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    土霉素降解菌的篩選及降解特性

    2024-01-17 00:00:00李妍慧吳洪生陸東明劉政段亞軍丁軍馮迎辰李貞偉程誠石陶然顧曉明
    關(guān)鍵詞:土霉素

    關(guān)鍵詞:土霉素;降解菌;DNA測序鑒定;降解特性;降解途徑

    中圖分類號(hào):X172 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):1672-2043(2024)12-2991-13 doi:10.11654/jaes.2023-1085

    土霉素(Oxytetracycline,OTC)是由鏈霉菌產(chǎn)生的一類含有4個(gè)芳香環(huán)的并四苯為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的廣譜抗生素,是四環(huán)素類抗生素(Tetracycline antibiotics,TCs)之一,能阻止細(xì)菌核糖體酰氨-tRNA同核蛋白結(jié)合,抑制蛋白肽鏈的延長[1-2],以及抑制革蘭氏陽性和陰性菌、支原體、衣原體、立克次氏體及濾過性病毒等微生物的生長繁殖[3]。土霉素具有廣譜抗菌性以及價(jià)格低廉的特點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)療和養(yǎng)殖業(yè)等眾多領(lǐng)域[4-6]。土霉素不僅能夠保障人類的生命健康,用于動(dòng)植物疾病的治療和預(yù)防,還可以亞治療劑量添加于動(dòng)物飼料,起到刺激動(dòng)物生長和促進(jìn)增產(chǎn)的作用[7],使其逐漸成為生產(chǎn)生活不可或缺的組成部分。然而,隨之而來的是抗生素的過量使用與違規(guī)濫用。據(jù)統(tǒng)計(jì)我國每年有超過8 000 t抗生素被用作飼料添加劑[8]。

    抗生素經(jīng)過人和動(dòng)物腸道時(shí)并不能被完全吸收,有60%~90%會(huì)以原形或代謝產(chǎn)物的形式由糞便和尿液排出體外[9],導(dǎo)致有相當(dāng)數(shù)量的活性成分進(jìn)入自然環(huán)境中[10-11]并發(fā)生降解反應(yīng),但其很難完全降解生成二氧化碳和水,而是產(chǎn)生一系列毒性更大的代謝及降解中間產(chǎn)物[12]。這些產(chǎn)物能夠顯著抑制和影響植物的生長和發(fā)育[13],抑制光合作用[14];抑制水生動(dòng)物體內(nèi)多種酶的活性,造成魚類DNA損傷從而產(chǎn)生基因和免疫毒性[3];殺死有益的微生物,誘導(dǎo)微生物逐漸對(duì)其產(chǎn)生抵抗性,影響微生物正常生長或繁殖,造成抗藥性菌群的富集及抗性基因(Antibiotic resistancegenes,ARGs)的產(chǎn)生[15-17]。其進(jìn)入食物鏈后對(duì)人類健康也會(huì)形成潛在威脅。

