超聲波-微波預(yù)處理輔助酶解制備大豆降糖肽及其穩(wěn)定性分析

◎ 滕 飛，李欣芯，孟繁達(dá)，張和珍，婁沐雨，許 晶

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 文理學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

《國(guó)家基層糖尿病防治管理指南（2022）》指出，糖尿病是一種由多病因引起的以慢性高血糖為特征的代謝性疾病，是胰島素分泌和（或）利用缺陷所造成[1]。按照發(fā)病機(jī)制以及胰島功能的不同，糖尿病主要分為I 型糖尿病、II 型糖尿病、妊娠糖尿病和非典型糖尿病4 類(lèi)[2]。此外，國(guó)際糖尿病聯(lián)盟在發(fā)布的2022 年糖尿病地圖報(bào)告中也表明糖尿病是新型冠狀病毒感染不良結(jié)果的重要危險(xiǎn)因素，且患有I 型或II 型糖尿病的人若血糖控制不佳則更有可能在感染新型冠狀病毒的情況下發(fā)生糖尿病酮癥酸中毒[3]。目前，市場(chǎng)上針對(duì)糖尿病的治療藥物主要有雙胍類(lèi)（如二甲雙胍）、波糖類(lèi)（如伏格列波糖）、列汀類(lèi)（如阿格列?。┖鸵葝u素等[4-5]。這些藥物長(zhǎng)期服用不僅會(huì)提高醫(yī)治成本、增加經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，同時(shí)會(huì)產(chǎn)生一系列副作用，如低血糖、皮膚病變、胃腸道不適和腹型肥胖等。因此，需要探索出更加安全有效且成本低廉的防治方案。

蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)酶水解后產(chǎn)生的肽段可作為α-葡萄糖苷酶抑制劑、α-淀粉酶抑制劑或二肽基肽酶Ⅳ抑制劑，對(duì)II 型糖尿病具有輔助治療作用[6]。目前，物理-酶解復(fù)合改性方法已成為高效、快速制備蛋白酶解物的研究熱點(diǎn)之一。物理-酶解復(fù)合改性多見(jiàn)于超聲波-酶解復(fù)合改性、微波-酶解復(fù)合改性、超高壓-酶解復(fù)合改性和高溫蒸汽-酶解復(fù)合改性等方法。超聲波-微波預(yù)處理技術(shù)聯(lián)合了超聲波和微波兩種物理改性手段，可在超聲波誘導(dǎo)蛋白質(zhì)構(gòu)象變化，暴露出更多蛋白質(zhì)切割位點(diǎn)的同時(shí)，利用微波引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的展開(kāi)和活性位點(diǎn)暴露，進(jìn)一步提高蛋白酶的水解效率[7-8]。但是，超聲波-微波預(yù)處理技術(shù)主要應(yīng)用于生物活性有效成分的提取，在制備具有生物活性的肽段領(lǐng)域鮮有研究。

本文以大豆分離蛋白（Soy Protein Isolate，SPI）為原料，以α-葡萄糖苷酶抑制率為考察指標(biāo)，研究酶解改性和超聲波-微波預(yù)處理輔助酶解復(fù)合改性方法制備具有降血糖活性的大豆降糖肽，確定超聲波-微波預(yù)處理輔助酶解制備大豆降糖肽的最優(yōu)條件，分析大豆降糖肽的穩(wěn)定性，為開(kāi)發(fā)高活性和高穩(wěn)定性的降血糖保健產(chǎn)品奠定理論基礎(chǔ)，為充分利用大豆蛋白資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白，北京市瑞達(dá)恒輝有限公司；中性蛋白酶，北京博奧拓達(dá)科技有限公司；對(duì)硝基苯-α-D-葡萄糖吡喃苷（PNPG），Aladdin 公司；α-葡萄糖苷酶，Solarbio 有限公司；其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

