竹醋液和竹焦油對洋蔥根尖的細胞毒性

關(guān)鍵詞：竹醋液；竹焦油；洋蔥；染色體畸變；彗星實驗

中圖分類號：TK6；X173 文獻標志碼：A 文章編號：1672-2043（2024）12-2867-09 doi：10.11654/jaes.2024-0619

隨著全球化石能源消耗的激增及大眾對環(huán)境意識的提高，尤其在我國“雙碳”目標和可持續(xù)發(fā)展理念背景下[1]，人們對綠色、低碳和可再生能源需求廣泛關(guān)注[2-3]。生物質(zhì)材料作為唯一的可再生的含碳資源，因其具備分布廣泛且廉價易得等特點具有極大的發(fā)展?jié)摿褪袌銮熬癧4]，如何高效地利用生物質(zhì)材料[5]，生物質(zhì)廢棄物的無害化[6]、資源化及高值高質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)展?jié)摿薮?，市場前景廣闊，是近年來能源和資源領(lǐng)域重要的研究熱點之一[7-8]。同時，生物質(zhì)材料過度使用及廢棄物、副產(chǎn)物不當處理會對生態(tài)系統(tǒng)造成嚴重威脅，故建立生物質(zhì)副產(chǎn)物及其循環(huán)利用產(chǎn)品的安全性評價方法對環(huán)境安全和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)至關(guān)重要[2]。植物作為生態(tài)系統(tǒng)重要的組成部分，外源物對植物的毒性研究是環(huán)境污染、生態(tài)安全的重要評價指標之一。

洋蔥（Allium cepa L.）擁有生長周期短、發(fā)芽及生根速度快等優(yōu)點，其根尖分生區(qū)細胞便于采集，且細胞核較大，便于觀察，是國內(nèi)外常用的毒力學試驗材料之一[9-10]，通過考察洋蔥根系的伸長量、細胞相對活力、有絲分裂指數(shù)，來判斷處理組的細胞毒性；通過染色體畸變率、微核率、DNA損傷程度來判斷處理組的遺傳毒性[11-12]，這些實驗被證明在植物毒理研究領(lǐng)域具有有效性，先后在煙草、蠶豆、玉米、小麥等植物中取得了成功，驗證了其在植物環(huán)境監(jiān)測、污染治理和生態(tài)評估等領(lǐng)域的作用[13-15]。

竹材是重要的可再生資源之一，具有來源廣、生長周期短、低成本等眾多優(yōu)點，可作為資源開發(fā)理想的候選材料[16-17]，竹炭是竹產(chǎn)業(yè)重要的一個分支，竹醋液（Bamboo Vinegar，BV）和竹焦油（Bamboo Tar，BT）是竹炭產(chǎn)業(yè)中的重要副產(chǎn)物，在竹材高溫熱解生產(chǎn)竹炭過程中煙氣冷凝物的上清液統(tǒng)稱為BV，下沉油性物質(zhì)統(tǒng)稱為BT[18]。BV 和BT 成分組成復雜，BV由酸類、酚類、酮類、醛類、醇類及雜環(huán)類200多種有機成分和80%以上水組成，而BT的主要成分為酚類、醇類、雜環(huán)類等物質(zhì)。目前BT和BV資源化利用已有了大量的報道，BV已應用于農(nóng)業(yè)[19]、食品[20]、醫(yī)藥、保健、化工和環(huán)境衛(wèi)生[21]等各大領(lǐng)域，僅我國的BV相關(guān)產(chǎn)品就多達50多種，包括多種需要接觸人或動物口鼻以及皮膚的產(chǎn)品，BT在材料學上主要被應用于制備耐高溫粘黏劑或樹脂[22-23]，在農(nóng)業(yè)上被廣泛應用于植物病蟲害的防治[24]。

國內(nèi)外目前對BV和BT的植物毒理性研究較少，在環(huán)境排放和實際使用過程中對植物的潛在危害沒有明確的數(shù)據(jù)說明，導致其應用大部分停留在研究階段，產(chǎn)品也由于缺乏劑量安全性和標準化指標不能進行規(guī)?；茝V。為了明確上述兩種試劑對植物的毒性，本研究以洋蔥作為供試植物，以BV和BT作為外源添加物，驗證二者對洋蔥根系細胞的毒性及遺傳毒性，研究結(jié)果可以為BV和BT產(chǎn)品開發(fā)和污染監(jiān)控安全劑量提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料及方法

