超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定果蔬、糖料作物及谷物中春雷霉素的殘留

關(guān)鍵詞：春雷霉素；水果；蔬菜；糖料作物；谷物；超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；殘留檢測

中圖分類號：O657.63；TS207.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1672-2043（2024）12-3034-07 doi：10.11654/jaes.2024-0112

春雷霉素（圖1）是放線菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，屬氨基糖苷類抗菌素，它的作用機(jī)理是通過干擾氨基酸代謝的酯酶系統(tǒng)，從而影響蛋白質(zhì)的合成，抑制菌絲伸長和造成細(xì)胞顆?；瑥亩_(dá)到防治病害的目的，是一種高效的農(nóng)用殺菌劑[1-2]，對防治西瓜、蘋果、黃瓜、葡萄、柑橘、番茄、茄子、甘蔗、水稻、桃、馬鈴薯等多種農(nóng)作物的細(xì)菌、真菌病害有效[3-7]。春雷霉素的檢測方法有高效毛細(xì)管電泳法[8-9]、高效液相色譜法[6，10]、離子對色譜法[8]、親水作用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11-15]以及柱前衍生-液相色譜法[16]等。高效液相色譜法靈敏度和準(zhǔn)確性較低，具有強(qiáng)極性的春雷霉素在色譜柱上保留時間較短，因此不利于更好地與雜質(zhì)分離[15]；離子對色譜法可改進(jìn)春雷霉素的分離效果，但由于離子對試劑多為難揮發(fā)鹽，不易沖洗干凈，容易造成色譜柱和儀器的損壞和污染，且對操作要求高[9]；親水作用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法有較高的靈敏度，但易受樣品本身和前處理手段的干擾而增大基質(zhì)效應(yīng)，影響方法的線性、靈敏度、精密度等[17]，且不易簡便處理大批量的樣品；柱前衍生法的前處理步驟復(fù)雜，樣品分析時間增長[17]。

農(nóng)藥殘留引起的農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全問題日益受到關(guān)注，我國對春雷霉素制定了最大殘留限量（MRL）標(biāo)準(zhǔn)[《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763—2021）、《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中2，4-滴丁酸鈉鹽等112 種農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763.1—2022）]，其中谷物、蔬菜、水果的春雷霉素的限量在0.05～2 mg·kg^-1之間，WTO以及美國也規(guī)定了蔬菜中春雷霉素的最大殘留限量。目前，我國尚未發(fā)布谷物、蔬菜、水果、糖料等基質(zhì)中春雷霉素的殘留檢測方法標(biāo)準(zhǔn)，且未見糙米、普通白菜、葡萄、柑橘、甘蔗等谷物、蔬菜、水果、糖料作物中春雷霉素的殘留檢測方法。本研究建立了離子色譜柱-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定春雷霉素殘留的分析方法，是一種易于操作，靈敏度高，具有良好的回收率與重現(xiàn)性，可廣泛適用于水果、蔬菜、糖料、谷物等各類農(nóng)產(chǎn)品中春雷霉素的殘留檢測方法，可滿足農(nóng)產(chǎn)品中春雷霉素殘留的檢測要求，為春雷霉素的科學(xué)使用以及在食品中的殘留分析和風(fēng)險評估提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀WatersAcquity?超高效液相色譜（Waters 公司，美國）以及SCIEX QTRAP 4500質(zhì)譜儀（Framingham，MA，美國）；分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；3-30K Sigma離心機(jī)（SIGMA離心機(jī)有限公司，德國）；渦旋混合器（海道夫，德國）；Oasis HLB固相萃取柱：60mg，3 mL（Waters公司，美國）。