超聲微波化學(xué)反應(yīng)器，鞏義市科瑞儀器有限公司；GL-20G-Ⅱ高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)；PHS-3C 型pH 計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；DZKW 型電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器廠(chǎng)；K750X 真空冷凍干燥器，英國(guó)Quorum 公司；Tecan sunrise 酶標(biāo)儀，奧地利Tecan 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 水解度的測(cè)定

采用pH-stat 法，水解度的計(jì)算公式為

式中：h代表單位質(zhì)量蛋白質(zhì)中被水解的肽鍵的量，mmol·g-1；htot代表單位質(zhì)量蛋白質(zhì)中肽鍵的總量，mmol·g-1，大豆蛋白為7.75 mmol·g-1。

水解過(guò)程中加入堿液的量與斷裂肽鍵數(shù)量的定量關(guān)系，計(jì)算公式為

式中：B代表酶解過(guò)程中消耗的堿液的體積，mL；N代表堿液的濃度，mol·L-1；α代表氨基酸的解離數(shù)；Mp代表參加水解的蛋白質(zhì)的質(zhì)量，g。

α所代表氨基酸的解離數(shù)，計(jì)算公式為

式中：pK值根據(jù)Gibbs-Helmholz 方程計(jì)算[9]，代表氨基酸解離常數(shù)。

1.2.2 α-葡萄糖苷酶抑制活性的測(cè)定

參考LEE 等[10]的研究檢測(cè)α-葡萄糖苷酶抑制率，分別取200 μL 0.15 U·mL-1的α-葡萄糖苷酶溶液和50 mmol·L-1對(duì)硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（P-Nitrophenyl-α-D-Glucopyranoside，PNPG）溶液，與100 μL 樣品溶液混合，用pH=6.8 的0.1 mol·L-1磷酸鉀緩沖液定容至1 000 μL，在37 ℃下孵育60 min。孵育結(jié)束后立即添加1 500 μL 0.25 mol·L-1的Na2CO3溶液終止反應(yīng)。將反應(yīng)溶液搖勻后，取200 μL 液體于96 孔微板，使用Tecan sunrise 酶標(biāo)儀在405 nm 處測(cè)量吸光度。通過(guò)檢測(cè)反應(yīng)體系內(nèi)剩余的α-葡萄糖苷酶與PNPG 反應(yīng)所釋放的黃綠色產(chǎn)物對(duì)硝基苯酚（P-Nitrophenol，PNP）的含量，計(jì)算酶活性。α-葡萄糖苷酶抑制率的計(jì)算公式為

式中：A代表樣品組的吸光度；A0代表無(wú)樣品組的吸光度；A1代表無(wú)樣品和無(wú)PNPG 組的吸光度；A2代表無(wú)PNPG 組的吸光度。

1.2.3 酶水解制備大豆降糖肽的最優(yōu)工藝

配制最佳濃度（3%）的SPI 溶液，在55 ℃下攪拌30 min，調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH 值為7，以最佳加酶量（7 000 U·g-1）向反應(yīng)體系中加入中性蛋白酶，在反應(yīng)過(guò)程中向反應(yīng)體系滴加濃度為0.5 mol·L-1的NaOH溶液，保證反應(yīng)體系始終維持在pH=7。反應(yīng)達(dá)到最佳酶解時(shí)間（60 min）后，在100 ℃條件下水浴反應(yīng)10 min滅酶活。待酶解液冷卻至室溫后，在10 000 r·min-1條件下離心10 min，冷凍干燥上清液，即得到酶水解制備的大豆降糖肽（Soybean Protease Hydrolysate，SPH），將凍干樣品密封于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 超聲波-微波預(yù)處理輔助酶水解制備大豆降糖肽工藝的優(yōu)化