1.1 試驗材料

1.1.1 BV和BT材料

BV、BT 由福建省建甌市恒順炭業(yè)有限公司提供，竹材為在隔絕空氣下加熱，熱解溫度450 ℃、升溫速率為10 ℃·min^-1下制得。收集到的冷凝物在沉淀和過濾后，室溫放置6 個月后使用，上層澄清液為BV，下層油狀液為BT。

采用GC-MS 儀（Agilent 7890B-7000D）對BV 和BT 進行組分分析[25-26]。GC 條件：色譜柱為HP-VOC（60 m×200 μm×1.1 μm），載氣為氦氣，分流比10∶1，進樣量1 μL。MS 條件：EI 源，電子能量70 eV，掃描質(zhì)量范圍（m/z）為10～500。有機物成分見表1。

1.1.2 受試植物

本試驗使用洋蔥均為2022年山東金鄉(xiāng)收獲的隔年扁洋蔥，購于福建福州華威西營里農(nóng)產(chǎn)品交易中心。

1.1.3 供試藥劑制備和藥液的配制

BT用無水乙醇溶解，定容為100 mg·mL^-1BT乙醇溶液，移取100 mL BT 乙醇溶液于燒杯中，加入200mL 蒸餾水以及10 滴吐溫-80，定容至500 mL。在90 ℃水浴條件下加熱，使乙醇揮發(fā)并用蒸餾水定容，配成濃度為0.2%的BT乳化液母液，置于4 ℃冰箱中冷藏保存，供抑制洋蔥發(fā)根試驗用。

BV水劑均由BV和蒸餾水按一定比例配制而成。

1.2 材料的培養(yǎng)及取樣

選擇等質(zhì)量（200.00～210.00 g）洋蔥鱗莖，去除表面干枯的鱗片葉，干根削至與鱗片葉基部平齊，置于燒杯中用蒸餾水浸泡，在（20±2）℃的黑暗條件下，發(fā)根72 h，每24 h換水，篩除無法發(fā)根的洋蔥，選取根須密度、根長均勻一致的洋蔥作為后續(xù)處理材料。

每個實驗組由3個鱗莖組成（3組重復），根系浸沒在對應溶液中，共處理72 h，處理過程試驗條件為：溫度（20±2）℃，相對濕度65%，光周期（L/D）12 h/12h。每24 h更換溶液并取樣。

根伸長量采用Image-Pro Plus 6.0軟件拍照測量平均根長。細胞活力每個鱗莖隨機取3條根尖為樣本測定吸光度。有絲分裂指數(shù)、染色體畸變率和微核率均每個鱗莖隨機取5條根尖為樣本制片，每片至少觀察1 000個細胞，記錄數(shù)據(jù)。彗星實驗每個鱗莖取3條根尖為樣本制片，每片觀察50個不重疊的細胞。

1.3 試驗方法與步驟

1.3.1 根生長半抑制濃度

BV 和BT 參照已有文獻報道抑菌濃度（EC₅₀）為標準，各設置6個濃度梯度，以蒸餾水作為對照（CK）。5個鱗莖為一組，BV 0.000 1%、0.001%、0.01%、0.1%、1% 和10%（V/V），BT 0.005%、0.002%、0.01%、0.02%、0.05%和0.1%（m/V），每個實驗處理重復3次，共39個處理，各實驗處理隨機擺放。處理72 h后，觀察洋蔥的生長情況，選取3個長勢一致的鱗莖進行測量，計算根生長抑制率，根生長半抑制濃度（IC₅₀）采用GraphPad Prism 9 軟件進行擬合計算。

根生長抑制率=（[ ΔΑ0－ΔΑt）/ΔΑ0]×100%[27]式中：ΔΑ0代表CK處理后72 h根伸長總量（mm，72 h后的根長-0 h的根長）；ΔΑt代表BT和BV處理后72h 根伸長總量（mm，72 h后的根長-0 h的根長）。

1.3.2 細胞活力測定

采用伊文斯藍染色法[28]測定細胞活力，以0.25%的伊文斯蘭染液室溫浸染48 h，用蒸餾水漂洗3 次后，將根尖放入1% SDS水溶液中萃取24 h，使用UV-1100型紫外分光光度計在600 nm下測定上清液吸光度。以沸水煮15 min殺死細胞后被伊文思藍染色的根尖為對照。