    環(huán)境中抗生素的殘留已經(jīng)嚴(yán)重危害到動(dòng)植物和人類的正常生活和發(fā)展,目前對(duì)環(huán)境抗生素處理的方法大致分為物理化學(xué)法和生物降解法,其中生物降解法投資費(fèi)用低、綠色環(huán)保、無二次污染,可以用于大面積治理,是治理環(huán)境污染的有效手段[18-19]。目前已從環(huán)境中篩選出的能夠降解環(huán)境中抗生素的細(xì)菌包括產(chǎn)堿桿菌屬、氨氧化細(xì)菌、蒼白桿菌屬、葡萄球菌屬、芽孢桿菌屬和假單胞菌屬等眾多菌屬[20-21]。Shao等[22]的研究表明,菌株KSS10在120h時(shí)對(duì)土霉素的降解率為78.78%,平均去除率為0.145 mg·L?1·h?1。Migliore等[23]的研究結(jié)果顯示,真菌Pleurotus ostreatus SMR684能夠在14d內(nèi)完全降解100μg·mL?1 的土霉素。然而,目前利用具有強(qiáng)耐藥性的菌株降解抗生素的研究實(shí)例不多,且大多是單菌降解抗生素。高效降解菌的篩選和多菌聯(lián)合降解對(duì)于進(jìn)一步處理環(huán)境中抗生素殘留問題具有重大意義。因此,本研究選取獸藥中常用的土霉素為代表,篩選出兩株土霉素高效降解菌株,對(duì)其進(jìn)行形態(tài)觀察、生理生化分析及基因測序分析,考察其最佳降解環(huán)境條件及聯(lián)合降解效果,為降解畜禽糞便和有機(jī)肥殘留抗生素提供理論和技術(shù)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    試驗(yàn)所用菌株的來源為本實(shí)驗(yàn)室4 ℃冷藏保存的從蘇州某廢棄農(nóng)藥廠土壤和地下水樣品中純化分離的菌株制成的試管斜面。土霉素標(biāo)準(zhǔn)品(C22H24N2O9,純度99.0%)購自南京草本源生物科技有限公司。色譜級(jí)甲醇、乙腈、甲酸均購自南京晚晴化玻儀器有限公司。試驗(yàn)用水均由艾肯水精靈公司制造的RO超純水機(jī)制備。

    1.2 培養(yǎng)基的配制

    無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基(MSM):0.01 g 無水氯化鈣,1.5 g 三水合磷酸氫二鉀,3g磷酸二氫鉀,0.1 g 硫酸鎂,0.01 g亞乙基二氮基四乙酸,2 g 硝酸鉀,1000 mL超純水,根據(jù)其酸堿性用0.1 mol·L-1的氫氧化鈉溶液或鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至7.0。

    LB培養(yǎng)基:10 g胰化蛋白胨,5 g酵母提取物,10g 氯化鈉,1000 mL超純水,根據(jù)其酸堿性用0.1 mol·L-1的氫氧化鈉溶液或鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至7.0。

    高氏合成一號(hào)培養(yǎng)基:20 g可溶性淀粉,1 g硝酸鉀,0.5 g三水合磷酸氫二鉀,0.05 g氯化鈉,0.5 g七水合硫酸鎂,0.01 g七水合硫酸亞鐵,1 000 mL超純水,根據(jù)其酸堿性用0.1 mol·L-1的氫氧化鈉溶液或鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH為7.2~7.4。

    固體培養(yǎng)基按1.5%~2.0%(V/m)的比例添加瓊脂。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1菌株的活化培養(yǎng)

    將實(shí)驗(yàn)室保存的菌株試管斜面根據(jù)菌株種類不同,分別選取不同的固體培養(yǎng)基,用平板劃線法在無菌條件下劃線活化,然后置于恒溫培養(yǎng)箱中30 ℃倒置培養(yǎng)48 h,觀察平板上菌落形態(tài)和鏡檢菌體形態(tài)是否一致,如不一致則重新劃線分離純化。最后將得到的菌株斜面保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3.2 菌株的篩選及鑒定

    挑取純化的菌種接種到加入50 mg·L-1 土霉素的固體平板培養(yǎng)基上,30 ℃培養(yǎng)48 h后挑選能夠長出菌落的菌株,按照3% 的接種量接種于含有50mg·L-1土霉素且以其為唯一碳源的無機(jī)鹽液體搖瓶中進(jìn)行復(fù)篩,72 h后取出5 mL 發(fā)酵液,9 500 r·min-1離心15 min,取上清液進(jìn)行真空冷凍干燥。干燥結(jié)束后,用5 mL 甲醇-乙腈(1∶1,V/V)溶解干燥樣品,然后取1 mL經(jīng)0.22 μm有機(jī)微孔濾膜過濾后裝入棕色色譜瓶待測。

