水稻Ⅲ類過氧化物酶基因IPH1調(diào)控水稻株高

馮萍，劉楊，楊杰，馬宏蕾，秦誠(chéng)，王楠，沈文強(qiáng)

西南大學(xué) 水稻研究所/農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院/轉(zhuǎn)基因植物與安全控制重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715

株高是水稻的重要農(nóng)藝性狀之一,也是構(gòu)建理想株型的一個(gè)重要因素.株高與水稻光合效率、抗倒伏以及產(chǎn)量有著密切的聯(lián)系.20世紀(jì)的綠色革命在矮化株型育種中取得了巨大成功,然培育兼顧產(chǎn)量和抗倒伏的適宜株高仍是水稻、玉米和小麥等大多數(shù)作物的首要育種目標(biāo),因此水稻株高的遺傳及分子機(jī)制一直是研究的熱點(diǎn)．

水稻株高主要由節(jié)間細(xì)胞的數(shù)目和大小決定.節(jié)間細(xì)胞的增殖及擴(kuò)張受多重因素的影響,包括植物激素、細(xì)胞周期、細(xì)胞壁合成、表觀遺傳學(xué)及轉(zhuǎn)錄因子等,同時(shí)也受到外界環(huán)境因素的影響,如光照、溫度、物種間競(jìng)爭(zhēng)等.植物激素作為植物中重要的調(diào)節(jié)因子,參與植物的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過程,其中赤霉素(GA)和油菜素內(nèi)酯(BR)是水稻株高的重要決定因子[1-2].SD1編碼赤霉素生物合成的關(guān)鍵酶GA20ox,突變后導(dǎo)致GA20ox失活,造成株高降低[3-4].EUI1編碼細(xì)胞色素P450單加氧酶CYP714D1,eui1突變體及eui1RNAi植株赤霉素含量升高,倒1節(jié)顯著伸長(zhǎng),株高增加,而過表達(dá)植株中赤霉素含量降低,導(dǎo)致株高降低,因此EUI1負(fù)調(diào)控赤霉素介導(dǎo)的細(xì)胞伸長(zhǎng)[5-6].D35/OsKO2編碼貝殼杉烯氧化酶,參與催化赤霉素生物合成的早期步驟,其功能缺失導(dǎo)致d35株高嚴(yán)重降低[7].SLR1編碼1個(gè)DELLA蛋白,是赤霉素信號(hào)傳導(dǎo)的負(fù)調(diào)控因子,其功能是導(dǎo)致突變體株高降低.GID1編碼1個(gè)可溶的赤霉素受體,類似于激素敏感脂肪酶,并且對(duì)具有生物活性的GAs具有高度的親和性,GID1過量表達(dá)表現(xiàn)出GA高敏感性表型.GID1與SLR1相互作用,從而形成GID1-GA-SLR1復(fù)合體,阻止赤霉素信號(hào)向下傳遞[8-11]．

油菜素內(nèi)酯能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng),在細(xì)胞伸長(zhǎng)及分裂中也具有重要作用.BRD1,BRD2和D2均參與油菜素內(nèi)酯的生物合成,分別編碼C-6氧化酶、氧化還原酶和細(xì)胞色素P450,這些基因的突變導(dǎo)致油菜素內(nèi)酯生物合成受阻,突變體中油菜素內(nèi)酯含量降低,表現(xiàn)出嚴(yán)重矮化[12-14].BRI1和BZR1參與油菜素內(nèi)酯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),分別編碼油菜素內(nèi)酯受體激酶和下游信號(hào)分子.bri1第2節(jié)不伸長(zhǎng),株高矮化,并且對(duì)外源油菜素內(nèi)酯不敏感;BZR1能夠調(diào)控下游油菜素內(nèi)酯響應(yīng)基因,干涉植株表現(xiàn)為矮桿[15-16]．