試劑及材料：春雷霉素（純度為89.0%，Dr. Ehren?storfer GmbH，德國）、二氯甲烷（分析純，天津渤化化學(xué)試劑有限公司）、碳酸氫銨（純度99.0%，Sigma 公司，美國）、氨水（Acros organics公司，美國）、乙酸（上海麥克林生物化學(xué)有限公司）、實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）。水果（蘋果、葡萄、柑橘）、蔬菜（茄子、普通白菜、黃瓜）、糖料作物（甘蔗）以及谷物（糙米）等空白基質(zhì)采購自市場，均質(zhì)樣品（均質(zhì)前不對樣品進(jìn)行清洗），并測定含水率。

參考《林業(yè)生物質(zhì)原料分析方法含水率的測定》（GB/T 36055—2018）稱取3個樣品做含水率測定。稱取10.00 g樣品，105 ℃下烘干4 h，取出在干燥器中放置至室溫，稱質(zhì)量（精確至0.01 g），再放回烘箱105 ℃下烘干1 h，取出在干燥器中放置至室溫，稱質(zhì)量（精確至0.01 g），兩次稱質(zhì)量之差小于0.05 g即可。烘干前后的樣品質(zhì)量差（g）占烘干前的樣品質(zhì)量（g）的百分比即所求的含水率。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制與標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

選擇與被測樣品性質(zhì)相同或相似的空白樣品進(jìn)行前處理，得到空白基質(zhì)溶液。逐級用水或空白基質(zhì)溶液分別稀釋成質(zhì)量濃度為0.001、0.002、0.005、0.010、0.020、0.050、0.100、0.200 mg·L^-1 和0.500 mg·L^-1的溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，供液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測定。以春雷霉素定量用子離子的質(zhì)量色譜圖峰面積為縱坐標(biāo)，相對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制溶劑和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取試劑的確定

以水、甲醇、1%甲酸水、1%甲酸甲醇、含0.5%甲酸的甲醇水溶液（50∶50，V/V）等5種提取溶劑，選擇葡萄、柑橘和甘蔗作為代表性基質(zhì)，評價不同提取條件下春雷霉素的平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（表3），水作為對環(huán)境最友好的提取溶劑，可滿足春雷霉素提取需要，最終確定采用水為提取溶劑。在后續(xù)凈化過程中，發(fā)現(xiàn)針對蛋白含量較高的糙米基質(zhì)，當(dāng)使用0.1 mmol·L^-1乙酸水溶液作為提取劑時，提取環(huán)境的酸堿度（pH=4.5）接近于上述基質(zhì)蛋白的等電點(diǎn)，可促進(jìn)相關(guān)蛋白沉淀，且不影響目標(biāo)化合物的回收率。因此，在糙米的前處理過程中，使用0.1 mmol·L^-1乙酸水溶液作為提取溶劑。

在以往的研究中，通常使用20～28 mL甲醇[1，18-21]或20 mL乙腈[17]提取蔬菜（黃瓜、茄子、大白菜、辣椒、萵苣、番茄）和水果（蘋果、桃、西瓜、柑橘）中春雷霉素殘留，然而，甲醇和乙腈等有機(jī)溶劑的使用不僅對環(huán)境不友好而且也增加了試驗(yàn)成本。本研究采用水作為提取溶劑，在確保具有良好的準(zhǔn)確度和精密度的前提下，不僅適用于蔬菜和水果中春雷霉素的殘留提取，而且也適用于糖料作物甘蔗和谷物糙米，表明水作為提取溶劑具有較寬的作物適用范圍，使用成本低且對生態(tài)環(huán)境沒有危害。

