳遞和碳分配方面發(fā)揮重要的作用。Wang等[13]通過酵母雙雜(yeast two-hybrid，Y2H)和雙分子熒光互補(bimolecular fluorescence complementation，Bifc)實驗，證明了桃的蔗糖轉(zhuǎn)化酶抑制因子(PpINH1)與液泡轉(zhuǎn)化酶(PpVIN2)存在相互作用，且PpINH1抑制桃果實中VIN的活性，在經(jīng)過海藻糖處理后，桃果實中PpINH1的表達上調(diào)導(dǎo)致了VIN活性的降低，從而減緩了蔗糖分解，提高了果實抗冷的能力；Qin等[16]通過Y2H實驗，驗證了番茄液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶與液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶抑制蛋白兩者之間的互作關(guān)系，并證實了液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶抑制蛋白參與蔗糖代謝，影響果實的成熟；Ma等[12]亦在梨中鑒定出了液泡轉(zhuǎn)化酶PbrAc-Inv1與液泡轉(zhuǎn)化酶抑制因子PbrII5，并通過Y2H與Bifc實驗證實了PbrII5通過與PbrAc-Inv1相互作用，調(diào)控VIN 的活性，從而調(diào)控梨果實中糖分的組成等。上述研究表明，蔗糖轉(zhuǎn)化酶抑制因子通過與蔗糖轉(zhuǎn)化酶相互作用，調(diào)控蔗糖轉(zhuǎn)化酶的活性，調(diào)節(jié)植物體內(nèi)糖分組成，影響果實成熟，提高植株抵御逆境的能力等。

番茄(SolanumlycopersicumL.)屬茄科，是水果和蔬菜兼用作物，也是研究肉質(zhì)果實發(fā)育的模式作物[17-18]。在番茄果實發(fā)育及植物生長過程中，糖類可為番茄提供甜味，產(chǎn)生膨壓，促進細胞膨脹，是果實風味的重要指標，也是其抵御不利環(huán)境的重要方式。本研究克隆得到了SlVIF的cDNA與基因序列，利用生物信息學手段對其編碼的氨基酸序列及蛋白結(jié)構(gòu)進行預(yù)測分析，通過構(gòu)建進化樹發(fā)現(xiàn)茄科物種的INH在基序(motif)上的保守性。并利用RNA-seq數(shù)據(jù)分析了SlVIF的組織特異性表達模式，可為后續(xù)深入研究番茄VIF基因的功能提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以種植在浙江省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所人工氣候室的Alisa為實驗材料。試驗所用的植物總RNA提取試劑盒為Omega公司的E.Z.N.A?Plant RNA Kit，反轉(zhuǎn)錄和膠回收試劑盒為天根公司的FastKing RT Kit(With gDNase)FastKing cDNA 第一鏈合成試劑盒與Universal DNA Purification Kit通用型DNA純化回收試劑盒，克隆載體采用全式金公司的pEASY@-Blunt Cloning Kit。

1.2 番茄SlVIF基因的克隆

依據(jù)Solyc12g099190從番茄基因組數(shù)據(jù)庫(https：//solgenomics.net/)中下載對應(yīng)的基因序列和CDS序列，利用PCR退火溫度計算器設(shè)計特異性引物SlVIF(表1)，以Alisa的DNA與cDNA為模板，利用KOD OneTMPCR Master Mix進行基因序列與cDNA序列的擴增。反應(yīng)體系：(1)DNA擴增體系，DNA模板1.5 μL、KOD OneTMPCR Master Mix 25 μL、上下游引物各1.5 μL、ddH2O 20.5 μL；(2)cDNA擴增體系，cDNA模板2 μL、KOD OneTMPCR Master Mix 25 μL、上下游引物各1.5 μL、ddH2O 20 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min；98 ℃ 10 s、55 ℃ 5 s、68 ℃ 10 s，34個循環(huán)；72 ℃ 10 min。用1.2%的瓊脂糖進行凝膠電泳。將膠回收得到的SlVIF基因產(chǎn)物與cDNA產(chǎn)物分別與pEASY?-Blunt Cloning Vector進行連接后轉(zhuǎn)化Trans1-T1感受態(tài)，將菌液均勻涂布于含有50 mg·mL-1卡那霉素的LB固體培養(yǎng)板上，倒置37 ℃培養(yǎng)過夜，挑取單克隆進行菌液PCR檢測，將陽性單菌落送至擎科生物技術(shù)有限公司(杭州)進行測序。