過氧化物酶是一大類催化各種底物發(fā)生氧化的生物體保護(hù)酶類家族,在植物的生長(zhǎng)發(fā)育中具有重要作用.根據(jù)功能不同,將過氧化物酶分為3類: Ⅰ類(抗壞血酸)過氧化物酶、Ⅱ類(木質(zhì)素)過氧化物酶和Ⅲ類(分泌型)過氧化物酶[17].Ⅲ類過氧化物酶(CⅢ PRXs)廣泛分布于植物界并且是植物中特有的一類過氧化物酶,參與植物激素分解代謝、木質(zhì)素生物合成、種子萌發(fā)、細(xì)胞伸長(zhǎng)和防御病原體等多種生物生理過程.CⅢ PRXs基因編碼含血紅素的酶,接受來自不同分子供體的電子,催化H2O2的代謝,產(chǎn)生活性氧(ROS,即OH-或O2-).這些特性使得CⅢ PRXs能夠在過氧化循環(huán)過程中調(diào)控?fù)p傷植物細(xì)胞的ROS產(chǎn)生[18].CⅢ PRXs酶活性由ROS觸發(fā),ROS的產(chǎn)生由不同的環(huán)境刺激誘導(dǎo),以抵御潛在的威脅[19]．

Ⅲ類PRX家族較為龐大,在水稻和擬南芥中分別包含138個(gè)和73個(gè)成員,其中大部分的生物學(xué)功能并不清楚[20-21].擬南芥中研究表明過氧化物酶與植物生長(zhǎng)呈負(fù)調(diào)控,AtPRX71通過在外質(zhì)體中積累H2O2抑制細(xì)胞擴(kuò)張,atprx71突變體蓮座葉變大、生物量顯著增加,而過表達(dá)植株生長(zhǎng)緩慢蓮座葉變小、生物量顯著下降,并且AtPRX71表達(dá)水平的升高會(huì)促進(jìn)ROS的積累導(dǎo)致細(xì)胞壁成分變化[22].AtPRX37過表達(dá)植株生長(zhǎng)遲緩,表現(xiàn)為矮化[23],因此AtPRX71和AtPRX37均是擬南芥生長(zhǎng)的負(fù)調(diào)控因子.AtPRX72,AtPRX52和AtPRX4參與擬南芥木質(zhì)素的生物合成,atprx72生長(zhǎng)緩慢,葉片形態(tài)及角果數(shù)減少等.AtPRX52參與木質(zhì)化過程中微管纖維的合成,突變體中木質(zhì)素含量降低,木質(zhì)素生物合成相關(guān)基因的表達(dá)下調(diào)[24-25].OsPRX38在擬南芥中過表達(dá)后激活不同抗氧化系統(tǒng)信號(hào)網(wǎng)絡(luò),促進(jìn)木質(zhì)素生物合成,增強(qiáng)根部的木質(zhì)化程度,導(dǎo)致過表達(dá)植株中砷積累減少[26].AtPRX17調(diào)控木質(zhì)化組織的形成,在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變過程中受到AGL15的調(diào)控[27].在水稻中,OsPRX30通過調(diào)節(jié)過氧化物酶體(POD)的活性與ROS的含量來調(diào)節(jié)白葉枯病抗性,而OsPRX30的表達(dá)又受到含有AT-hook結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子OsATH1的調(diào)控,進(jìn)一步的研究揭示了OsATH1通過調(diào)節(jié)OsPRX30啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)的組蛋白H3乙酰化水平進(jìn)而影響OsPRX30表達(dá)以調(diào)控白葉枯病抗性[28].目前為止,僅有少數(shù)Ⅲ類PRX基因生物學(xué)功能被揭示,還有大部分尚未報(bào)道,尤其在水稻中還未見Ⅲ類PRX基因參與調(diào)控株高的相關(guān)報(bào)道．

本研究通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù),在粳稻中花11背景下創(chuàng)制的Ⅲ類過氧化物酶家族敲除突變體庫(kù)中鑒定到1個(gè)株高變高的突變體,將其命名為iph1(increaseingplantheight1).與野生型相比,iph1的節(jié)明顯變長(zhǎng),導(dǎo)致株高增加.本研究通過表型分析、農(nóng)藝性狀考察、表達(dá)模式分析、過氧化物酶活性分析、亞細(xì)胞定位等對(duì)IPH1進(jìn)行功能分析,探究IPH1在調(diào)控水稻株高發(fā)育及株型形態(tài)建成中的作用,為利用該基因進(jìn)行水稻株型分子設(shè)計(jì)育種奠定基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

水稻突變體iph1來源于以中花11為背景的敲除突變體庫(kù),經(jīng)過多代自交,性狀能夠穩(wěn)定遺傳.所有試驗(yàn)材料均種植于西南大學(xué)水稻研究所．

