烯丙基活化制備大孔強陽離子交換介質(zhì)及其在蛋白分離中的應用

關(guān)鍵詞強陽離子交換層析介質(zhì)；烯丙基活化；配基密度；吸附性能；分離純化

隨著生物制藥技術(shù)的發(fā)展，生物制品的制備規(guī)模越來越大，對高通量分離純化的需求越來越多。層析技術(shù)由于其易放大、操作溫和而逐漸成為主流技術(shù)之一。其中，離子交換色譜（IEC）具有良好的生物相容性和溫和的洗脫模式，并且能夠在分離過程中最大限度地保持生物分子的活性，因而在蛋白質(zhì)類藥物的分離純化過程中得到了廣泛應用[1-3]。離子交換介質(zhì)的性能常決定其分離純化工藝的優(yōu)劣，目前以多糖為基質(zhì)的層析介質(zhì)應用較多，然而這類介質(zhì)本身質(zhì)地軟的性質(zhì)（耐壓小于0.3MPa）限制了其在高通量分離過程中的應用。聚合物基質(zhì)具有機械強度高、表面化學性質(zhì)易控制等特點，因此以該類基質(zhì)制備的層析介質(zhì)備受關(guān)注[4-5]。

烯丙基活化是制備陽離子交換介質(zhì)的常用方法。該方法采用烯丙基溴化物或烯丙基縮水甘油醚對基質(zhì)進行活化，溴化物或縮水甘油酯基在堿性環(huán)境下與基質(zhì)發(fā)生反應，而相對惰性的烯丙基一端不參與反應，然后利用烯丙基的不飽和化學鍵進一步衍生其它功能單體。該方法通常在水溶液中進行，其活化試劑（烯丙基溴化物或烯丙基縮水甘油醚）廉價易得，鍵合配體不易脫落，因而被廣泛應用。Burton等[6]采用烯丙基活化的方法制備了一種混合模式介質(zhì)，該介質(zhì)對乳糜蛋白的吸附可取代高配基密度的無水碳基二咪唑介質(zhì)。他們在另一項工作中[7]采用自由基加成的方式制備基質(zhì)，并以烯丙基對其活化，制備了陽離子交換介質(zhì)和親和介質(zhì)。烯丙基活化法多用于瓊脂糖基質(zhì)的層析介質(zhì)制備中，而用于聚合物基質(zhì)層析介質(zhì)的制備方法的研究較少。

本研究采用大孔聚甲基丙烯酸酯類微球為基質(zhì)制備了一種強陽離子交換介質(zhì)，其基質(zhì)微球富含環(huán)氧基團且易親水改性和功能衍生，同時其大孔結(jié)構(gòu)有利于實現(xiàn)高通量分離[8]。聚丙烯酸酯類微球作為聚合物層析介質(zhì)基質(zhì)的優(yōu)勢在于其表面親水性較好，同時相比于瓊脂糖凝膠基質(zhì)具有較高的機械械強度（可耐受壓力達到1MPa以上）[9]。采用烯丙基活化方法，以烯丙基縮水甘油醚為活化試劑，偶聯(lián)小分子配基偏重亞硫酸鈉，制備得到大孔強陽離子交換介質(zhì)，對烯丙基活化條件進行了優(yōu)化，對配基密度的影響因素進行了系統(tǒng)考察，對不同配基密度的介質(zhì)進行了性能評價，并將其用于模型分子溶菌酶的分離純化。本研究為大孔強陽離子交換介質(zhì)的設計和應用提供了理論借鑒。

1實驗部分

1.1儀器與試劑

L5紫外可見分光光度計（上海儀電公司）；SHA-BA水浴恒溫振蕩器（金壇榮華公司）；EM-30plus臺式掃描電子顯微鏡（韓國COXEM公司）；PPS-100蛋白純化系統(tǒng)（蘇州中科森輝公司）。

聚甲基丙烯酸縮水甘油酯與乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚大孔微球（PGMA-EDMA，北京博爾賽譜生物科技有限公司）；Na2S2O5和NaOH（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；烯丙基縮水甘油醚（AGE，分析純）和溶菌酶（Lys，來源于雞蛋清）（北京華威銳科化工有限公司）。其它試劑均為國產(chǎn)分析純試劑；實驗用水為去離子水。