（1）最佳超聲波功率的確定。配制3%的SPI溶液，置于超聲波微波化學(xué)反應(yīng)器中，設(shè)置微波功率500 W、超聲波-微波預(yù)處理溫度40 ℃、超聲波-微波預(yù)處理時(shí)間10 min，分別在100 W、200 W、300 W、400 W 和500 W 的超聲波功率下對(duì)SPI 溶液進(jìn)行預(yù)處理。物理改性結(jié)束后，參照1.2.3 的方法進(jìn)行大豆分離蛋白的酶解改性，記錄NaOH 消耗的體積，計(jì)算水解度。待酶解液冷卻至室溫后，在10 000 r·min-1條件下離心10 min，冷凍干燥上清液，得到超聲波-微波預(yù)處理輔助酶水解制備的大豆降糖肽（Ultrasonic Microwave Pretreatment Soybean Protease Hydrolysate，UM-SPH）。將凍干的樣品溶解成一定濃度的溶液，測(cè)定α-葡萄糖苷酶抑制活性，以α-葡萄糖苷酶抑制率為評(píng)價(jià)指標(biāo)篩選最佳超聲波功率。

（2）最佳微波功率的確定。配制3%的SPI 溶液，置于超聲微波化學(xué)反應(yīng)器中，設(shè)置最佳超聲波功率200 W、超聲波-微波預(yù)處理溫度40 ℃、超聲波-微波預(yù)處理時(shí)間10 min，分別在100 W、200 W、300 W、400 W、500 W、600 W 和700 W 的微波功率下對(duì)SPI溶液進(jìn)行預(yù)處理。物理改性結(jié)束后，參照1.2.4（1）的方法測(cè)定α-葡萄糖苷酶抑制活性，以α-葡萄糖苷酶抑制率為評(píng)價(jià)指標(biāo)篩選最佳微波功率。

（3）最佳超聲波-微波預(yù)處理溫度的確定。配制3%的SPI 溶液，置于超聲微波化學(xué)反應(yīng)器中，設(shè)置最佳超聲波功率（200 W）、最佳微波功率（400 W）、超聲波-微波預(yù)處理時(shí)間10 min，分別在35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃和55 ℃下對(duì)SPI 溶液進(jìn)行預(yù)處理。物理改性結(jié)束后，參照1.2.4（1）的方法測(cè)定α-葡萄糖苷酶抑制活性，以α-葡萄糖苷酶抑制率為評(píng)價(jià)指標(biāo)篩選最佳預(yù)處理溫度。

（4）最佳超聲波-微波預(yù)處理時(shí)間的確定。配制3%的SPI 溶液，置于超聲微波化學(xué)反應(yīng)器中，設(shè)置最佳超聲波功率（200 W）、最佳微波功率（400 W）、最佳超聲波-微波預(yù)處理溫度（45 ℃），分別對(duì)SPI溶液進(jìn)行0 min、5 min、10 min、15 min、20 min、25 min 和30 min 的預(yù)處理。物理改性結(jié)束后，參照1.2.4（1）的方法測(cè)定α-葡萄糖苷酶抑制活性，以α-葡萄糖苷酶抑制率為評(píng)價(jià)指標(biāo)篩選最佳預(yù)處理時(shí)間。

1.2.5 大豆分離蛋白及大豆降糖肽的穩(wěn)定性表征

（1）儲(chǔ)存穩(wěn)定性。將SPI、SPH 和UM-SPH 分別配制成30 mg·mL-1的樣品溶液，調(diào)節(jié)pH 值至7.0。在4 ℃下儲(chǔ)存28 d，每隔7 d 測(cè)量一次樣品溶液的α-葡萄糖苷酶抑制率。根據(jù)降血糖活性表征酶解改性和超聲波-微波預(yù)處理輔助酶解改性對(duì)大豆降糖肽儲(chǔ)存穩(wěn)定性的影響。

（2）熱穩(wěn)定性。將SPI、SPH 和UM-SPH 分別配制成30 mg·mL-1的樣品溶液，調(diào)節(jié)pH 值至7.0。分別在37 ℃、50 ℃、65 ℃、80 ℃和95 ℃下加熱15 min，測(cè)定樣品溶液的α-葡萄糖苷酶抑制率。根據(jù)降血糖活性表征酶解改性和超聲波-微波預(yù)處理輔助酶解改性對(duì)大豆降糖肽熱穩(wěn)定性的影響。

