傳統(tǒng)發(fā)酵食品中基于微生物多樣性的生物胺形成研究進(jìn)展

隋雨萌，王慧平，劉嘉琪，孔保華，秦立剛，陳 倩,

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

傳統(tǒng)發(fā)酵食品歷史悠久、種類繁多，因其豐富的營(yíng)養(yǎng)和獨(dú)特的風(fēng)味深受人們喜愛，例如東北酸菜、黃豆醬、奶酪、魚露和發(fā)酵香腸等。傳統(tǒng)發(fā)酵食品基質(zhì)成分復(fù)雜，參與發(fā)酵的微生物種類繁多，代謝途徑多樣，在產(chǎn)生特征風(fēng)味的同時(shí)也存在多種潛在的危害因子，影響最終產(chǎn)品的質(zhì)量特性與安全性[1-2]。其中，生物胺（BAs）是發(fā)酵食品中較為常見的一種危害因子。發(fā)酵食品中的BAs 一部分來源于食品原料本身，另一部分來源于發(fā)酵過程中產(chǎn)生的BAs，并且其形成與微生物的代謝密切相關(guān)[3]。因此明確發(fā)酵食品中微生物多樣性及其與BAs 形成之間的關(guān)系，對(duì)提高傳統(tǒng)發(fā)酵食品的安全性具有重要意義。

近年來，隨著分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的快速發(fā)展，關(guān)于傳統(tǒng)發(fā)酵食品，如發(fā)酵蔬菜、發(fā)酵豆制品、發(fā)酵乳制品、發(fā)酵肉制品和發(fā)酵水產(chǎn)品等中微生物多樣性的研究日趨增多，并且其與BAs 之間關(guān)系也得到了廣泛研究。張杰等[4]研究發(fā)現(xiàn)四川泡菜表面的微生物，腸桿菌、乳酸菌、酵母菌和霉菌等具有氨基酸脫羧酶活性能夠產(chǎn)生BAs。羅璇等[5]研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵豆制品中假單胞菌具有產(chǎn)生腐胺、酪胺和尸胺的能力。Suvajd?i?等[6]研究發(fā)現(xiàn)低溫發(fā)酵香腸中乳酸菌、腸球菌和假單胞菌具有脫羧酶活性，是產(chǎn)生酪胺、腐胺、尸胺的主要微生物。白妞妞等[7]研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌、腸桿菌和球菌是魚露中主要產(chǎn)胺菌。這些研究對(duì)了解發(fā)酵食品中BAs 形成途徑及機(jī)理、以及對(duì)微生物產(chǎn)生BAs 進(jìn)行有效控制提供了基礎(chǔ)[8]。因此，本文以上述典型傳統(tǒng)發(fā)酵食品為對(duì)象，綜述了各類發(fā)酵食品中微生物多樣性與BAs 形成的關(guān)系，旨在為有效控制BAs 含量，提升傳統(tǒng)發(fā)酵食品品質(zhì)及安全性提供理論依據(jù)。

1 發(fā)酵食品中BAs 的概述

1.1 BAs 的種類

BAs 是一種低分子量的含氮有機(jī)化合物，主要是由氨基酸脫羧或醛酮的轉(zhuǎn)氨作用形成[9]。根據(jù)其含氨量，可分為單胺、二胺和多胺。單胺包括組胺、酪胺和色胺，二胺包括尸胺和腐胺，多胺包括精胺和亞精胺。另外，根據(jù)BAs 的化學(xué)結(jié)構(gòu)，又可分為脂肪類胺（腐胺、尸胺、精胺和亞精胺）、芳香類胺（酪胺和苯乙胺）和雜環(huán)類胺（組胺和色胺）[10-11]。發(fā)酵食品中常見的八種BAs 化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1 所示。

圖1 常見的BAs 結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of common biogenic amines

1.2 BAs 的來源及形成途徑

發(fā)酵食品中的BAs 源于食品原料以及發(fā)酵過程，其形成途徑有兩種（見圖2）：一是醛、酮通過氨基化和轉(zhuǎn)胺作用產(chǎn)生；二是游離氨基酸通過脫羧反應(yīng)產(chǎn)生[12]，在發(fā)酵食品中，BAs 主要通過第二種途徑形成。該途徑需要滿足三個(gè)條件：一是具有氨基酸脫羧活性的微生物；二是發(fā)酵食品體系中含有充足的游離氨基酸；三是有適合微生物生長(zhǎng)及脫羧酶活性的環(huán)境條件[13-14]。因此，富含蛋白質(zhì)和游離氨基酸的發(fā)酵水產(chǎn)品、肉制品、乳制品及豆制品中BAs 含量較高[15]。例如，腐乳（68.5～1084.0 mg/kg）[16]、酸魚（97.82～161.2 mg/kg）[17]和香腸（335.76～1267.13 mg/kg）[18]等發(fā)酵制品中都含有大量的BAs。