2.2 儀器條件的確定

本實(shí)驗(yàn)采用陰離子分析柱進(jìn)行色譜分析。流動相A相為水，B相為200 mmol·L^-1碳酸氫銨-0.05%氨水水溶液。相較于前人報(bào)道中在色譜分離時多使用甲醇[17-20，22-23]或乙腈[1，19，21，24-25]和水搭配作為流動相，本研究中建立的水相流動相體系降低了試驗(yàn)成本和試驗(yàn)后廢液處理的難度，對環(huán)境更加友好。在全掃描方式下，將標(biāo)準(zhǔn)品直接注入質(zhì)譜來優(yōu)化質(zhì)譜條件，將[M+H]+峰作為母離子，對選定的母離子進(jìn)行掃描，優(yōu)化碰撞能，選擇其中相應(yīng)和峰型較好的2對離子作為定量離子（m/z 380/112，圖2）和定性離子（m/z 380/200），其碰撞能電壓分別設(shè)置為25 V和15 V。采用陰離子分析柱-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，在復(fù)雜基質(zhì)中，既可實(shí)現(xiàn)對強(qiáng)極性殺菌劑春雷霉素的高選擇性分離、排除干擾物質(zhì)，又可通過液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的高靈敏度和結(jié)構(gòu)鑒定能力對其殘留進(jìn)行精準(zhǔn)的定性定量分析。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與基質(zhì)效應(yīng)

校準(zhǔn)曲線如表4 所示，蘋果和糙米在0.001～0.5mg·L^-1 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，春雷霉素線性良好（R²≥0.994）；茄子、普通白菜、黃瓜、葡萄、柑橘、甘蔗在0.002～0.5 mg·L^-1 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，春雷霉素線性良好（R2≥0.991）。本研究中春雷霉素的方法定量限為0.005 mg·kg^-1（蘋果）和0.01 mg·kg^-1（葡萄、柑橘、茄子、普通白菜、黃瓜、甘蔗、糙米）。我國對不同作物中的春雷霉素制定了最大殘留限量（MRL）標(biāo)準(zhǔn)，蘋果、葡萄、普通白菜、黃瓜和甘蔗的最大殘留限量為0.2mg·kg^-1，柑橘、茄子和糙米的最大殘留限量為0.1 mg·kg^-1。參照我國《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2763—2021）與WTO以及美國規(guī)定的蔬菜中春雷霉素的最大殘留限量值，本方法均可滿足檢測需求。文獻(xiàn)中春雷霉素的方法定量限為0.005 mg·kg^-1（柑橘全果[17]）、0.008 mg·kg^-1（辣椒和土壤[20]）、0.01 mg·kg^-1（桃[1]、柑橘果肉[17]、西瓜[19]、番茄[25]、甜菜[25]、生菜[25]、西葫蘆[25]、紅辣椒[25]）、0.05 mg·kg^-1（黃瓜[18，21]、番茄幼苗[26]、番茄[21，24]、蘋果[21]、大白菜[21]、茄子[21]、萵苣[21]）、0.1 mg·kg^-1（大白菜[23]）、2.2 mg·L^-1（灌溉水[22]），同上述研究比較，本研究中春雷霉素的方法定量限具有較高的靈敏度。

基質(zhì)效應(yīng)是影響目標(biāo)物信號響應(yīng)的關(guān)鍵因素，本研究中采用HLB 固相萃取柱進(jìn)行凈化，春雷霉素的基質(zhì)效應(yīng)在-80.4%～-28.2%之間，呈現(xiàn)出不同程度的基質(zhì)抑制效應(yīng)。這與文獻(xiàn)報(bào)道的在水果（柑橘[17]、西瓜[19]、蘋果[21]）、蔬菜（大白菜[21，23]、辣椒[20，25]、番茄[21-25]、甜菜[25]、生菜[25]、西葫蘆[25]、黃瓜[25]、茄子[25]、萵苣[25]）、灌溉水[22]和土壤[20]中的基質(zhì)效應(yīng)相似，上述文獻(xiàn)報(bào)道采用MCX[19-20]、C18[17，23]和HLB[21]固相萃取柱對水果和蔬菜基質(zhì)進(jìn)行凈化，其基質(zhì)效應(yīng)范圍在-75.7%～6.11%之間，大部分情況受到基質(zhì)影響而產(chǎn)生信號抑制，同本研究結(jié)果一致。因此，為消除基質(zhì)效應(yīng)的影響，在對不同樣品中春雷霉素進(jìn)行定量分析時，需使用基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線。本研究采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線可校正水果（蘋果、葡萄、柑橘）、蔬菜（茄子、普通白菜、黃瓜）、糖料作物（甘蔗）以及谷物（糙米）中的基質(zhì)效應(yīng)，確保春雷霉素在不同基質(zhì)中殘留定量的準(zhǔn)確性。