1.2 生物信息學(xué)分析

通過NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的Blast工具獲取IPH1的結(jié)構(gòu)域信息和同源蛋白序列,下載同源蛋白序列,并將其保存為FASTA文件格式,將FASTA文件導(dǎo)入MEGA5軟件,根據(jù)貝葉斯最低分準(zhǔn)則利用Neighbor-joining方法構(gòu)建進(jìn)化樹,對(duì)IPH1進(jìn)行進(jìn)化分析．

1.3 RNA提取及RT-qPCR分析

利用天根RNA提取試劑盒(TIANGEN生物公司)提取野生型和iph1突變體總RNA,并用寶生物PrimeScript試劑盒(TaKaRa)將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA.以水稻ACTIN為內(nèi)參基因,使用PrimerPrimer5.0軟件設(shè)計(jì)引物(表1)[28],用Bio-Rad實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(CFX Connect Realtime Reaction System)進(jìn)行擴(kuò)增,每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù).基因相對(duì)表達(dá)量計(jì)算用2-ΔΔCt法,并用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析．

1.4 亞細(xì)胞定位

為了確定IPH1的亞細(xì)胞定位,使用引物pAN580-IPH1-F和pAN580-IPH1-R(表1)從野生型中擴(kuò)增不含終止密碼子的IPH1編碼序列,將該片段克隆到瞬時(shí)表達(dá)載體pAN580的XbalⅠ/Bam HⅠ位點(diǎn)上,構(gòu)建IPH1-GFP載體.經(jīng)序列分析驗(yàn)證后,通過PEG介導(dǎo)法將pAN580-GFP和IPH1-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體.28 ℃孵育12～16 h后,用激光共聚焦顯微鏡(LSM800,Zeiss,德國(guó)蔡司)觀察熒光信號(hào)并拍照．

表1 引物序列

1.5 過氧化物酶活性分析

取8周齡水稻幼苗的新鮮葉片(300 mg),在液氮中研磨成粉,并與4 mL 0.05 mol/L PBS(pH值為7.8)混合在5 mL試管中.快速解凍后,將試管7 500 r/min離心15 min,收集上清液(含POD).以愈創(chuàng)木酚為供氫體,采用分光光度計(jì)在405 nm處測(cè)定OD值,根據(jù)公式計(jì)算過氧化物酶活性[29]．

1.6 過氧化氫(H2O2)質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

將野生型和iph1突變體新鮮組織于液氮中充分研磨,加入9倍體積的生理鹽水,冰水浴條件下機(jī)械勻漿,1 200 r/min離心10 min,取上清液待測(cè).每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù),采用南京建成生物工程研究所的H2O2試劑盒測(cè)定H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)．

2 結(jié)果與分析

2.1 iph1敲除突變體的獲得及鑒定

CRISPR/Cas9表達(dá)載體構(gòu)建的靶點(diǎn)選擇如圖1a,在基因(LOC_Os12g09460)的5′-UTR及編碼區(qū)前端設(shè)計(jì)了2個(gè)靶點(diǎn).通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化中花11愈傷,對(duì)轉(zhuǎn)基因植株靶點(diǎn)測(cè)序,比對(duì)發(fā)現(xiàn)2個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因株系在PAM(protospacer adjacent motif)附近發(fā)生了2種方式的編輯:iph1-1靶點(diǎn)1處發(fā)生了大片段替換,導(dǎo)致IPH1蛋白翻譯的起始密碼子缺失,無法正常翻譯;iph1-2在目標(biāo)位置缺失了7個(gè)堿基(ACCACGG)(圖1b).進(jìn)一步通過qRT-PCR分析,IPH1在兩種編輯方式的突變體中表達(dá)均極顯著下調(diào)(圖1c).以上結(jié)果表明所構(gòu)建的iph1突變材料為過氧化物酶基因(LOC_Os12g09460)敲除突變體,可用于后續(xù)的表型及生理生化等分析．

**表示p<0.01,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．圖1 iph1突變體的創(chuàng)制與鑒定

2.2 表型鑒定

對(duì)iph1突變體植株經(jīng)過多代全生育期的田間觀察和統(tǒng)計(jì),發(fā)現(xiàn)iph1突變株在苗期較野生型差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2a),在抽穗期至成熟期階段株高出現(xiàn)差異,成熟期iph1突變體的株高顯著高于野生型(圖2b),iph1-1和iph1-2的株高分別增加了7.4%,14.6%(圖2d).結(jié)果表明IPH1基因功能缺失主要影響株高,且遺傳性狀穩(wěn)定．

*表示p<0.05,**表示p<0.01,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．圖2 野生型(WT)及iph1突變體的表型