    將篩選出的降解能力強(qiáng)的菌株,送測序公司(安徽通用生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行DNA提取和測序,根據(jù)16S rDNA測序結(jié)果,在NCBI網(wǎng)站Gen Bank數(shù)據(jù)庫在線進(jìn)行98%同源性比對(duì),確定菌種名稱,用MEGA8構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。同時(shí)進(jìn)行菌落形態(tài)和細(xì)菌形態(tài)的觀察,以及菌株的生理生化試驗(yàn)。

    1.3.3生長曲線

    將降解菌按3% 接種量接種在含有50 mg·L-1土霉素的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中,30 ℃、130 r·min-1的條件下?lián)u床培養(yǎng),每個(gè)處理3次重復(fù),分別在第0、2、8、16、24、32、40、48、56、64、72、80 小時(shí)采樣,用紫外分光光度計(jì)在600 nm的波長下測定菌液的OD值,由此確定菌株的生長曲線。

    1.3.4 制備菌懸液

    在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)純化后的單菌落,于30 ℃、130 r·min?1恒溫振蕩條件下培養(yǎng)至渾濁,隨后在室溫條件下于4000 r·min?1離心10 min,保留濕菌體。用無菌生理鹽水(0.9%的NaCl溶液)對(duì)菌體進(jìn)行重懸,最后用生理鹽水配制成OD600=1.0的菌懸液。

    1.3.5 環(huán)境條件對(duì)菌株降解土霉素的影響

    將篩選出的降解能力強(qiáng)的兩株菌株按照體積比1∶0、2∶1、1∶1、1∶2、0∶1混合,接種量為1%、2%、3%、4%、5%,土霉素濃度為35、50、65、80、95 mg·L-1,溫度設(shè)置為25、30、35、40 ℃,pH 為5、6、7、8、9,碳源為葡萄糖、蔗糖、淀粉、乙酸鈉、麥芽糖,氮源為明膠、尿素、蛋白胨、硫酸銨、硝酸鈉,調(diào)節(jié)搖床轉(zhuǎn)速為130 r·min-1,用高效液相色譜儀測定3d后的OD600和土霉素的濃度,計(jì)算降解率,比較環(huán)境因子對(duì)降解菌降解土霉素的影響。對(duì)照處理?xiàng)l件為:兩菌株體積比1∶1,接種量3%,土霉素濃度50 mg·L-1,溫度30 ℃,pH 7,不添加碳、氮源。每個(gè)處理均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

    1.3.6 測定條件

    使用高效液相色譜儀(型號(hào)1260,美國安捷倫公司)測定土霉素濃度。色譜條件:色譜柱為ZORBAXSB-Aq(250 mm×4.6 mm,5 μm)不銹鋼柱;流動(dòng)相A組分是0.1%甲酸水溶液,B組分是乙腈;柱溫30 ℃;流速0.8 mL·min-1;進(jìn)樣量20 μL;檢測器為紫外吸收檢測器,檢測波長為278 nm;梯度洗脫程序見表1。

    降解率=(對(duì)照樣品的殘余濃度-試驗(yàn)樣品的殘余濃度)/對(duì)照樣品的殘余濃度×100%。

    利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS,色譜柱為XBridge C18,250 mm×4.6 mm,5 μm)分析土霉素降解的中間產(chǎn)物。質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(ESI),正離子掃描,多反應(yīng)監(jiān)測(MRM),離子源溫度為150 ℃,脫溶劑氣溫度為500 ℃,掃描范圍為50~600 m/z。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 菌株的分離、篩選及生理生化鑒定

    經(jīng)過活化、初篩、復(fù)篩,得到兩株土霉素降解能力較好的菌株W和P2,平板上的P2菌落表面粗糙不透明、微黃色、易挑起,W菌落為圓形、表面光滑、邊緣整齊的乳白色不透明小凸起(圖1),P2為革蘭氏染色陽性菌,W 為革蘭氏染色陰性菌(圖2),兩株降解菌的生理生化特征見表2。