表1 SlVIF基因引物信息Table 1 SlVIF gene primer information

1.3 番茄SlVIF基因生物信息學分析/序列特征分析

利用EMBL-EBI在線序列比對工具Needle比對參考序列與擎科測序結(jié)果，分析其中差異；使用CSDS2.0繪制SlVIF的基因結(jié)構(gòu)。采用Expasy-ProtParam進行SlVIF蛋白理化性質(zhì)預(yù)測；利用Protscale、DeepTMHMM、SignaIP-6.0預(yù)測蛋白的親疏水性、是否存在跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽；采用SOPMA與SWISS-MODEL進行蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測；采用NCBI-CD-search預(yù)測蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域。

1.4 番茄SlVIF蛋白保守基序與系統(tǒng)發(fā)育分析

使用MEGAX軟件構(gòu)建NJ(Neighbor-joining)系統(tǒng)發(fā)育樹，采用MEME對轉(zhuǎn)化酶抑制蛋白序列特征進行分析，基序數(shù)量設(shè)為10，并利用TBtools對轉(zhuǎn)化酶抑制蛋白的發(fā)育樹與保守基序進行可視化。

1.5 番茄SlVIF基因啟動子序列分析

使用PlantCARE對SlVIF基因啟動子區(qū)域(3 000 bp)進行順式作用元件預(yù)測。

1.6 番茄SlVIF的表達量分析

利用從Tomato functional genomics數(shù)據(jù)庫中提取的有關(guān)SlVIF在花、果實、根、葉片等器官與組織中的RNA-seq數(shù)據(jù)來研究該基因的差異表達。使用從Tomato functional genomics中提取的SlVIF基因在多種DC3000菌株處理下不同組織的RPKM值及Tomato Expression Atlas數(shù)據(jù)庫中提取的SlVIF基因在水脅迫下不同組織內(nèi)的RPKM值來研究該基因在逆境脅迫下的表達模式。采用經(jīng)log2(RPKM+1)轉(zhuǎn)換的值來生成顯示組織特異性表達圖譜的熱圖，基因表達水平的可視化通過TBtools軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄SlVIF基因的克隆

利用SlVIF分別對Alisa的DNA和cDNA進行擴增，擴增結(jié)果用每100 mL 12 g的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，得到兩條大于500 bp的特異性條帶(圖1中a)。切膠回收后與載體連接轉(zhuǎn)化，篩選陽性單克隆并送至公司測序。測序結(jié)果顯示，兩組PCR產(chǎn)物的長度均為528 bp，堿基序列具有一致性，編碼175個氨基酸。測序結(jié)果與番茄基因組數(shù)據(jù)庫篩選到的序列相似度為99.8%，僅存在一個堿基的差異，造成了單個氨基酸的變異(Asn→His)，并且通過多序列比對，發(fā)現(xiàn)該基因含有4個保守的半胱氨酸殘基位點(圖1中b)。GSDS2.0繪制的SlVIF基因結(jié)構(gòu)顯示，其不含有內(nèi)含子和非翻譯區(qū)域(UTR結(jié)構(gòu))，僅由外顯子區(qū)域構(gòu)成(圖1中c)。

a表示SlVIF基因與cDNA序列PCR擴增產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果；b表示SlVIF核苷酸序列及氨基酸序列全長，其中標紅字體為VIF蛋白保守位點；c表示SlVIF基因結(jié)構(gòu)。圖1 番茄SlVIF基因克隆Fig.1 Cloning of tomato SlVIF gene