（3）凍融穩(wěn)定性。將SPI、SPH 和UM-SPH 分別配制成30 mg·mL-1的樣品溶液，調(diào)節(jié)pH 值至7.0。在-20 ℃的冰箱中儲(chǔ)存24 h，取出后置于37 ℃的水浴中解凍1 h，測(cè)定樣品溶液的α-葡萄糖苷酶抑制率。根據(jù)降血糖活性表征酶解改性和超聲波-微波預(yù)處理輔助酶解改性對(duì)大豆降糖肽凍融穩(wěn)定性的影響。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波-微波預(yù)處理輔助酶水解制備大豆降糖肽工藝的優(yōu)化

2.1.1 超聲波功率對(duì)大豆降糖肽α-葡萄糖苷酶抑制率的影響

由圖1 可知，隨著超聲波功率的增大，大豆降糖肽的α-葡萄糖苷酶抑制率和水解度先逐漸上升；在超聲波功率大于200 W 后，大豆降糖肽的α-葡萄糖苷酶抑制率和水解度均不斷下降。當(dāng)超聲功率達(dá)到200 W 時(shí)，大豆降糖肽的α-葡萄糖苷酶抑制率和水解度均達(dá)到最大值，分別為（77.62±0.45）%和（19.00±0.19）%。這可能是因?yàn)槌暡A(yù)處理引起的瞬態(tài)空化作用導(dǎo)致大豆分離蛋白的解折疊，增加了蛋白與酶的接觸面積，得到了降血糖活性較高的大豆降糖肽[11]。但當(dāng)超聲波功率超過(guò)200 W 后，功率過(guò)大產(chǎn)生的巨大剪切力會(huì)使蛋白質(zhì)分子加劇碰撞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子聚集，原本暴露出的酶切位點(diǎn)重新被掩埋，阻礙了酶解反應(yīng)的進(jìn)行，造成抑制α-葡萄糖苷酶活性的肽含量降低。因此，超聲波功率過(guò)高顯著降低了大豆降糖肽的α-葡萄糖苷酶抑制率和水解度（P＜0.05）。

圖1 不同超聲波功率下大豆降糖肽的α-葡萄糖苷酶抑制率和水解度圖

2.1.2 微波功率對(duì)大豆降糖肽α-葡萄糖苷酶抑制率的影響

由圖2 可知，隨著微波功率的增大，大豆降糖肽的α-葡萄糖苷酶抑制率和水解度均逐漸上升；在微波功率大于400 W 后，大豆降糖肽的α-葡萄糖苷酶抑制率和水解度均不斷降低。當(dāng)微波功率達(dá)到400 W 時(shí)，大豆降糖肽的α-葡萄糖苷酶抑制率和水解度均達(dá)到最大值，分別為（78.35±0.50）%和（19.30±0.21）%。微波處理促使大豆分離蛋白中的極性分子在電磁場(chǎng)中發(fā)生振動(dòng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)展開(kāi)，暴露出更多的酶切位點(diǎn)，促進(jìn)了蛋白發(fā)生水解反應(yīng)[8]。當(dāng)微波功率超過(guò)400 W 后，在較高的功率下，大豆分離蛋白溶液體系的溫度迅速上升，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性并且形成聚集體，阻礙酶解反應(yīng)發(fā)生。因此，微波功率過(guò)高使大豆降糖肽的α-葡萄糖苷酶抑制率和水解度顯著降低（P＜0.05）。