    將兩株降解菌的16S rDNA測序結(jié)果上傳至NCBI網(wǎng)站并進(jìn)行同源性比對(duì)分析,結(jié)果表明:P2菌株的特征基因序列與多種芽孢桿菌屬菌株具有98%以上的同源性,將P2所測序列結(jié)果提交到Gen Bank數(shù)據(jù)庫,獲得序列登錄號(hào)為PP178578;而W菌株的特征基因序列與多種埃希菌屬菌株具有98%以上的同源性,將W所測序列結(jié)果提交到Gen Bank數(shù)據(jù)庫,獲得序列登錄號(hào)為PP178579。兩菌株的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹如圖3所示。

    2.2 菌株P(guān)2和W的生長曲線

    圖4顯示,接入菌株W、P2后,其OD600值迅速降低,這是菌株剛接種到以土霉素為唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,對(duì)新環(huán)境的一個(gè)適應(yīng)期,菌株生長繁殖緩慢。8 h 后OD600值有所上升,并且P2菌株在16 h達(dá)到最大生長值0.025,W菌株在40 h達(dá)到最大生長值0.055,說明菌株在經(jīng)過生長遲緩期后,迅速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期,且W菌株比P2菌株適應(yīng)性更好。W菌株在48 h后,P2菌株在16 h后的OD600值均呈現(xiàn)一定的下降趨勢(shì)而后趨于穩(wěn)定,這可能與土霉素為唯一碳源,且降解產(chǎn)物對(duì)這兩株菌株生長具有一定抑制作用有關(guān)。

    2.3 菌株P(guān)2和W對(duì)土霉素的降解率

    圖5顯示了菌株W、P2對(duì)土霉素的降解率隨著降解時(shí)間持續(xù)的變化過程。由圖5可知,隨著降解時(shí)間的延長,W菌株對(duì)土霉素的降解率逐漸升高,這說明W菌株在適應(yīng)了土霉素為唯一碳源的環(huán)境后,進(jìn)入生長對(duì)數(shù)期并且開始大量降解土霉素,且隨著時(shí)間的延長,降解率提高。但是P2菌株隨著降解時(shí)間的延長,對(duì)土霉素的降解率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),并在第3天時(shí)達(dá)到最高,這一結(jié)果符合菌株自身對(duì)抗生素降解效果的動(dòng)態(tài)平衡,這是因?yàn)榫暝谏L階段和衰退階段,隨著菌株總量的積累,對(duì)抗生素的降解率逐漸升高,之后由于菌量低于某一閾值以及土霉素降解產(chǎn)物對(duì)菌株進(jìn)行抑制,降解率開始降低,直至趨于土霉素自然降解率。

    2.4環(huán)境條件對(duì)菌株P(guān)2和W降解土霉素的影響

    2.4.1混合比例

    接種總量為3%體積分?jǐn)?shù),兩株菌株的體積混合比例分別為W∶P2=1∶0、0∶1、1∶1、2∶1、1∶2,將菌液接種于含有50 mg·L-1土霉素的中性無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,在溫度為30 ℃,轉(zhuǎn)速為130 r·min-1的條件下培養(yǎng)3 d,結(jié)果見圖6?;旌媳壤秊?∶1時(shí),菌株對(duì)土霉素的降解率最高,達(dá)到了13.85%,且菌株的OD600值也最大,說明在這個(gè)混合比例下,兩菌株的生長最為旺盛,對(duì)土霉素的降解能力也最強(qiáng),因此,選取兩株降解菌的接種比例為1∶1,接種總量為3% 體積分?jǐn)?shù)作為進(jìn)一步研究的條件。

    2.4.2 初始濃度

    將體積分?jǐn)?shù)為3%,兩株菌株混合比例為1∶1的菌液分別接種到土霉素濃度為35、50、65、80、95 mg·L-1的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中。在溫度為30 ℃,pH為7,轉(zhuǎn)速為130 r·min-1的條件下培養(yǎng)3 d,結(jié)果見圖7。降解率隨著土霉素初始濃度的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),在65 mg·L-1時(shí)降解率達(dá)到最高,為19.33%,而此時(shí)菌株的OD600值也達(dá)到最高,這是由于低濃度時(shí),土霉素作為唯一碳源不能滿足菌株生長繁殖的需求,而高濃度時(shí),土霉素又作為藥物抑制了菌株的生長繁殖。