細胞相對活性=（1-a/ad）×100%，計算細胞相對活性，其中a 為處理后的根尖染色提取液吸光度，ad為沸水煮死的根尖染色提取液吸光度。

1.3.3 有絲分裂活性與染色體畸變率、微核率

采用染色體制片法進行實驗[9]。樣本用卡諾氏固定液固定24 h后，蒸餾水沖洗干凈，用1 mol·L^-1鹽酸60 ℃下水浴解離10 min。醋酸洋紅染液染色8min，鑷子輕壓蓋玻片使其分散。使用S-LED W1光學顯微鏡觀察、統(tǒng)計，計算有絲分裂指數(shù)，觀察染色體畸變現(xiàn)象，計算微核率。

有絲分裂指數(shù)=（分裂期細胞數(shù)/觀察到的細胞總數(shù)）×100%。

染色體畸變率=（染色體畸變細胞數(shù)/分裂細胞數(shù)）×100%

微核=觀察到的微核數(shù)/觀察的細胞數(shù)×1 000‰

1.3.4 DNA受損程度

DNA受損程度采用植物彗星實驗（單細胞凝膠電泳）[28-30]法。使用機械分離法分離細胞核，靜置后從底部吸取50 μL細胞懸液。將100 mL由1×PBS配制的1%正常熔點瓊脂糖（NMPA）滴加到單面磨砂載玻片上，凝固后，取50 μL 細胞核懸液和40 ℃ 1%低熔點瓊脂糖（LMPA）50 μL 混合均勻，滴加到第一層凝膠上，再將100 μL 0.5% LMPA滴加到載玻片上，加蓋蓋玻片待其凝固后取下蓋玻片。片上滴加200 μL的細胞裂解液（強），4 °C下裂解45 min后，洗凈，加入預冷的堿性電泳液（EDTA-Na2，300 mmol·L^-1，NaOH，pHgt;13），4 ℃解旋15 min。采用DYY-2C型電泳儀及DYCP-31DN 電泳槽電泳30 min。電泳后，用400mmol·L^-1 的Tris-HCl 中和15 min，后滴加溴化乙錠（20 μg·L^-1）染色10 min。使用Leica DMi8 倒置熒光顯微鏡在激發(fā)光546 nm/10 nm，濾光片590 nm 的條件下用熒光顯微鏡觀察。拍照獲取彗星圖像，統(tǒng)計樣品彗星尾部的DNA含量（%）與彗尾尾距（μm）。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

計算樣品各指標的平均值±標準差（SD），用SPSS 27 進行數(shù)據(jù)分析，Origin 2023 軟件制圖，使用ImageJ中的插件Openmet分析彗星圖像，采用LSD法進行差異性檢驗，Plt;0.05表示差異性顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 半抑制濃度

從圖1 中可以看出，與CK 相比，除0.001% 濃度的BV和0.005% 的BT溶液外，其他濃度的溶液均抑制了根系的生長。10% BV濃度下，洋蔥根尖停止生長，且根部出現(xiàn)細軟狀態(tài)。在1% 濃度下，洋蔥根尖會緩慢生長，但仍會發(fā)軟，根數(shù)目增加較少。0.2% BT溶液處理下的洋蔥根尖幾乎不生長，且與BT溶液接觸的洋蔥鱗片出現(xiàn)發(fā)霉。當BT溶液濃度在0.1%時，處理時間24 h后根尖顏色加深，仍可以繼續(xù)生長，但根系數(shù)目增加較少，增長速度變慢，最大值只有41.3mm，同樣處理時間下，CK的根長已經(jīng)達到了最大值87.3 mm。在10% 的BV 溶液、0.2% 的BT 溶液中，洋蔥無法生長。通過GraphPad Prism 9 軟件回歸計算BV 和BT 溶液對洋蔥根生長IC₅₀ 分別為0.01% 和0.02%，為了誘導洋蔥出現(xiàn)明顯的毒害現(xiàn)象，故以CK及0.01%、0.1%、1% BV，0.02%、0.05%、0.1% BT 共6組濃度水平作為后續(xù)處理。