圖2 BAs 形成途徑Fig.2 Pathways of biogenic amine formation

1.3 BAs 毒性及限量要求

通常攝入少量的BAs 不會(huì)影響人體健康，BAs可被人體腸道內(nèi)的氨基氧化酶（如單胺氧化酶，二胺氧化酶和組胺甲基轉(zhuǎn)移酶）降解[19]；然而，攝入含BAs 較高的食物或人體解毒能力受到抑制或干擾時(shí)，BAs 會(huì)對(duì)人健康造成嚴(yán)重的影響[20]。被歐洲食品安全局（EFSA）關(guān)注的BAs 主要包括組胺和酪胺，高濃度會(huì)導(dǎo)致高血壓、頭痛、心悸和嘔吐[21]。另外，BAs 的毒性隨個(gè)體敏感程度而異，其敏感程度隨BAs 積累而增加[22]。此外，BAs 的毒性也有協(xié)同作用，如二胺和多胺同時(shí)存在時(shí)會(huì)抑制單胺降解，增加毒性，引發(fā)人體中毒[23]。

目前，國(guó)際上關(guān)于食品中BAs 的限量并沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，各國(guó)分別根據(jù)本國(guó)的法律法規(guī)制定相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)，且大多數(shù)法律法規(guī)只對(duì)食品中組胺的含量進(jìn)行限定。我國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（高組胺類）組胺含量≤40 mg/100 g（GB 10136-2015 動(dòng)物性水產(chǎn)制品）；鹽漬魚（不含高組胺魚類）組胺含量≤20 mg/100 g（GB 10136-2015 動(dòng)物性水產(chǎn)制品）。美國(guó)對(duì)金槍魚及相關(guān)魚類組胺干預(yù)水平為50 mg/kg，對(duì)酪胺和苯乙胺的安全閾值上限分別為100～800 mg/kg 和30 mg/kg[24]。歐盟食品微生物標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定魚類制品中組胺含量明確限定為100 mg/kg，但其他食物中的BAs 限量只有推薦標(biāo)準(zhǔn)，無強(qiáng)制規(guī)定[25]。

2 傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物多樣性及其與BAs形成的關(guān)系

傳統(tǒng)發(fā)酵食品多依賴于原輔料和環(huán)境中的微生物來實(shí)現(xiàn)其發(fā)酵，由于自然發(fā)酵工藝的開放性與粗放性，導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)品中的微生物群落具有高度的多樣性和復(fù)雜性[26]。傳統(tǒng)發(fā)酵食品中以乳酸菌、葡萄球菌和鏈球菌為代表的細(xì)菌和以霉菌和酵母菌為代表的真菌是參與發(fā)酵的核心菌群，它們的代謝作用對(duì)發(fā)酵品質(zhì)形成以及BAs 的形成和控制都有著重要影響[27]。發(fā)酵食品中微生物主要通過調(diào)控碳水化合物代謝和氨基酸代謝過程來影響產(chǎn)品的品質(zhì)，其中與BAs 形成密切相關(guān)的代謝為氨基酸代謝[28]。腐胺可以在微生物的胍基丁酶或鳥氨酸脫羧酶途徑下合成；亞精胺在亞精胺合酶下合成或羧基亞精胺在羧基精胺脫羧作用下生成；組胺可以在微生物的組氨酸脫羧酶途徑下合成；尸胺可以在微生物的酪氨酸脫羧酶途徑下合成；色胺可以在微生物的色胺酸脫羧酶途徑下合成[28-30]。因此，明確傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物的組成，對(duì)有效控制產(chǎn)胺微生物的生長(zhǎng)、減少BAs 的積累，保證產(chǎn)品的品質(zhì)和安全性至關(guān)重要[31]。表1 總結(jié)了傳統(tǒng)發(fā)酵食品中與BAs 形成密切相關(guān)的微生物。

表1 傳統(tǒng)發(fā)酵食品中與生物胺形成有關(guān)的微生物Table 1 Microorganisms related to biogenic amine formation in fermented foods