1.2大孔強陽離子交換介質(zhì)的制備

制備路線如圖1所示，共分三步。第一步反應是在酸性條件下，將PGMA-EDMA微球的環(huán)氧基水解為鄰羥基。第二步進行烯丙基活化[10]，具體過程如下：（1）將50g抽干的PGMA-EDMA微球加入到150mL0.5mol/L的H2SO4溶液中，置于50℃搖床上反應15h，制得水解完全的微球，以去離子水反復沖洗至中性，烘干備用；（2）將3g水解微球加入到裝有5mLNaOH（50%，m/V）的具塞錐形瓶內(nèi)，再加入9mLAGE，搖勻，抽真空10min，在70℃水浴搖床上隔絕空氣反應18h，反應結(jié)束后，先用去離子水洗滌多次，然后用乙醇清洗至無乳白色液體，抽干即得烯丙基活化的微球。第三步反應是氧化所得烯丙基為磺酸基團，將3g抽干的烯丙基活化的微球和10mL1.5mol/L的Na2S2O5溶液加入到錐形瓶中，置于35℃空氣搖床上反應24h后，用去離子水清洗，再用砂芯漏斗抽干，即得大孔強陽離子交換介質(zhì)。

1.3烯丙基密度測定實驗

烯丙基密度的測定參考文獻[11]的方法，計算公式如下：

其中，Q為烯丙基密度（mmol/g）；C0為Na2S2O3標準溶液的濃度（mol/L）；V0為滴定空白組所消耗的Na2S2O3標準溶液的量（mL）；V為滴定微球所消耗的Na2S2O3標準溶液的量（mL）；m為所取烯丙基活化微球的質(zhì)量（g）。

1.4配基密度測定實驗

配基密度的測定根據(jù)文獻[12]的方法，采用酸堿滴定法測定，計算公式如下：

其中，N為離子交換容量（mol/L）；N1為NaOH溶液濃度（mol/L）；N2為HCl溶液濃度（mol/L）；V1為所用NaOH溶液體積（mL）；V2為滴定時所需HCl溶液體積（mL）；V3為滴定微球體積（mL）。

1.5靜態(tài)載量（SBC）測定

緩沖液為20mmol/L磷酸鹽緩沖液（PB，pH=7.0；如無特殊說明，以下測試所用緩沖液皆為此溶液），模型蛋白為溶菌酶，吸附時間為6h，使用紫外可見分光光度計測量溶液在280nm波長處的紫外吸收，通過外標法計算出其對應的溶菌酶濃度C1。

其中，QSBC為單位體積介質(zhì)靜態(tài)結(jié)合蛋白載量（g/L）；C1為吸附后的蛋白濃度（g/L）；C2為吸附前的蛋白濃度（g/L）；V3為加入蛋白體積（mL）；V4為所用介質(zhì)體積（mL）。

1.6動態(tài)載量及回收率測定

動態(tài)載量及回收率均采用PPS蛋白純化系統(tǒng)進行測定。1mL層析柱（?7mm×2.5cm）用自制介質(zhì)裝填，緩沖液為20mmol/LPB（pH=7.0），蛋白溶液為1g/L溶菌酶，洗脫液為含0.5mol/LNaCl的PB溶液，再生液為0.5mol/LNaOH，動態(tài)載量以10%流穿作為標準?；厥章视嬎愎饺缦拢?/p>

其中，R為蛋白回收率（%）；A0為空載蛋白峰面積（即未連接色譜柱測定蛋白峰面積，作為100%回收標準）；A1為洗脫蛋白峰面積。

1.7雞蛋清中溶菌酶的分離

采用自制介質(zhì)對雞蛋清中的溶菌酶進行分離并用凝膠電泳對其純度進行測試，緩沖液為pH=8.0的20mmol/L的PB，洗脫液為含1mol/LNaCl的PB，采用5mL層析柱，以5倍柱體積上樣，上樣和洗脫流速均為1mL/min，采用等度洗脫。