    2.4.3 初始pH

    在50 mg·L-1土霉素,pH依次為5、6、7、8、9的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,接種體積分?jǐn)?shù)為3%,兩株菌混合比例為1∶1的菌液,在溫度為30 ℃,轉(zhuǎn)速為130 r·min-1的條件下培養(yǎng)3d,結(jié)果見圖8。降解率隨著pH的升高而降低,pH為5時(shí)降解率最高,為24.29%,pH為9時(shí)降解率最低,為4.27%。菌液OD600值的變化趨勢(shì)與降解率變化趨勢(shì)一致,說明在酸性條件下菌株的生長狀況更好,對(duì)土霉素的降解率也更高,堿性條件抑制兩株菌對(duì)土霉素的降解。

    2.4.4 接種量

    將兩株菌混合比例為1∶1,接種量分別為1%、2%、3%、4%、5% 的菌液接種于含有50 mg·L-1 土霉素的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,調(diào)節(jié)pH 為7,在溫度為30 ℃,轉(zhuǎn)速為130 r·min-1 的條件下培養(yǎng)3d,結(jié)果見圖9。隨著接種量的增加,菌液的OD600 值也在逐漸增加,在接種量為5% 時(shí)達(dá)到最大值0.079,而降解率先升高后降低,在接種量為3% 時(shí)達(dá)到最大值20.66%,這可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)液中的菌體之間會(huì)因?yàn)闋帄Z營養(yǎng)物質(zhì)而產(chǎn)生競爭關(guān)系,從而影響其對(duì)土霉素的降解。

    2.4.5 溫度

    大部分的文獻(xiàn)資料顯示,菌種的最佳生長溫度在30~35 ℃之間,因此本試驗(yàn)在最適溫度界限上下設(shè)置溫度梯度,分別為25、30、35、40 ℃,接種體積為3%,混合比例為1∶1的菌液于含有50 mg·L-1土霉素的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,在pH為7,轉(zhuǎn)速為130 r·min-1的條件下培養(yǎng)3 d,結(jié)果見圖10。隨著溫度升高,降解率和OD600值均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),并且在35 ℃時(shí)分別達(dá)到最大值10.65%和0.054,造成這種現(xiàn)象的原因可能是菌株分泌的土霉素降解酶的最適溫度為35 ℃,溫度過高或過低對(duì)降解效果均有一定的影響,同時(shí),由于降解效率的降低,菌株在該環(huán)境中生存受限,最終反映在菌株OD600值的降低。

    2.4.6 外加碳源

    在分別含有2g乙酸鈉、淀粉、麥芽糖、葡萄糖、蔗糖的50 mg·L-1土霉素?zé)o機(jī)鹽培養(yǎng)基中接種體積分?jǐn)?shù)為3%,兩株菌混合比例為1∶1 的菌液,在溫度為30 ℃,pH為7,轉(zhuǎn)速為130 r·min-1的條件下培養(yǎng)3 d,結(jié)果如圖11所示。CK處理下,聯(lián)合菌株對(duì)土霉素的降解率僅為12.02%,外加碳源后,降解率大幅度增加,說明外加碳源對(duì)降解率的影響較大。降解菌不僅可以利用土霉素作為唯一碳源進(jìn)行分解代謝,外加麥芽糖作為共代謝碳源時(shí),菌株?duì)I養(yǎng)物質(zhì)更充足,生長更快,土霉素的降解率也提高到86.66%,所以麥芽糖是最優(yōu)外源碳源。