2.1 發(fā)酵蔬菜

發(fā)酵蔬菜主要包括酸菜、泡菜和榨菜等，相較于富含蛋白質(zhì)的發(fā)酵食品，其BAs 含量（40.57～692.82 mg/kg）相對(duì)較低[51]。東北酸菜是一種以中國(guó)卷心菜為原料的傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜，Ye 等[32]將植物乳桿菌SC-5 接種到發(fā)酵酸菜中，通過Spearman 相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌SC-5 與酸菜中BAs 的含量呈負(fù)相關(guān)，這可能是由于接種植物乳桿菌后干擾了酸菜中微生物多樣性，使發(fā)酵過程中產(chǎn)胺微生物豐度降低，從而降低了BAs 的含量。泡菜是一種以新鮮蔬菜為原料的傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜的總稱，Young 等[51]在韓國(guó)蘿卜泡菜中檢測(cè)出了組胺、腐胺、尸胺和酪胺，并分離出了可產(chǎn)生酪胺的乳酸菌，通過16S rDNA 測(cè)序確定該菌株為短鏈乳桿菌。Dabade 等[52]研究發(fā)現(xiàn)泡菜在發(fā)酵過程中尸胺與乳酸菌呈正相關(guān)，腐胺與總需氧菌呈正相關(guān)，苯乙胺與腸球菌呈正相關(guān)。榨菜是一種以塊莖芥菜為原料的傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜，Zhang 等[33]研究發(fā)現(xiàn)在榨菜發(fā)酵過程中乳酸菌豐度與酪胺、腐胺和組胺含量呈正相關(guān)，乳酸菌作為優(yōu)勢(shì)菌屬可降解原料中的蛋白產(chǎn)生游離氨基酸，在氨基酸脫羧酶作用下促進(jìn)BAs 形成。除乳酸菌外，其他微生物也會(huì)影響發(fā)酵蔬菜中BAs 的形成，如Kung 等[53]研究發(fā)現(xiàn)中國(guó)臺(tái)灣榨菜中的頭狀葡萄球菌、巴氏葡萄球菌、陰溝腸桿菌，光滑假絲酵母和褶皺假絲酵母與組胺形成密切相關(guān)。綜上，乳酸菌是發(fā)酵蔬菜中的主要微生物，對(duì)BAs 的形成及抑制具有菌株特異性。

2.2 發(fā)酵豆制品

傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品主要包括豆醬、腐乳、醬油和臭豆腐等，它們含有豐富的大豆多肽、大豆異黃酮、γ-氨基丁酸等有功能成分[54-55]。Yu 等[39]以東北地區(qū)農(nóng)家黃豆醬為研究對(duì)象，確定了四聯(lián)球菌屬，乳酸菌，乳桿菌屬，魏斯氏菌屬，腸球菌屬，鏈球菌屬和白串珠菌屬是豆醬發(fā)酵過程中的優(yōu)勢(shì)菌屬，其中腸球菌屬，乳桿菌屬和鏈球菌屬與BAs 呈正相關(guān)，在黃豆醬發(fā)酵過程中檢測(cè)到乳酸菌和乳酸球菌存在氨基酸脫羧酶基因，說明這兩種菌促進(jìn)了發(fā)酵過程中BAs 的積累。李東蕊[56]研究了豆瓣醬在發(fā)酵過程中BAs 生成規(guī)律及微生物多樣性，結(jié)果表明豆瓣醬總BAs 和腐胺與芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、魏斯氏菌屬和阪崎腸桿菌屬呈正相關(guān)；亞精胺和色胺與乳球菌和泛菌屬呈正相關(guān)；精胺與曲霉菌屬、明串珠菌屬和葡萄球菌屬呈正相關(guān)。Jeon 等[57]研究發(fā)現(xiàn)組胺、酪胺和苯乙胺是Cheonggukjang（一種韓國(guó)豆醬）中的主要BAs，且芽孢桿菌和腸球菌與酪胺呈正相關(guān)。王維亞等[16]研究發(fā)現(xiàn)腐乳中的魏斯氏菌屬、芽孢桿菌屬和賴氨酸芽孢桿菌屬與BAs 呈正相關(guān)；不動(dòng)桿菌屬、叢毛單胞菌屬和四聯(lián)球菌屬與BAs 呈負(fù)相關(guān)。Kim 等[58]采用宏基因組和宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法，對(duì)韓國(guó)傳統(tǒng)醬油發(fā)酵過程中產(chǎn)生BAs 的微生物進(jìn)行了研究，結(jié)果表明芽孢桿菌和腸球菌含有色氨酸脫羧酶基因，具有產(chǎn)生色胺的能力；四聯(lián)球菌中含有賴氨酸脫羧酶和組氨酸脫羧酶基因，具有產(chǎn)生尸胺和組胺的能力；同時(shí)，根據(jù)醬油中產(chǎn)生BAs 脫羧酶基因的相對(duì)豐度發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌和鹽單胞菌與腐胺呈正相關(guān)。Gu 等[59]研究發(fā)現(xiàn)普雷沃菌屬、乳桿菌屬、鹽單胞菌屬和克里斯滕森氏菌屬是臭豆腐的主要菌屬，酪胺、腐胺和尸胺是臭豆腐中的主要BAs，偏最小二乘法來分析表明穩(wěn)桿菌屬、漫游球菌屬和腸球菌與組胺呈正相關(guān)，四聯(lián)球菌屬、芽孢桿菌、葡萄球菌和小細(xì)菌屬與亞精胺和酪胺呈正相關(guān)。綜上，四聯(lián)球菌、乳桿菌、腸桿菌、芽孢桿菌和乳酸桿菌等為發(fā)酵豆制品中的主要產(chǎn)胺菌。