2.4 準(zhǔn)確度與精密度

在這8種基質(zhì)中添加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加水平分別為0.01（蘋果為0.005）、0.05、0.10、1.00 mg·kg^-1，每個加標(biāo)水平做5個平行。由表5可知，在上述加標(biāo)水平下，春雷霉素在各基質(zhì)中的日間平均回收率（n=15）為81.9%～125.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為7.4%～20.5%。結(jié)果表明該方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度，可滿足農(nóng)殘檢測分析要求。

本研究建立的離子色譜柱-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法用于測定水果、蔬菜、糖料作物及谷物中春雷霉素的殘留量，顯示出較高的實(shí)用性和可推廣性。首先，該方法采用的提取和凈化步驟簡便，適用于多種農(nóng)產(chǎn)品，有利于在不同實(shí)驗(yàn)室和檢測環(huán)境中推廣。其次，通過使用Metrohm Metrosep A Supp 5色譜柱和優(yōu)化的流動相梯度洗脫程序，實(shí)現(xiàn)了春雷霉素的高效分析，保證了方法的高靈敏度。此外，該方法在較寬的春雷霉素質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，定量限低，能夠滿足國內(nèi)外對上述農(nóng)產(chǎn)品中春雷霉素殘留的嚴(yán)格檢測要求。在多個濃度水平下的添加回收實(shí)驗(yàn)中，日間平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均符合農(nóng)藥殘留檢測的要求，表明該方法具有良好的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。綜上所述，本方法易于操作、靈敏度高、適用范圍廣、對環(huán)境友好，具有在實(shí)際檢測工作中廣泛應(yīng)用的潛力，為保障農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全提供了有力的技術(shù)支持。

2.5 實(shí)際樣品測定分析

為了驗(yàn)證方法的可靠性和實(shí)用性，從吉林、山東兩省的個體農(nóng)戶、批發(fā)市場、農(nóng)貿(mào)市場以及生產(chǎn)基地采集了39份茄子樣本，應(yīng)用所建立的方法進(jìn)行春雷霉素殘留的測定，在56.1%的茄子樣品中檢測到微量春雷霉素殘留，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，最高檢出濃度為0.155 mg·kg^-1，最低檢出濃度為0.057 mg·kg^-1。我國尚未建立茄子中春雷霉素的最大殘留限量，而WTO以及美國的限量分別為0.1 mg·kg^-1和0.2 mg·kg^-1，在吉林生產(chǎn)基地中分別檢出0.155 mg·kg^-1 和0.138 mg·kg^-1 兩個茄子樣品超過0.1 mg·kg^-1，WTO限量通常在國際貿(mào)易中使用，對我國監(jiān)測結(jié)果而言僅作參考。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用水和0.1 mmol·L^-1乙酸水溶液為提取溶劑，將離子色譜柱與液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合，建立了測定農(nóng)產(chǎn)品中春雷霉素殘留量的分析方法。該方法操作簡單、快速，有較高的靈敏度與準(zhǔn)確度，同時穩(wěn)定性好、消耗有機(jī)溶劑少、污染小，定量限能夠滿足相關(guān)殘留限值的要求。利用該方法能夠?qū)崿F(xiàn)蔬菜、水果、糖料以及谷物等農(nóng)產(chǎn)品中春雷霉素殘留量的高效檢測，有助于保障農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全和促進(jìn)農(nóng)產(chǎn)品國際貿(mào)易。