2.2 細胞相對活力

根尖細胞活力結(jié)果如圖2所示，隨著處理時間的增加，CK 組的根尖細胞活力一直保持在80.22%～82.84%，無顯著下降趨勢，不同濃度BV和BT處理下，細胞活力均呈現(xiàn)明顯下降的趨勢。其中，從24 h 到48 h，0.1% BV 、1% BV的細胞活力顯著下降。從48 h到72 h，1% BV的細胞活力明顯下降，處理的下降程度差異不顯著。

處理72 h后，BV和BT各濃度處理后的洋蔥根尖細胞活力相比CK 組均顯著下降，隨著BV 處理濃度的增加，細胞活力呈現(xiàn)明顯的下降趨勢。0.1% BV與1% BV 對洋蔥根尖細胞活力的抑制作用顯著大于0.01% BV，0.1% BV與1% BV兩組間差異不顯著；BT組中，在處理72 h后，0.1% BT 對洋蔥細胞活力的抑制作用顯著大于0.02% BT，但0.05% BT 與0.1% BT組間差異不顯著。

2.3 有絲分裂指數(shù)

如圖3所示，隨處理時間的增加，除CK組外，各處理的有絲分裂活性均顯著下降，在處理24 h 時，0.1% BT 的有絲分裂指數(shù)相較CK 差異顯著，其他處理組濃度升高，有絲分裂指數(shù)降低但差異不顯著。其中，從24 h到48 h，1% BV的有絲分裂指數(shù)顯著下降。從48 h到72 h，處理組的下降程度均無顯著差異。

處理72 h后，BV處理后的有絲分裂指數(shù)相比CK組均顯著下降，但組間差異不顯著。1% BV的有絲分裂指數(shù)僅為1.36%，相較CK 下降了3.52 個百分點。1% BV 對洋蔥有絲分裂指數(shù)的抑制作用顯著大于0.01% BV。BT組中，0.02% BT組的有絲分裂指數(shù)為2.01%，0.05% BT 組的有絲分裂指數(shù)為1.16%，0.1%BT組的有絲分裂指數(shù)僅為1.07%，相較CK，按比例下降了78.04%。BT處理隨濃度增大，洋蔥根尖有絲分裂活性下降，但不同濃度的處理差異不顯著。

2.4 染色體畸變率與微核率

從圖4中可以明顯看出通過BV 和BT 處理后的洋蔥根尖，染色出現(xiàn)了明顯的畸變，通過染色后可以在顯微鏡下明顯觀察到染色體出現(xiàn)了分配不均、體橋黏連、斷片和微核等損傷形態(tài)，為了進一步明確不同處理對根尖染色體的損傷情況，對染色體畸變率和微核率進行了統(tǒng)計分析。

染色體畸變率和微核率結(jié)果見表2，可見隨著處理時間的增加，微核率的總體表現(xiàn)為上升。0.1% BT處理24 h 后微核率為0.98‰，72 h 后上升到了5.47‰，和處理組差異顯著，除0.1% BT處理外，其他處理差異均不顯著。各處理的染色體畸變率隨處理時間的增加也呈現(xiàn)總體上升，處理時間對染色體畸變率的影響無顯著差異，72 h后，除了0.1% BT與0.05%BT 外，其余處理組的染色體畸變率與CK 均無顯著差異。

2.5 DNA損傷

由圖5可知，隨著處理時間的增加，洋蔥根尖細胞DNA的受損程度總體表現(xiàn)為上升。但只有較高濃度的組，1% BV、0.1% BT與0.05% BT的彗尾DNA含量隨著處理時間的增加顯著上升。DNA受損傷水平隨著各處理濃度的增加而增加，但是只有較高濃度的組，1% BV、0.1% BT與0.05% BT的彗尾DNA含量相對CK顯著上升。其中1% BV的彗尾DNA含量在處理72 h 后達到了10.57%，0.05% BT 與0.1% BT 分別達到了20.90%和44.68%，其余組的彗尾DNA含量百分比均較低。

由圖6可知，在電泳中破損DNA遷移的距離隨著各處理濃度的增加而增加，但是只有0.1% BT 與0.05% BT 的彗尾尾距較CK 顯著上升。從時間上來看，隨著處理時間的增加，洋蔥根尖細胞的DNA受損程度的總體表現(xiàn)為上升。但只有0.1% BT 與0.05%BT的彗尾尾距隨著處理時間的增加顯著上升，其余組差異不顯著。