2.3 發(fā)酵乳制品

發(fā)酵乳制品主要包括奶酪、酸奶、開菲爾、奶酒等，關(guān)于BAs 的研究多集中于奶酪。奶酪中高濃度的酪胺會(huì)導(dǎo)致人體中毒，也就是人們常說的“奶酪反應(yīng)”[60]。Radka 等研究發(fā)現(xiàn)荷蘭干酪成熟過程中的耐久腸球菌、糞腸球菌、屎腸球菌、鉛黃腸球菌、彎曲乳桿菌、乳酸乳桿菌和瑞士乳桿菌含有組胺脫羧酶基因，并且瑞士乳桿菌含有酪胺脫羧酶基因，說明干酪中組胺和酪胺主要由上述微生物產(chǎn)生。Guarcello等[61]研究發(fā)現(xiàn)意大利南部奶酪中尸胺與嗜中溫乳球菌呈正相關(guān)，該乳球菌能夠通過對(duì)賴氨酸脫羧產(chǎn)生尸胺。Pintado 等[42]研究發(fā)現(xiàn)不同原料奶生產(chǎn)的葡萄牙奶酪中BAs 含量與微生物數(shù)量呈正相關(guān)，腸球菌與苯乙胺呈正相關(guān)，乳球菌與尸胺、酪胺呈正相關(guān)；此外，其中的酵母菌具有較強(qiáng)的蛋白水解活性，為BAs 的形成提供游離氨基酸，一定程度上促進(jìn)了BAs 的形成。腐胺是發(fā)酵乳制品中較為常見的BAs之一，它主要通過精氨酸脫羧生成胍丁胺，然后通過胍丁胺脫氨酶（AGDI）途徑進(jìn)一步脫氨基形成，許多乳酸菌（包括短乳桿菌、彎曲乳桿菌、乳酸乳球菌等）已被證實(shí)可通過AGDI 途徑產(chǎn)生并積累腐胺[62-63]。宋雪梅等[64]研究表明牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟過程中的主要BAs 為腐胺、苯乙胺、酪胺、組胺和尸胺，優(yōu)勢(shì)菌屬為鏈球菌屬、明串珠菌屬、乳桿菌屬、拉烏爾菌屬、不動(dòng)桿菌屬、假單胞菌屬和腸桿菌屬等，這些微生物在干酪成熟過程中產(chǎn)生大量游離氨基酸，可能會(huì)促進(jìn)耗牛硬質(zhì)干酪中BAs 的形成。綜上，酪胺和腐胺是干酪中的主要BAs，腸球菌、腸桿菌、乳球菌和乳桿菌是主要產(chǎn)胺菌。

2.4 發(fā)酵肉制品

發(fā)酵肉制品主要包括發(fā)酵香腸和臘肉，其蛋白質(zhì)和游離氨基酸含量較高、微生物種類豐富，極易造成BAs 的積累[65]。吳雙慧等[28]研究發(fā)現(xiàn)羊肉發(fā)酵香腸中明串珠菌屬、假交替單胞菌屬、弧菌屬、發(fā)光桿菌屬和希瓦氏菌屬與尸胺呈正相關(guān)；假交替單胞菌屬和發(fā)光桿菌屬與酪胺呈正相關(guān)；葡萄球菌屬和鏈球菌屬與色胺呈正相關(guān)。劉雨萱等[66]研究發(fā)現(xiàn)市售四川臘肉中葡萄球菌、微球菌數(shù)與肥肉中組胺、腐胺呈負(fù)相關(guān)；乳酸桿菌與肥肉中腐胺呈負(fù)相關(guān)；霉菌、酵母與瘦肉中總生物胺含量呈正相關(guān)，與肥肉中組胺、腐胺含量呈負(fù)相關(guān)。Santiyanont 等[67]研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌、乳球菌、片球菌和魏斯氏菌是泰國(guó)發(fā)酵豬肉制品（nham）中的主要菌屬，魏斯氏菌與總BAs 含量呈負(fù)相關(guān)，這可能是魏斯氏菌通過產(chǎn)生細(xì)菌素和有機(jī)酸等物質(zhì)、或通過營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)抑制了產(chǎn)胺微生物生長(zhǎng)，使BAs 含量降低，Lebeert 等[68]研究發(fā)現(xiàn)法國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵干香腸中乳酸菌和腸球菌與酪胺呈正相關(guān)，葡萄球菌和腸桿菌與總BAs 含量呈負(fù)相關(guān)。綜上，乳酸菌、葡萄球菌、假單胞菌和魏斯氏菌是發(fā)酵肉制品中產(chǎn)胺的核心菌。