2.2 番茄SlVIF理化性質(zhì)與蛋白結(jié)構(gòu)分析

對Expasy-ProtParam預(yù)測結(jié)果分析表明，SlVIF蛋白的理論等電點為5.53，分子量為19.92 ku，負電荷殘基(Asp+Glu)總數(shù)為23，正電荷殘基(Arg+Lys)總數(shù)為21，蛋白質(zhì)的分子式為C881H1423N231O268S12，總平均親水指數(shù)為-0.127，不穩(wěn)定系數(shù)為32.48，說明SlVIF蛋白穩(wěn)定性好。依據(jù)Protscale預(yù)測SlVIF蛋白的親疏水性結(jié)果顯示，SlVIF蛋白有5個較明顯的親水區(qū)，親水指數(shù)最小值位于第21位氨基酸，為-2.578，疏水指數(shù)最大值位于第8位氨基酸，為2.456，再結(jié)合總平均親水指數(shù)，推測該蛋白表現(xiàn)為親水性(圖2中a)。SlVIF跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測表明其不存在跨膜結(jié)構(gòu)(圖2中b)。信號肽預(yù)測結(jié)果表明，SlVIF蛋白在1～17氨基酸(aa)之間存在一個信號肽(圖2中c)。保守結(jié)構(gòu)域為PMEI。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，SlVIF由57.71%的α-螺旋(alpha helix)，11.43%的延伸片段(extended strand)，1.71%的β-轉(zhuǎn)角(beta turn)以及29.14%的無規(guī)則卷曲(random coil)組成(圖3中a)。并且通過SWISS-MODEL預(yù)測SlVIF蛋白的三級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該蛋白主要由α-螺旋與無規(guī)則卷曲構(gòu)成(圖3中b)，與二級結(jié)果預(yù)測一致。經(jīng)過保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，番茄SlVIF蛋白的特異性保守結(jié)構(gòu)域含有CIF_like(30～174 aa)與PMEI(26～170 aa)特異性保守結(jié)構(gòu)域，及PHE_inhib(1～175 aa)與PMEI(26～167 aa)非特異性保守結(jié)構(gòu)域，屬于PMEI家族(圖4)。

a表示親疏水性預(yù)測，b表示跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測，c表示信號肽預(yù)測。圖2 SlVIF蛋白序列分析Fig.2 SlVIF protein sequence analysis

圖4 SlVIF蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.4 Prediction of the conservative domain of SlVIF protein

2.3 番茄SlVIF蛋白保守基序與系統(tǒng)發(fā)育分析

通過查找文獻及BlastP氨基酸序列比對，從NCBI、Solanaceae Genomics Network數(shù)據(jù)庫中下載轉(zhuǎn)化酶抑制蛋白的同源序列，并通過MEGA X構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。如圖5所示，轉(zhuǎn)化酶抑制蛋白被劃分為4個亞組，番茄轉(zhuǎn)化酶抑制蛋白全部被劃分在第一亞組(黃色區(qū)域)，且茄科物種轉(zhuǎn)化酶抑制蛋白均被劃分在這一亞組，在這一亞組內(nèi)番茄VIF與CWIH(Solyc12g099200與Solyc12g099210)被劃分在兩組(group a與group b)內(nèi)。在group a內(nèi)，XP_016474343[19]與AIT42248[20]在已有的研究中被證實為液泡轉(zhuǎn)化酶抑制蛋白，b組中CAA73333[21]、Solyc12g099200與Solyc12g099210[16]被注冊或鑒定為細胞壁轉(zhuǎn)化酶抑制蛋白。故推測group a組的基因為VIF基因，b組為細胞壁轉(zhuǎn)化酶抑制蛋白基因，液泡和細胞壁轉(zhuǎn)化酶抑制蛋白被劃分為兩個分支。結(jié)合保守基序分析，亞組Ⅰ中除SlVIF、AIT42248與茶的兩個INH基因外，都具有相同的保守基序，且氨基酸長度基本相等。

番茄：Solyc12g099200，Solyc12g099210[16]；馬鈴薯：AIT42248，AIT42247[20]；煙草：XP_016474343[19]，CAA73333[14]；辣椒：KAF3657138；擬南芥：AT1G47960，AT5G64620[20]；茶：CSS0012414，CSS0020686，CSS0037733，CSS0047439[22]；桃：Prupe_5G112600，Prupe_3G146800，Prupe_1G114500，Prupe_1G113800，Prupe_3G007700[13]；梨：KAB2630300，KAB2632320[23]；可可：EOY17136，EOY06785[24]。圖5 植物液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶抑制蛋白系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系及保守基序分析Fig.5 Phylogenetic relationship and conserved motif analysis of plant vacuolar sucrose invertase inhibitory protein system