    2.4.7外加氮源

    在分別含有2 g明膠、尿素、胰蛋白胨、硫酸銨、硝酸鈉的50 mg·L-1土霉素?zé)o機(jī)鹽培養(yǎng)基中接種體積分?jǐn)?shù)為3%,兩株菌混合比例為1∶1 的菌液,在溫度為30 ℃,pH為7,轉(zhuǎn)速為130 r·min-1的條件下培養(yǎng)3 d,結(jié)果如圖12所示。與CK相比,外加氮源后降解率均有一定程度的增加,說明外加氮源對(duì)降解率的影響較大,其中外加硝酸鈉時(shí),降解率最高,達(dá)到85.15%,為最優(yōu)氮源,而外加尿素時(shí),降解率僅為25.73%,可能是降解菌對(duì)尿素的利用程度不高,不能大幅提升降解效果。

    2.5 土霉素降解產(chǎn)物及潛在的降解途徑

    為了更好地了解菌株W和P2對(duì)土霉素降解的中間產(chǎn)物和潛在的降解途徑,使用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分別檢測土霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、空白樣品和單加P2、單加W、W 與P2 聯(lián)合降解樣品,得到質(zhì)譜結(jié)果如圖13至圖17所示。

    首先根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和空白樣品排除色譜柱內(nèi)殘留的雜質(zhì)峰和確定土霉素的物質(zhì)峰,然后根據(jù)單加P2、單加W推測單株菌降解土霉素的途徑,與W和P2聯(lián)合降解樣品進(jìn)行對(duì)比,推測聯(lián)合降解潛在的共同降解途徑??赡艿慕到猱a(chǎn)物的推測依據(jù)質(zhì)譜圖中豐度較高的質(zhì)荷比、物質(zhì)庫對(duì)照以及已發(fā)表文獻(xiàn),根據(jù)已有研究中土霉素主要的降解路徑以及合理的質(zhì)量丟失,提出4種潛在的土霉素降解途徑,結(jié)果如圖18所示。

    途徑Ⅰ:在W菌株作用下,母體化合物土霉素先經(jīng)過C5位置的氧化脫氫和C4位置的二甲氨基脫甲基,形成化合物m/z=432,再在C2 位置脫酰胺基,C6位置脫水、脫甲基,C12a位置脫羥基后轉(zhuǎn)化為化合物m/z=340,然后在C5位置脫羰基,在C4a和C12a位置的苯環(huán)裂解,形成化合物m/z=211,最后在C1位置脫羥基,生成產(chǎn)物4-氫-蒽-9-酮(m/z=194)。

    途徑Ⅱ:在W菌株作用下,土霉素先在C2位置脫酰胺基,C4位置的二甲氨基脫甲基形成化合物m/z=397,再經(jīng)過C6位置脫水、C5和C12位置的苯環(huán)裂解,形成化合物m/z=218,C2位置再脫羧基,C4位置脫甲基,C8位置脫羥基形成產(chǎn)物4-氫-萘-1-酮(m/z=141)。

    途徑Ⅲ:在P2菌株作用下,土霉素先經(jīng)過C5位置的氧化脫氫轉(zhuǎn)化為化合物m/z=459,再經(jīng)過C4位置二甲氨基的脫甲基化,C5a和C11a位置的苯環(huán)裂解,分解形成化合物m/z=191和m/z=291,化合物m/z=191再經(jīng)過C5位置脫甲基、脫羥基形成1-羥基-5H-萘-8-酮(m/z=167),m/z=291 再進(jìn)行C4 位置的脫胺基、C3、C8a位置脫羥基和C2位置脫酰胺基形成化合物m/z=141,進(jìn)一步分解為小分子1,3-環(huán)己二酮(m/z=123)。

    途徑Ⅳ:在W和P2菌株共同作用下,土霉素先經(jīng)過C1位置的脫羰基,C2位置的脫酰胺基,C3、C12a位置的脫羥基轉(zhuǎn)化為化合物m /z=377,再經(jīng)過C2 和C12a位置苯環(huán)的裂解,C4位置二甲氨基的脫甲基形成化合物m/z=321,然后C1位置脫羥基,C3位置脫氨基,C10 位置脫水形成化合物m/z=262,最后經(jīng)過C4和C9a位置苯環(huán)的斷裂,生成產(chǎn)物1-羥基-5-甲基-7-氫-萘-8-酮(m/z=175)。

