QuEChERS-HPLC-MS/MS 法測(cè)定九華黃精中26 種農(nóng)藥殘留

◎ 邢海燕，汪 安，朱志祥，程桂林，黎 睿，胡金玲，孫麗婷

（池州市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，安徽 池州 247000）

黃精是我國(guó)傳統(tǒng)的藥食同源植物，其使用歷史至今已有兩千余年。九華黃精獲批中國(guó)國(guó)家地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品，為百合科黃精屬多花黃精，主產(chǎn)于九華山周邊，十大皖藥之一[1]，具有補(bǔ)中益氣、滋陰潤(rùn)肺、抗疲勞、增強(qiáng)免疫、調(diào)節(jié)血糖和延緩衰老等功效[2]。近年來池州市政府堅(jiān)持綠色發(fā)展理念，依托優(yōu)質(zhì)的生態(tài)環(huán)境和自然資源，推廣林下種植方式，大力發(fā)展九華黃精產(chǎn)業(yè)，種植面積超過4 000 hm2，產(chǎn)量約達(dá)3 000 t。

由于野生黃精資源有限，市場(chǎng)需求大，人工種植發(fā)展迅速。黃精生長(zhǎng)過程中，會(huì)有蠐螬等幼蟲在土壤中為害根部，且易滋生雜草影響產(chǎn)量。為提高預(yù)防治療病蟲害和除草效率，有部分藥農(nóng)采取物理化學(xué)藥物相結(jié)合的方法。另外，由于在其他農(nóng)業(yè)種植中使用的農(nóng)藥有80%～90%進(jìn)入土壤中，污染土壤和水源，從而影響到種植用地和用水，使黃精在種植過程中富集農(nóng)藥存在可能，如果農(nóng)藥殘留超標(biāo)，會(huì)給人們的健康帶來危害[3]。

目前農(nóng)殘檢測(cè)常見的樣品前處理技術(shù)有固相萃取法、分子印跡萃取技術(shù)、QuEChERS 法等。常用的分析技術(shù)有HPLC 法、GC 法、HPLC-MS 法和GC-MS法。本文以產(chǎn)于池州地區(qū)的九華黃精生品為研究對(duì)象，優(yōu)化前處理提取凈化方法，采用HPLC-MS/MS 法測(cè)定九華黃精中26 種農(nóng)藥殘留量的分析方法，為農(nóng)業(yè)部門、檢測(cè)機(jī)構(gòu)、九華黃精種植加工企業(yè)提供應(yīng)用參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

26 種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，質(zhì)量濃度均為100 μg·mL-1，介質(zhì)為乙腈，北京迪馬科技有限公司；甲醇、乙腈（色譜純），美國(guó)賽默飛公司；乙酸乙酯、二氯甲烷（色譜純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲酸銨（色譜純），美國(guó)阿拉丁公司；甲酸（優(yōu)級(jí)純），山東西亞化學(xué)股份有限公司；氯化鈉、乙酸鈉、乙酸、無水硫酸鎂（分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠（PSA）、十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）、石墨化炭黑（GCB），粒徑均為40～60 μm，天津博納艾杰爾科技有限公司；分析用水為實(shí)驗(yàn)室用水由FST-TOP-A22 超純水凈化處理系統(tǒng)制備，符合一級(jí)水要求。

1.2 儀器與設(shè)備

1290-6470 三重四極桿液相-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)安捷倫公司；高速離心機(jī)：美國(guó)賽默飛公司；超聲儀，德國(guó)艾爾瑪公司；JA3103N 電子天平，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；FST-TOP-A22 超純水機(jī)，上海富特詩(shī)儀器設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

將樣品粉碎混勻后稱取1 g（精確至0.01 g）于50 mL 塑料離心管中，加9 mL 水渦旋混勻，放置30 min。加入10.0 mL 提取劑及1 顆陶瓷均質(zhì)子，劇烈振蕩1 min，加入6 g 無水硫酸鎂1.5 g 乙酸鈉，劇烈振蕩2 min 后，以8 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心5 min。定量吸取上清液1.5 mL 至裝有220 mg 無水硫酸鎂和凈化劑（100 mg C18＋100 mg PSA ＋30 mg GCB）的2 mL 離心管中，渦旋混勻1 min。以8 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清液過0.22 μm 濾膜后上機(jī)測(cè)定。同時(shí)用陰性九華黃精作為樣品基質(zhì)做空白試驗(yàn)，得到空白基質(zhì)溶液，用于配制標(biāo)準(zhǔn)系列和計(jì)算加標(biāo)回收率。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)系列的配制及定量測(cè)定

準(zhǔn)確吸取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液使用液，用空白基質(zhì)溶液逐級(jí)稀釋配制成質(zhì)量濃度為0 μg·mL-1、0.002 μg·mL-1、0.005 μg·mL-1、0.010 μg·mL-1、0.020 μg·mL-1、0.050 μg·mL-1、0.100 μg·mL-1、0.200 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)系列，供HPLC-MS/MS 分析測(cè)定。以標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液的質(zhì)量濃度（x）和定量子離子的質(zhì)量色譜圖響應(yīng)值（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，按外標(biāo)法定量。