成熟期時(shí),對(duì)野生型和iph1-1,iph1-2突變體的結(jié)實(shí)率、穗長(zhǎng)和各節(jié)間長(zhǎng)度進(jìn)行了詳細(xì)統(tǒng)計(jì).結(jié)果發(fā)現(xiàn),iph1-1,iph1-2突變體的結(jié)實(shí)率、穗長(zhǎng)以及倒1節(jié)(即第5節(jié))節(jié)長(zhǎng)較野生型差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2e至2g),iph1-1突變體的第4節(jié)節(jié)長(zhǎng)較野生型顯著增加,iph1-2突變體的第3節(jié)節(jié)長(zhǎng)較野生型顯著增加,iph1-1和iph1-2突變體位于莖基部的第1節(jié)和第2節(jié)節(jié)長(zhǎng)較野生型均顯著增加(圖2c,2h至2k).該結(jié)果表明突變體株高變高主要由莖基部節(jié)長(zhǎng)變化所致．

2.3 生物信息學(xué)分析

通過NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲取IPH1的結(jié)構(gòu)域信息,發(fā)現(xiàn)IPH1是一個(gè)過氧化物酶基因,在氨基酸第36～120區(qū)間內(nèi)含有1個(gè)分泌型過氧化物酶(secretory peroxidase)結(jié)構(gòu)域,屬于第Ⅲ類過氧化物酶家族(圖3a); 同時(shí)也獲得了IPH1蛋白在其他物種的同源蛋白序列,將其保存為FASTA文件格式,根據(jù)貝葉斯最低分準(zhǔn)則,利用MEGA5軟件的Neighbor-joining方法構(gòu)建進(jìn)化樹,分析發(fā)現(xiàn)IPH1編碼的蛋白獨(dú)立于一個(gè)分支,具有高度保守性(圖3b)．

圖3 IPH1結(jié)構(gòu)域及進(jìn)化分析

2.4 表達(dá)模式及亞細(xì)胞定位分析

為了確定IPH1基因在水稻各組織中的表達(dá)情況,我們以野生型根、莖、葉、鞘和穗的cDNA作為模板,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量表達(dá)分析.結(jié)果顯示IPH1轉(zhuǎn)錄本在不同部位均有表達(dá)(圖4a),其中在莖和鞘中有較高表達(dá)．

IPH1蛋白屬于第Ⅲ類過氧化物酶家族蛋白,為了探究IPH1在細(xì)胞內(nèi)部細(xì)胞器的定位情況,將CaMV35S-IPH1-GFP融合蛋白及過氧化物酶體CaMV35S-PTS1-mCherry 融合蛋白共同轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體,同時(shí)將轉(zhuǎn)化含CaMV35S-GFP的空載體pAN580作為對(duì)照,28 ℃避光過夜培養(yǎng)18 h,利用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光信號(hào).結(jié)果發(fā)現(xiàn)大部分綠色熒光都能與紅色熒光重疊(圖4b),表明IPH1主要定位于過氧化物酶體中．

圖4 表達(dá)模式和亞細(xì)胞定位

2.5 過氧化物酶活性及H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)分析

IPH1編碼1個(gè)Ⅲ類過氧化物酶,但I(xiàn)PH1是否影響過氧化物酶的活性和H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)尚不清楚,因此,采用分光光度法測(cè)定野生型及iph1突變體植株中的過氧化物酶活性和H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù).結(jié)果顯示,iph1突變體的過氧化物酶活性顯著降低,H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著增加(圖5)．

*表示p<0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．圖5 過氧化物酶活性及H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