2結(jié)果與討論

2.1微球形貌的表征

層析介質(zhì)的結(jié)構(gòu)對其色譜性能有重要影響。對制得的強陽離子交換層析介質(zhì)的表面形貌進行觀察。采用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察了改性前微球（Ⅰ）和改性后微球（Ⅳ）的形貌，如圖2所示。微球經(jīng)改性后，骨架尺寸明顯變粗，表明烯丙基活化反應影響孔道內(nèi)部結(jié)構(gòu)。烯丙基的密度直接影響生物大分子在微球內(nèi)部的傳輸，微球表面形貌顯示，經(jīng)過改性后得到的介質(zhì)仍然具有豐富的大孔結(jié)構(gòu)，孔徑可達到1000nm，為實現(xiàn)蛋白快速傳質(zhì)奠定了基礎(chǔ)[13]。

2.2活化微球烯丙基密度的影響因素考察

水解后的PGMA-EDMA微球表面富含羥基，利用羥基與烯丙基縮水甘油醚的環(huán)氧基進行反應，在微球表面引入烯丙基，此過程中伴隨AGE水解及交聯(lián)副反應的發(fā)生[14]。烯丙基密度對下一步加成生成磺酸基（SP）有直接影響，因此需要對其影響因素進行系統(tǒng)考察。

2.2.1AGE用量對烯丙基密度的影響

考察了不同AGE用量對微球烯丙基密度的影響。結(jié)果表明，隨著AGE用量增大，烯丙基密度不斷增大；當AGE用量達到2.67mL/g時，烯丙基密度為252.08μmol/g；繼續(xù)增加AGE用量，烯丙基密度基本保持不變。這主要是由于在反應初始階段微球表面含有大量羥基，隨著AGE不斷加入，烯丙基密度逐漸增大；隨反應持續(xù)進行，羥基含量不斷減少；繼續(xù)增加AGE用量，烯丙基密度不再發(fā)生明顯變化[15]。為了保證反應完全，選擇AGE的最佳用量為3mL/g。

2.2.2反應時間對烯丙基密度的影響

在3～18h反應時間范圍內(nèi)，烯丙基密度呈上升趨勢；繼續(xù)延長反應時間，烯丙基密度基本保持不變，與文獻[16]報道的規(guī)律相似。這是因為在活化過程中，微球表面的羥基不斷被消耗，直至微球表面羥基完全被消耗，繼續(xù)延長反應時間，烯丙基密度基本不再發(fā)生變化。因此，選擇最佳反應時間為18h。

2.2.3反應溫度對烯丙基密度的影響

在30～70℃范圍內(nèi)，隨著溫度升高，烯丙基密度也隨之增大；當溫度超過70℃后，繼續(xù)升高溫度，烯丙基密度反而下降。這主要是因為升高反應溫度可以加快羥基與環(huán)氧基的偶聯(lián)反應，但AGE的水解反應也隨之增加。因此，當溫度超過70℃時，烯丙基密度隨溫度升高而減小[17]。

2.2.4NaOH溶液濃度對烯丙基密度的影響

當NaOH溶液濃度由10%（m/V）增至40%（m/V）時，烯丙基密度由97.86μmol/g增至132.74μmol/g，變化較??；但是，當NaOH溶液濃度達到50%時，烯丙基密度迅速增大至266.83μmol/g；繼續(xù)增大NaOH溶液濃度，烯丙基密度增加不明顯。出現(xiàn)這種變化趨勢的原因是NaOH作為反應的催化劑[18]，當其濃度增大到一定值時，極大地促進了微球基質(zhì)表面羥基不斷轉(zhuǎn)變成氧負離子，不斷地進攻環(huán)氧基團位阻小的碳，進而導致環(huán)氧基開環(huán)，生成帶有烯丙基的產(chǎn)物。當NaOH溶液濃度高于50%（m/V）時，微球表面剩余的反應基團較少，因此，增大NaOH溶液質(zhì)量分數(shù)并不會明顯增加烯丙基的密度。

2.3活化微球偶聯(lián)SP的影響因素考察

2.3.1Na2S2O3濃度對配基密度的影響

實驗結(jié)果表明，隨著Na2S2O3濃度增大，介質(zhì)配基密度先增大后趨于平緩；當Na2S2O3濃度為1.5mol/L時，配基密度達到最大（0.377mol/L）。通過調(diào)節(jié)Na2S2O3的濃度，可以制備具有不同配基密度的強陽離子交換介質(zhì)。本研究選擇Na2S2O3的最佳濃度為1.5mol/L。