圖2 不同微波功率下大豆降糖肽的α-葡萄糖苷酶抑制率和水解度圖

2.1.3 預(yù)處理溫度對(duì)大豆降糖肽α-葡萄糖苷酶抑制率的影響

由圖3 可知，隨著超聲波-微波預(yù)處理溫度的升高，大豆降糖肽的α-葡萄糖苷酶抑制率和水解度均逐漸上升；在超聲波-微波預(yù)處理溫度大于45 ℃后，大豆降糖肽的α-葡萄糖苷酶抑制率和水解度均不斷下降。當(dāng)超聲波-微波預(yù)處理溫度達(dá)到45 ℃時(shí)，大豆降糖肽的α-葡萄糖苷酶抑制率和水解度均達(dá)到最大值，分別為（79.64±0.41）% 和（19.87±0.19）%。這是因?yàn)樵谝欢ǚ秶鷥?nèi)，溫度的升高有利于大豆分離蛋白的溶解能力和溶解速度的提高，導(dǎo)致蛋白質(zhì)在溶液內(nèi)分布更加均勻，從而促進(jìn)其與蛋白酶的結(jié)合效率，提高了抑制α-葡萄糖苷酶活性的肽含量[12]。于麗娜等[13]通過(guò)微波預(yù)處理輔助酶解的改性技術(shù)制備花生蛋白肽，也得出了微波預(yù)處理溫度的升高促使花生蛋白肽的α-葡萄糖苷酶抑制率先升高后降低的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖3 不同預(yù)處理溫度下大豆降糖肽的α-葡萄糖苷酶抑制率和水解度圖

2.1.4 預(yù)處理時(shí)間對(duì)大豆降糖肽α-葡萄糖苷酶抑制率的影響

由圖4 可知，隨著超聲波-微波預(yù)處理時(shí)間的增加，大豆降糖肽的α-葡萄糖苷酶抑制率和水解度均逐漸上升；當(dāng)超聲波-微波預(yù)處理時(shí)間超過(guò)20 min 后，大豆降糖肽的α-葡萄糖苷酶抑制率和水解度均不斷降低。當(dāng)超聲波-微波預(yù)處理時(shí)間為20 min 時(shí)，大豆降糖肽的α-葡萄糖苷酶抑制率和水解度均達(dá)到最大值，分別為（81.46±0.31）% 和（21.25±0.43）%。超聲波-微波預(yù)處理20 min 之前，大豆分離蛋白溶液處于微波電磁場(chǎng)中，超聲波的空化作用破壞蛋白質(zhì)的分子間作用力使其解折疊；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白的分子熱運(yùn)動(dòng)不斷加劇，到預(yù)處理時(shí)間20 min 時(shí)，大豆分離蛋白在體系中的溶解性最佳，且酶切位點(diǎn)暴露最完全，酶解反應(yīng)效率最高，抑制α-葡萄糖苷酶活性的肽含量最高[14]。超聲波-微波預(yù)處理20 min 之后，由于處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，超聲波和微波的不斷作用導(dǎo)致分子熱運(yùn)動(dòng)過(guò)于劇烈，會(huì)促進(jìn)解折疊的蛋白質(zhì)重組聚集，造成蛋白質(zhì)表面的酶切位點(diǎn)被掩埋，影響酶與蛋白質(zhì)的結(jié)合[15]。江明珠[16]對(duì)大豆分離蛋白進(jìn)行超聲波預(yù)處理，在研究超聲波預(yù)處理時(shí)間對(duì)大豆蛋白肽的影響時(shí)，也得出了α-葡萄糖苷酶抑制率先升高后降低的結(jié)論。

圖4 不同預(yù)處理時(shí)間下大豆降糖肽的α-葡萄糖苷酶抑制率和水解度圖

綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定超聲波-微波預(yù)處理輔助酶水解制備大豆降糖肽的最優(yōu)工藝為超聲波功率200 W，微波功率400 W，超聲波-微波預(yù)處理溫度45 ℃，超聲波-微波預(yù)處理時(shí)間20 min，加酶量7 000 U·g-1，底物濃度3%，酶解時(shí)間60 min。