3 討論

3.1 IPH1編碼1個(gè)含有分泌型過氧化物酶結(jié)構(gòu)域的新基因

IPH1是位于水稻第12染色體上的一個(gè)新基因,目前還未見其生物學(xué)功能的相關(guān)報(bào)道.蛋白序列分析發(fā)現(xiàn)IPH1包含1個(gè)分泌型過氧化物酶結(jié)構(gòu)域,屬于第Ⅲ類過氧化物酶(Class Ⅲ peroxidases,CⅢ PRXs)家族.CⅢ PRXs作為一類植物特異性氧化還原酶參與植物激素的分解代謝、木質(zhì)素的生物合成、細(xì)胞伸長(zhǎng)和病原菌防御等多種生物學(xué)過程[18],水稻和擬南芥中CⅢ PRXs家族成員分別有138個(gè)和73個(gè)[21].目前在水稻中對(duì)CⅢ PRXs家族基因的功能研究較少,僅有1個(gè)家族基因OsPRX30被報(bào)道.該基因編碼1個(gè)主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的過氧化物酶前體蛋白,對(duì)細(xì)菌性黃單胞菌有反應(yīng),過表達(dá)OsPRX30會(huì)維持高水平的過氧化物酶(POD)活性和降低過氧化氫質(zhì)量分?jǐn)?shù),從而增強(qiáng)植物對(duì)白葉枯病的敏感性.進(jìn)一步研究揭示含有AT-hook結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子OsATH1通過調(diào)節(jié)OsPRX30啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)的組蛋白H3乙酰化水平進(jìn)而調(diào)節(jié)OsPRX30表達(dá),通過調(diào)控過氧化物酶體活性與ROS量調(diào)控白葉枯病抗性[30].本研究中,IPH1蛋白主要定位于過氧化物酶體內(nèi),在根、莖、葉、鞘、穗中均有表達(dá),且在莖和鞘中表達(dá)相對(duì)較高．

3.2 IPH1可能通過過氧化氫途徑調(diào)控水稻株高

水稻株高是非常重要的一個(gè)農(nóng)藝性狀,對(duì)抗倒伏及生物量的產(chǎn)生具有重要意義.株高受到植物激素、細(xì)胞周期、細(xì)胞壁合成、表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄因子以及光照、溫度等多重因素的影響.如SD1,EUI1,D35/OsKO2,SLR1,GID1等通過調(diào)控赤霉素的合成及信號(hào)傳導(dǎo)等調(diào)控細(xì)胞分裂或細(xì)胞伸長(zhǎng)[3-6,8-9].BRD1,BRD2,D2,BRI1和BZR1通過參與油菜素內(nèi)酯的生物合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控水稻株高[12-16].此外,一些基因的異常表達(dá)也會(huì)影響株高,OsCD1,BC12,OsGLP1等影響水稻細(xì)胞伸長(zhǎng)或分裂的基因異常表達(dá),導(dǎo)致產(chǎn)生矮化或半矮化表型[31-33].本研究中,鑒定到1個(gè)編碼Ⅲ類過氧化物酶的基因IPH1影響水稻株高.有關(guān)CⅢ PRXs調(diào)節(jié)植物株高的報(bào)道相對(duì)有限,小麥新型矮桿突變體Rht-B13b中CⅢ PRXs在擴(kuò)張組織中表達(dá)顯著上調(diào),CⅢ PRXs可以使用H2O2增加細(xì)胞壁交聯(lián),從而導(dǎo)致細(xì)胞擴(kuò)增和生長(zhǎng)減少,最終使得植株表現(xiàn)為矮化表型[34].本研究中,CⅢ PRXs家族基因IPH1不同方式的突變均導(dǎo)致植株高度增加; 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),iph1突變體中過氧化物酶活性降低,而H2O2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著增加,因此IPH1可能通過過氧化氫途徑調(diào)控水稻株高的形成,但是具體的分子作用機(jī)理仍需進(jìn)一步研究．

4 結(jié)論

本研究鑒定了1個(gè)在粳稻中花11背景下敲除的第Ⅲ類過氧化物酶家族突變體iph1.與野生型相比,兩種突變方式的iph1突變體株高變高的表型能夠穩(wěn)定遺傳; 進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)也發(fā)現(xiàn)iph1突變體的第1節(jié)和第2節(jié)節(jié)長(zhǎng)較野生型顯著增加.生物信息學(xué)分析表明,IPH1基因包含1個(gè)分泌型過氧化物酶結(jié)構(gòu)域,利用同源蛋白序列進(jìn)行進(jìn)化樹分析,結(jié)果顯示IPH1獨(dú)立于1個(gè)分枝,具有高度保守性.IPH1基因在各個(gè)組織中均有表達(dá)且在莖稈中表達(dá)相對(duì)較高,可能基因在表達(dá)水平上會(huì)影響表型,亞細(xì)胞定位表明該蛋白主要定位于過氧化物酶體中.生理分析發(fā)現(xiàn)突變體過氧化物酶活性降低,H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加.本研究為深入了解水稻株高遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了基因資源,并進(jìn)一步豐富了株高相關(guān)的生物育種材料．

致謝: 感謝西南大學(xué)徐凡老師在材料創(chuàng)制上給予的幫助．