3 討論

由于洋蔥對化學污染物的極端敏感性、較短的細胞周期和較大的染色體，被廣泛用于評估細胞毒性和基因毒性，洋蔥生物測定法在評估廢水毒性方面的應用逐漸受到科學界的關(guān)注，因為它具有低成本、快速獲得結(jié)果且不需要復雜實驗室設施的優(yōu)點，相比其他生物測定法更具優(yōu)勢[9]。本研究中，BV 濃度大于0.01%，BT 濃度大于0.02% 時，洋蔥根尖的細胞活力被顯著抑制，洋蔥根尖的有絲分裂受到明顯影響，在洋蔥形態(tài)學上也呈現(xiàn)出了根生長變緩，在高濃度BT處理組中甚至根系呈現(xiàn)出停止生長，根系變軟、變褐及腐爛等急性中毒癥狀。低濃度的BV中的酚類、酮類、酯類、醛類等有機物及部分微量元素能夠為土壤微生物及植物提供養(yǎng)分，進而促進土壤微生物生長，隨著BV中酸類、酚類及酮類等有機物濃度的提高會破壞細菌細胞結(jié)構(gòu)、影響細胞代謝、抑制其蛋白質(zhì)合成[30]，使得細菌細胞膜通透性增大、流動性降低及半透性喪失，從而引起細胞內(nèi)K⁺、Na⁺等電解質(zhì)大量外泄，以及蛋白質(zhì)和可溶性糖等物質(zhì)大量滲出[31-32]。BT 作為BV 的同源產(chǎn)物，除了同類化學組分濃度遠高于BV 外，還含有大量的胺類[33]、雜環(huán)類物質(zhì)[34]等對環(huán)境毒性較高的組分，其中4-甲氧基-2-硝基苯胺，其相對比例占到了10.69%，以二硝基苯胺為主要成分的氟樂靈會在低濃度下延緩作物出苗，而高濃度則完全阻止作物出苗，對水生生物和無脊椎動物存在高毒性[35]。

在高濃度的BV和BT處理組中均觀察到了染色體體橋、斷片及黏連等畸變形態(tài)，也是由于BV和BT中有機酸[36]降低細胞內(nèi)pH 值以及與細胞膜上的一些成分如脂多糖結(jié)合，破壞了細胞膜的穩(wěn)定性，另外解離出的ROO^-具有抑制DNA 復制、蛋白質(zhì)合成及破壞細菌細胞膜的功能，乙酸會使得細菌細胞內(nèi)部酸化，導致細菌內(nèi)部成分變性或流失，同時抑制某些關(guān)鍵蛋白質(zhì)的合成；酚類[37]物質(zhì)會引起細胞壁、細胞膜和細胞器的物理化學性質(zhì)的變化，導致細胞損傷，代謝受到抑制，酮類、呋喃類、醛類等可抑制細胞蛋白質(zhì)合成、影響細胞代謝[38]。

在重金屬和工業(yè)廢水對洋蔥根尖的毒性研究中顯示洋蔥根尖具有明顯的濃度依賴毒性，根部生長抑制和有絲分裂指數(shù)的下降與污染物的劑量相關(guān)[9]。染色體畸變研究結(jié)果顯示，存在滯后染色體、粘附染色體、流浪染色體、染色體丟失、c-有絲分裂、染色體橋、異常中期和干擾的后期，這些結(jié)果都呈劑量相關(guān)性[39]，本研究結(jié)果和文獻報道呈現(xiàn)出一致性，可以為植物毒性研究中評估物質(zhì)作用機制及其對遺傳物質(zhì)影響提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

4 結(jié)論

（1）竹醋液、竹焦油對洋蔥根尖的生長存在“低促高抑”的現(xiàn)象。竹醋液濃度低于0.000 1%、竹焦油濃度低于0.005%時促進洋蔥根系生長，竹醋液和竹焦油的半抑制濃度分別為0.01%（V/V）和0.02%（m/V）。

（2）低濃度的竹醋液處理洋蔥，不會產(chǎn)生細胞毒性和遺傳毒性。而長時間高濃度的竹醋液處理會對洋蔥產(chǎn)生低度細胞毒性和遺傳毒性。

（3）不同濃度的竹焦油均會對洋蔥根尖產(chǎn)生中度遺傳毒性，且0.1% 的竹焦油處理72 h 可導致重度DNA損傷。竹焦油對洋蔥根尖細胞毒性及遺傳毒性明顯高于竹醋液。