2.2 大豆分離蛋白及大豆降糖肽的穩(wěn)定性

2.2.1 儲(chǔ)存穩(wěn)定性分析

儲(chǔ)存穩(wěn)定性是衡量蛋白質(zhì)產(chǎn)品包裝工藝、保質(zhì)期和應(yīng)用價(jià)值的重要指標(biāo)。由圖5 可知，隨著儲(chǔ)存天數(shù)的增加，SPI的α-葡萄糖苷酶抑制率逐漸降低；在28 d時(shí)，降糖活性?xún)H為（15.61±0.72）%。在7 d 之內(nèi)，SPH 和UM-SPH 的降糖活性無(wú)顯著變化（P＞0.05）；在14 d到21 d，SPH 和UM-SPH 的降糖活性幾乎保持不變；到第28 d 時(shí)，UM-SPH 仍能保持（76.14±0.73）%的α-葡萄糖苷酶抑制率，表現(xiàn)出良好的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。

圖5 大豆分離蛋白及大豆降糖肽的儲(chǔ)存穩(wěn)定性圖

2.2.2 熱穩(wěn)定性分析

溫度對(duì)SPI、SPH 和UM-SPH 的降糖活性和抗氧化活性的影響如圖6 所示。當(dāng)溫度為37～95 ℃時(shí)，SPI、SPH 和UM-SPH 的α-葡萄糖苷酶抑制率變化較小；與SPI 和SPH 相比，UM-SPH 始終保持最強(qiáng)的降血糖活性，表現(xiàn)出最佳的熱穩(wěn)定性。綜上所述，超聲波-微波輔助酶解改性改善了大豆分離蛋白的熱穩(wěn)定性，SPH 和UM-SPH 表現(xiàn)出了良好的熱穩(wěn)定性，可實(shí)現(xiàn)37～95 ℃的熱加工，為投入工業(yè)生產(chǎn)提供了理論基礎(chǔ)[17]。

圖6 大豆分離蛋白及大豆降糖肽的熱穩(wěn)定圖

2.2.3 凍融穩(wěn)定性分析

目前，冷凍是一種常見(jiàn)的延長(zhǎng)食品貨架期的處理方法，不僅能保持食品的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，還能最大限度地減少微生物繁殖對(duì)食品的影響[18]。因此，考察大豆分離蛋白和大豆降糖肽的凍融穩(wěn)定性具有一定的實(shí)際意義。由圖7 可知，凍融使SPI、SPH 和UM-SPH的α-葡萄糖苷酶抑制率均顯著降低（P＜0.05）。經(jīng)歷3 次凍融處理，UM-SPH 的α-葡萄糖苷酶抑制率無(wú)顯著變化（P＞0.05）；第4 次凍融后，UM-SPH的降糖活性顯著降低（P＜0.05），但仍能達(dá)到（77.66±0.80）%的α-葡萄糖苷酶抑制率。與SPI 和SPH 相比，UM-SPH 降糖活性的凍融穩(wěn)定性最佳。

圖7 豆分離蛋白及大豆降糖肽的凍融穩(wěn)定性圖

3 結(jié)論

在酶解改性的基礎(chǔ)上，采用超聲波-微波輔助酶水解制備大豆降糖肽，獲得的最佳工藝條件為超聲波功率200 W、微波功率400 W、超聲波-微波預(yù)處理溫度45 ℃、超聲波-微波預(yù)處理時(shí)間20 min、加酶量7 000 U·g-1、底物濃度3%、酶解時(shí)間60 min，在此條件下大豆降糖肽的α-葡萄糖苷酶抑制率為（81.46±0.31）%。本實(shí)驗(yàn)制備的大豆降糖肽（SPH和UM-SPH），隨著儲(chǔ)存天數(shù)的增加和溫度升高，表現(xiàn)出良好的儲(chǔ)存穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性；與SPI和SPH相比，UM-SPH 的降血糖活性受凍融次數(shù)的影響最小，表現(xiàn)出最佳的凍融穩(wěn)定性。酶解改性和超聲波-微波預(yù)處理輔助酶解改性提高了大豆分離蛋白的環(huán)境穩(wěn)定性，3 種物質(zhì)的穩(wěn)定性順序?yàn)閁M-SPH ＞SPH ＞SPI。