    3 討論

    環(huán)境中抗生素的殘留對(duì)人類健康和生態(tài)系統(tǒng)具有極大的威脅,因此研究抗生素降解技術(shù)備受社會(huì)關(guān)注。而微生物可以以抗生素為唯一碳源和能源,通過微生物分泌胞外酶進(jìn)行氧化、還原、基團(tuán)轉(zhuǎn)運(yùn)、水解等,參與細(xì)胞代謝,最終生成CO2和H2O等[24-25],具有投資少、沒有二次污染物、環(huán)境擾動(dòng)小等優(yōu)點(diǎn),因而成為國內(nèi)外研究熱點(diǎn)。

    從環(huán)境中篩選出可以降解四環(huán)素類抗生素菌株的報(bào)道不斷出現(xiàn),如光合菌、乳酸菌、放線菌、酵母菌、發(fā)酵絲狀菌、芽孢桿菌、枯草桿菌、硝化細(xì)菌、酵母等都具有降解抗生素的功能[9]。張小紅等[26]發(fā)現(xiàn)一株可同時(shí)降解土霉素、四環(huán)素、金霉素及強(qiáng)力霉素的降解菌TCs-2,初步鑒定其為潘多拉菌屬(Pandoraea sp.)。成潔等[27]發(fā)現(xiàn)木糖氧化無色桿菌(Achromobacter sp.)TJ-2#、枯草芽孢桿菌(Bacillus sp.)TJ-6#對(duì)土霉素的降解率分別為58.3%、49.6%。張長青[28]發(fā)現(xiàn)蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)在第8 天時(shí)對(duì)50 mg·L-1 土霉素的降解率達(dá)到82.38%。也有研究表明,由于環(huán)境中污染物組成成分復(fù)雜,依靠單一降解菌很難達(dá)到理想效果,而由不同降解菌組合成的降解菌群相對(duì)于單菌而言,其降解性能更加優(yōu)異[29]。研究表明,有效微生物生物量與污染物降解率呈正相關(guān)關(guān)系,投加的降解菌生物量越多降解率越高[30]。本研究篩選出兩株有降解土霉素能力的降解菌W和P2,其分別屬于埃希菌屬和芽孢桿菌屬,對(duì)其進(jìn)行最佳配比,使兩株菌對(duì)土霉素進(jìn)行1∶1聯(lián)合降解,以提高土霉素的降解效果。曾洪等[31]發(fā)現(xiàn)當(dāng)土霉素降解菌OTC-1培養(yǎng)時(shí)間超過6 d時(shí),菌株的生長量開始下降,這可能是因?yàn)橥撩顾乇痪煤螽a(chǎn)生具有抑菌性的中間代謝產(chǎn)物,從而降低了微生物活性,該結(jié)果與本研究結(jié)果相似。

    邵思城[32] 發(fā)現(xiàn)蒼白桿菌屬(Ochrobactrum sp.)KSS10對(duì)土霉素的最優(yōu)降解條件為:土霉素初始濃度56.31 mg·L-1、溫度32.48 ℃、溶液初始pH 5.45和接種量16.07%(V/V)。這與本試驗(yàn)篩選出的最佳降解條件為土霉素初始濃度65 mg·L-1、接種量3%、pH 5、溫度35 ℃基本一致。于浩等[33]發(fā)現(xiàn)了土霉素優(yōu)勢(shì)降解菌株短波單胞菌屬(Brevundimonas sp.)YH1,添加不同的碳源、氮源均有利于該菌株對(duì)土霉素的降解,其中加入蔗糖和麥芽糖可以明顯提高降解率,添加麥芽糖后降解率提高至71.89%,添加酵母浸液后降解率提高至64.91%。本試驗(yàn)中,最優(yōu)碳源為麥芽糖,土霉素降解率提高到86.66%,最優(yōu)氮源為硝酸鈉,土霉素降解率提高至85.15%。