2.4 番茄SlVIF基因啟動子序列分析

啟動子區(qū)域順式作用元件預(yù)測結(jié)果顯示，在該區(qū)域內(nèi)，存在多個與激素、非生物脅迫相關(guān)的作用元件，包括脫落酸(ABRE)、茉莉酸(CGTCA-motif、TGACG-motif)、乙烯(ERE)、赤霉素(GARE-motif、P-box)、生長素(TCA-element、TGA-element)、干旱(MYB、MYC)等。此外，還發(fā)現(xiàn)了與光響應(yīng)相關(guān)的元件，有AAAC-motif、AT1-motif、Box 4、chs-CMA1a、chs-CMA2a、G-Box、G-box。結(jié)果表明，該啟動子可能參與光、干旱脅迫、激素等誘導(dǎo)。

2.5 番茄SlVIF基因的表達

2.5.1SlVIF基因在不同組織與器官中的表達模式分析

RNA-seq數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示(圖6)，SlVIF基因在Heinz(Solanumlycopersicum)與LA1589 (Solanumpimpinellifolium)番茄不同器官中的表達存在明顯差異，在所選的器官中，SlVIF在Heniz番茄中只在根部有高水平的表達，在其他部位表達水平較低(圖6中a)。而在LA1589中，隨著果實的生長發(fā)育，SlVIF的表達量在持續(xù)上調(diào)，在成熟果實中表達水平達到最高；此外，SlVIF在整個根部也有較高的表達水平，但其在葉片、下胚軸、子葉、幼花芽中的表達量相對較低(圖6中b)。

a表示 Heinz番茄，b表示 LA1589番茄。圖6 番茄不同組織與器官中SlVIF基因的表達模式熱圖Fig.6 Heat map of the expression pattern of SlVIF gene in different tissues and organs of tomato

2.5.2SlVIF基因在不同非生物脅迫下的表達模式分析

SlVIF基因在經(jīng)過水分脅迫處理后，在M82番茄不同組織中的表達水平存在差異(圖7中a)。隨著土壤中含水量的降低，其在未成熟果實與成熟果實中相同部位轉(zhuǎn)錄水平存在一定的差異。在未成熟果實中，SlVIF在隔膜、胎座、軸柱中的表達量呈現(xiàn)先下調(diào)后上調(diào)的趨勢，在成熟果實中，SlVIF在果皮、隔膜與葉片中的表達水平變化不明顯，而在小柱和種子中表現(xiàn)出表達量逐步上調(diào)的趨勢。使用多種DC3000菌株處理Rio Grande番茄的葉片，RNA-seq數(shù)據(jù)顯示，SlVIF基因在相同處理的不同時間段，表達水平未呈現(xiàn)顯著性變化，但總體隨著處理時間的增加，SlVIF基因的表達水平呈現(xiàn)上調(diào)的趨勢(圖7中b)。

a表示M82番茄，水分脅迫，40%、35%、30%、25%表示土壤含水量，20DPA表示果實生長天數(shù)，RR表示成熟果實(紅熟)；b表示Rio Grande番茄，不同DC3000菌株脅迫。圖7 SlVIF基因在不同非生物脅迫下的表達模式熱圖Fig.7 Heat map of expression patterns of SlVIF gene under different abiotic stresses

3 討論

液泡轉(zhuǎn)化酶抑制因子通過在翻譯后水平與液泡轉(zhuǎn)化酶相互作用，來調(diào)控液泡轉(zhuǎn)化酶的活性，這在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育和響應(yīng)逆境脅迫[22，25-26]等方面發(fā)揮著重要作用。液泡轉(zhuǎn)化酶是蔗糖轉(zhuǎn)化酶的重要組成部分，可在液泡內(nèi)將蔗糖不可逆地水解為己糖，參與果實內(nèi)蔗糖代謝[27-28]、介導(dǎo)細胞伸長[29-30]、響應(yīng)非生物脅迫[31]等。并且對SlVIF基因上游啟動子區(qū)域3 000 bp的序列進行順式作用元件預(yù)測，結(jié)果表明，該序列存在多個與激素、干旱、光等相關(guān)的元件，故推測該基因具有抵抗不利環(huán)境因素，參與調(diào)節(jié)植物逆境脅迫的能力。Chen等[26]在一個對脫落酸敏感的保衛(wèi)細胞特異性啟動子(AtRab18)的控制下用煙草液泡轉(zhuǎn)化酶抑制因子的同源物(Nt-inhh)轉(zhuǎn)化擬南芥，發(fā)現(xiàn)煙草VIF在保衛(wèi)細胞中異位表達增強擬南芥的抗旱性。