1.3.3 儀器條件

（1）色譜條件。色譜柱：Agilent ZORBA plus C18（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；進(jìn)樣量：2 μL；柱溫：40 ℃；柱流速：0.3 mL·min-1；流動(dòng)相：A 相為2 mmol·L-1的甲酸銨-甲酸（0.01%）甲醇溶液，B 相為2 mmol·L-1的甲酸銨-甲酸（0.01%）水溶液。梯度 洗脫程序：0～0.9 min，2% A；1.0～3.0 min，15% →50% A；3.1～8.0 min，50% →70% A；8.1～12.0 min，70% →98% A；12.1～14.0 min，98%→2% A；14.1～15.0 min，2% A。

（2）質(zhì)譜條件。離子化方式：電噴霧電離；掃描方式：正離子掃描；毛細(xì)管電壓：3 500 V；檢測(cè)方式：MRM 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；鞘氣溫度和流速：300 ℃和10 L·min-1；干燥氣溫度和流速：200 ℃和6 L·min-1；質(zhì)譜優(yōu)化后的方法條件見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.1.1 提取劑的選擇

測(cè)定農(nóng)藥殘留量時(shí)，常用的提取溶劑有乙腈、甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷，通過進(jìn)行26 種農(nóng)藥的平均加標(biāo)回收率來比較這4 種溶劑的提取效率，發(fā)現(xiàn)乙腈提取率最佳，平均回收率可達(dá)到88%（表2），故確定用乙腈作為提取劑。

2.1.2 凈化材料的選擇

由于九華黃精中含有豐富的多糖、甾體皂苷、總黃酮、氨基酸、生物堿、脂肪等成分[4]，萃取時(shí)共萃取物較多，對(duì)提取物凈化處理要求較高。C18可去除樣品基質(zhì)中存在的脂肪和脂類等非極性干擾物質(zhì)，PSA可去除糖類、脂肪酸、有機(jī)酸和酚類等干擾物，GCB可去除色素和甾醇[5]。本文研究C18、PSA、和GCB 3 種凈化材料組合使用對(duì)待測(cè)物回收率的影響，見表3。在以乙腈作為提取劑的前提下，綜合考慮平均回收率和對(duì)色譜柱、檢測(cè)器的保護(hù)，最終選擇100 mg C18+100 mg PSA+30 mg GCB 作為凈化材料。

表3 不同凈化劑的平均加標(biāo)回收率表

2.2 線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限

以陰性九華黃精為空白基質(zhì)，準(zhǔn)確添加適量標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制成0 μg·mL-1、0.002 μg·mL-1、0.005 μg·mL-1、0.010 μg·mL-1、0.020 μg·mL-1、0.100 μg·mL-1、0.200 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)系列，以質(zhì)量濃度（x）和定量子離子的質(zhì)量色譜圖響應(yīng)值（y）進(jìn)行線性回歸，得到線性方程和相關(guān)系數(shù)。用空白樣品加標(biāo)的方法，分別以3 倍信噪比和10 倍信噪比計(jì)算26 種農(nóng)藥的方法檢出限和定量限。由表4 可見26 種農(nóng)藥的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)在0.996 0～0.999 9。當(dāng)取樣量為1 g，加入提取劑為10.0 mL 時(shí)，方法檢出限在0.01～0.05 mg·kg-1，定量限在0.03～0.15 mg·kg-1。

表4 26 種化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限、不同加標(biāo)水平的平均回收率及其精密度表

2.3 精密度和準(zhǔn)確度

在1 g 空白基質(zhì)樣品中按0.002 mg·kg-1、0.020 mg·kg-1、0.200 mg·kg-1加標(biāo)水平添加26 種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，同樣品處理。每個(gè)添加水平平行測(cè)定6 次，回收率和精密度見表4。不同加標(biāo)水平的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍在0.5%～9.1%（n=6），平均加標(biāo)回收率在62.8%～108.6%，均能夠滿足《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)》（GB/T 27404—2008）附錄F 所規(guī)定的技術(shù)要求。

2.4 樣品檢測(cè)

采用優(yōu)化后的前處理方法處理九華黃精未知樣品，這26 種農(nóng)藥均未檢出，在一定程度上說明九華黃精在農(nóng)藥使用上安全性較高。在最佳條件下，26 種農(nóng)藥化合物經(jīng)提取凈化后進(jìn)行定性與定量檢測(cè)，色譜圖如圖1 所示。

3 結(jié)論

本研究分別從提取試劑、凈化材料等方面對(duì)九華黃精中26 種農(nóng)藥殘留量測(cè)定的前處理方法進(jìn)行優(yōu)化，降低了黃精中所含的多糖、甾體皂苷、總黃酮、氨基酸、生物堿、脂肪等成分給前處理帶來的影響，提高了前處理效率。優(yōu)化后的前處理方法，操作方便快捷、提取凈化效果較好，可提高檢測(cè)效率、降低檢測(cè)成本，有助于政府監(jiān)管部門執(zhí)法，規(guī)范九華黃精的種植及其深加工產(chǎn)品的生產(chǎn)加工。