    土霉素的降解路徑主要為母體結(jié)構(gòu)中苯環(huán)的裂解、取代基的降解以及OH、NH2、CH3、CONH2等基團(tuán)的去除[34-37]。本研究發(fā)現(xiàn)4 種潛在的土霉素降解途徑,降解過程主要包括羥基化、苯環(huán)裂解、脫氫、脫水、脫甲基、脫羥基、脫胺基和脫酰胺基反應(yīng)。石建惠等[38]發(fā)現(xiàn)光芬頓體系降解土霉素的中間產(chǎn)物,其中OTC10 與本研究獲得的降解產(chǎn)物之一m/z=175 較為一致。周婷[39]發(fā)現(xiàn)光催化氧化土霉素的產(chǎn)物m/z=432、m/z=191 的結(jié)構(gòu)均與本研究獲得的降解產(chǎn)物m/z=432、m/z=191 較為一致。陳棟[40]發(fā)現(xiàn)電化學(xué)氧化土霉素的降解產(chǎn)物之一m/z=432致突變性高于土霉素本身,與本研究推測產(chǎn)物m/z=432的結(jié)構(gòu)不相似。

    抗生素的微生物降解研究目前仍處于起步階段,微生物技術(shù)固有的限制特點(diǎn)使得該項(xiàng)技術(shù)現(xiàn)在仍普遍處于實(shí)驗(yàn)室研究階段,且多數(shù)研究僅考慮單一微生物和抗生素的降解,代謝機(jī)制的研究以及實(shí)際應(yīng)用的開展等還需要大量的工作。要將微生物修復(fù)技術(shù)進(jìn)行大規(guī)模工程應(yīng)用,還需要加快尋找廉價(jià)、有效的促進(jìn)降解菌生長的營養(yǎng)鹽和微生物載體,加強(qiáng)對(duì)微生物作用過程中間代謝產(chǎn)物及酶的研究,運(yùn)用現(xiàn)代生物工程技術(shù)構(gòu)建高效基因工程菌,以及針對(duì)性地采用多種修復(fù)技術(shù)相結(jié)合的聯(lián)合修復(fù)方案。本研究篩選得到的P2和W 菌株對(duì)土霉素有較好的降解作用,具有潛在的實(shí)際使用價(jià)值,為雙菌共同降解土霉素提供了參考。

    4 結(jié)論

    (1)從實(shí)驗(yàn)室保存的蘇州某廢棄農(nóng)藥廠土壤和地下水樣品中純化分離的菌株中,篩選分離出兩株土霉素降解菌株W和P2,根據(jù)兩菌株的形態(tài)、生理生化特征及16S rDNA鑒定,P2屬于芽孢桿菌屬,W屬于埃希菌屬。

    (2)不同環(huán)境條件下,兩菌株對(duì)土霉素的降解效果不同。在土霉素初始濃度為65 mg·L-1,混合比例為1∶1,接種量為3%,pH為5,溫度為35 ℃,外加碳源為麥芽糖,外加氮源為硝酸鈉時(shí),W和P2對(duì)土霉素的降解效果最佳。其中外加碳、氮源對(duì)降解菌降解土霉素的影響最大。

    (3)發(fā)現(xiàn)4種潛在的土霉素降解途徑,降解過程主要有苯環(huán)裂解、脫氫、脫水、脫羰基、脫甲基、脫羥基、脫胺基和脫酰胺基反應(yīng),中間降解產(chǎn)物分別為4-氫-蒽-9-酮(m/z=194)、4-氫-萘-1-酮(m/z=141)、1-羥基-5H-萘-8-酮(m/z=167)、1,3-環(huán)己二酮(m/z=123)、1-羥基-5-甲基-7-氫-萘-8-酮(m/z=175)。

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