本研究從番茄中克隆出的SlVIF基因長為528 bp，共編碼了175個氨基酸，不存在內(nèi)含子區(qū)域。通過Blastp，獲得不同物種的同源序列，發(fā)現(xiàn)蔗糖轉(zhuǎn)化酶抑制因子因調(diào)控對象的不同，在系統(tǒng)發(fā)育樹中存在不同的分支，且茄科物種中的轉(zhuǎn)化酶抑制因子親緣關(guān)系較近，被劃分在同一亞組內(nèi)，具有相同的保守基序。Wan等[4]和Wang等[13]通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，推測VIF僅存在于維管束植物中，并且Wang等[13]在被子植物的祖先Amborellatrichopoda中沒有預(yù)測到VIF基因，VIF的數(shù)量在不同的物種中存在差異?，F(xiàn)已在番茄中鑒定了一個液泡轉(zhuǎn)化酶抑制蛋白和兩個細胞壁轉(zhuǎn)化酶抑制蛋白[16，4]。He等[22]在茶樹中共鑒定了4個INH(CsInvInh)，在冷脅迫下這些INHs通過抑制酸性轉(zhuǎn)化酶的活性參與茶樹生長發(fā)育與冷響應(yīng)。

本研究對SlVIF在組織與器官中的表達分析發(fā)現(xiàn)，該基因在不同的番茄(Heinz和LA1589)中的表達模式存在差異。在栽培番茄Heinz中，SlVIF在根部有一個高水平的表達；在野生番茄LA1589中，SlVIF在整個植株的不同部位都有表達，尤其是在果實發(fā)育的后期和根部有高水平的表達；在栽培番茄Ailsa Craig中，SlVIF在成熟果實中有相對高的表達，而在根組織中表達水平很低[16]。這或許與選材、苗齡、植物生長狀態(tài)等有關(guān)。SlVIF基因可能通過介導(dǎo)蔗糖代謝，影響果實成熟或根系的生長等。蘇濤等[21]在楊樹中鑒定并證實了PtC/VIF1為β-果糖苷酶抑制子(轉(zhuǎn)化酶抑制因子)，發(fā)現(xiàn)其在根部有一個高水平的表達。Mollah等[32]發(fā)現(xiàn)液泡轉(zhuǎn)化酶抑制劑 PpINHa 和 PpINH3 對桃果實中糖分積累的作用是相反的，但過表達這兩個基因，與果實糖代謝與轉(zhuǎn)運相關(guān)的基因都會受到影響。此外，RNA測序(RNA-seq)數(shù)據(jù)顯示，SlVIF的表達受到水分脅迫與細菌的誘導(dǎo)，SlVIF在不同的組織中呈現(xiàn)差異表達，但整體隨著水分含量的降低與菌株脅迫時間的延長，表達量呈上調(diào)的趨勢。這與順式作用元件預(yù)測結(jié)果一致。

蔗糖轉(zhuǎn)化酶抑制蛋白通過調(diào)節(jié)酸性轉(zhuǎn)化酶的活性來調(diào)控蔗糖代謝，使其維持穩(wěn)態(tài)。在冷藏期間，過表達對低溫糖化敏感的馬鈴薯塊莖中的VIF(INH2)基因，可導(dǎo)致酸性轉(zhuǎn)化酶活性的降低與還原糖積累的減少，而在抗低溫糖化的品系中抑制INH2的表達可增加其對低溫糖化的敏感性[33]。ShINH1與ShINH2可在甘蔗蔗糖積累中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，重組ShINH1可有效抑制酸性轉(zhuǎn)化酶的活性，是控制甘蔗收獲前后蔗糖變質(zhì)的候選藥物[34]。此外，VIF的表達受環(huán)境和發(fā)育信號的調(diào)控[35]，通過調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的糖分積累來影響植物的生長發(fā)育。故對VIF進行深入研究，有助于了解植物的生長發(fā)育，調(diào)控果實品質(zhì)，提高作物抵御不良環(huán)境的能力。