2.5 發(fā)酵水產(chǎn)品

以魚露、蝦醬等為代表的發(fā)酵水產(chǎn)品因其獨(dú)特的風(fēng)味和口感深受人們喜愛。因水產(chǎn)品原料易發(fā)生自溶、初始細(xì)菌含量較高，通常比其他發(fā)酵食品更容易造成BAs 的積累，因此，關(guān)于發(fā)酵水產(chǎn)品中BAs的研究一直是人們關(guān)注的重點(diǎn)[69]。魚露是我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品之一，在魚露發(fā)酵初始階段假單胞菌屬、變形桿菌屬和普羅威登斯菌屬與亞精胺和精胺含量呈負(fù)相關(guān)[70]。王悅齊等[71]研究發(fā)現(xiàn)魚露發(fā)酵過程中鹽厭氧菌屬與腐胺呈正相關(guān)，在魚露發(fā)酵后期鹽單胞菌屬與BAs 呈負(fù)相關(guān)。蝦醬是我國(guó)著名的傳統(tǒng)發(fā)酵水產(chǎn)品，其中四球菌屬、乳酸菌屬、曲霉菌和未分類真菌屬為優(yōu)勢(shì)微生物菌屬，并且大部分菌屬與BAs含量呈一定的相關(guān)性，如：乳球菌與尸胺、腐胺和酪胺呈正相關(guān)；革球菌與苯乙胺、組胺和酪胺呈正相關(guān)；八疊球菌和卡他莫拉菌與腐胺、尸胺、組胺和酪胺呈負(fù)相關(guān)[72]。Li 等[73]研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵蝦醬中四鏈球菌與色胺、組胺和酪胺呈正相關(guān)；乳酸菌與腐胺和尸胺呈正相關(guān)；鹽厭氧菌屬與腐胺、尸胺和組胺呈正相關(guān)，與苯乙胺呈負(fù)相關(guān)。Zhao 等[74]研究發(fā)現(xiàn)腐胺、苯乙胺、精胺、尸胺、組胺和酪胺是羅非魚發(fā)酵香腸中的主要BAs，其中，組胺、腐胺、酪胺、精胺和苯乙胺與片球菌呈正相關(guān)；腐胺、尸胺和組胺與腸桿菌屬和檸檬酸桿菌屬呈正相關(guān)；酪胺和腐胺與腸球菌呈正相關(guān)。綜上，四鏈球菌、乳酸菌、假單胞菌、腸球菌和腸桿菌是發(fā)酵水產(chǎn)品中產(chǎn)胺的核心菌。

3 結(jié)論

傳統(tǒng)發(fā)酵食品是一個(gè)極其復(fù)雜的微生物體系，其中豐富的游離氨基酸以及復(fù)雜的微生物結(jié)構(gòu)是其中BAs 形成和積累的主要原因，并且環(huán)境-微生物、微生物-微生物間的相互作用對(duì)微生物組成及BAs形成影響甚大。因此，深入了解微生物多樣性與BAs 形成之間的關(guān)系，才能有效地實(shí)現(xiàn)產(chǎn)胺菌種確定及抑制、降胺菌種的篩選及應(yīng)用。并且圍繞降胺菌株展開相關(guān)研究，揭示基于胺氧化酶、脫氫氧化酶和多酮氧化酶等降胺酶的BAs 降解機(jī)制，通過宏基因組技術(shù)明確BAs 降解途徑、挖掘?qū)到釨As 起決定作用的基因，運(yùn)用基因克隆、基因過表達(dá)等分子生物學(xué)技術(shù)，構(gòu)建更加安全和高效的降胺菌株。