2.3.2溶液pH對配基密度的影響

在其它反應條件相同的情況下，隨溶液pH值升高，配基密度先增大后減小，在pH=4.5時微球表面SP密度達到最大值（0.34mol/L）。這主要是由于在弱酸環(huán)境下，雙鍵與偏重亞硫酸鈉加成生成的SP與水再次加成生成醇[19]，升高pH值會促進2種加成反應同時加快。當反應體系的pHgt;4.5時，隨著pH升高，雙鍵在副反應中消耗增多，用于主反應的雙鍵減少，最終使得配基密度逐漸降低。

2.3.3反應溫度對SP密度的影響

在25～50℃反應溫度范圍內(nèi)，SP密度隨溫度升高呈先增大后減小的趨勢。當溫度低于35℃時，升高溫度有利于提高偶聯(lián)的SP密度。這是由于升溫使得主反應（生成SP反應）的反應速率大于副反應（烯丙基雙鍵的聚合和與水的加成反應）的反應速率。當反應溫度高于35℃時，不僅提高了加成生成SP的反應速率，而且由于生成SP的反應過程中不斷產(chǎn)生酸，使得雙鍵與水的加成反應的速率增大，導致反應體系中雙鍵數(shù)量減少，致使配基密度下降。因此，選擇最佳反應溫度為35℃。

2.3.4反應時間對SP密度的影響

隨著反應時間延長，配基密度呈現(xiàn)先增大后趨于穩(wěn)定的趨勢。這是由于隨著偶聯(lián)反應不斷進行，微球表面的烯丙基不斷被消耗；當反應時間達到24h后，反應達到平衡，配基密度基本不再發(fā)生變化。最終確定最佳反應時間為24h。

2.4陽離子交換介質(zhì)吸附性能的評價

配基是固定相表面連接的功能基團，是固定相與待分離物質(zhì)相互作用的位點[20]。介質(zhì)偶聯(lián)配基的密度對于蛋白吸附容量和蛋白擴散具有重要作用，配基密度越大，與蛋白質(zhì)發(fā)生作用的活性位點越多，越有利于蛋白質(zhì)的擴散和吸附。但是，隨著配基密度增大，空間位阻效應隨之增加[21-23]。配基密度還會影響蛋白回收率。因此，研究配基密度與介質(zhì)吸附性能之間的關(guān)系具有重要意義。

2.4.1配基密度對蛋白載量的影響

不同配基密度的陽離子交換介質(zhì)的靜態(tài)吸附曲線見圖3A，在測定的配基密度范圍內(nèi)，靜態(tài)載量隨配基密度增加而逐漸增大。這是由于隨著SP密度增加，介質(zhì)表面與蛋白質(zhì)的結(jié)合位點增多[24]。如圖3B所示，在配基密度低于0.261mmol/mL時，隨著配基密度增大，介質(zhì)的動態(tài)載量逐漸增加；當配基密度大于0.261mmol/mL時，動態(tài)載量略有下降。這是由于配基密度較高時，孔道局部蛋白吸附量較多，部分孔道堵塞，導致蛋白傳質(zhì)效率下降，最終導致蛋白動態(tài)吸附載量下降[25-26]。

2.4.2配基密度對溶菌酶回收率的影響

不同配基密度的陽離子交換介質(zhì)對溶菌酶回收率的影響如圖4所示，曲線a代表空載上樣的溶菌酶色譜峰，曲線b～e依次是配基密度分別為為0.197、0.219、0.229和0.261mmol/mL的介質(zhì)洗脫色譜峰。由圖4曲線b～e可見，隨著配基密度增加，溶菌酶的色譜峰面積逐漸增大，表明介質(zhì)對溶菌酶的回收率增大，計算得到4種介質(zhì)的回收率分別為95.85%、97.84%、98.77%和98.97%。這表明SP密度提高不僅增加了微球?qū)θ芫傅奈轿稽c，而且在一定程度上降低了微球的非特異性吸附。

2.5雞蛋清中溶菌酶的分離純化

采用自制的介質(zhì)對雞蛋清中的溶菌酶進行分離，結(jié)果如圖5所示，色譜圖中只有1個流穿峰和1個洗脫峰。這是由于雞蛋清中含有的蛋白主要有卵蛋白（pI4.0）、卵清蛋白（pI4.6）、球蛋白（pI5.5～5.8）、伴清蛋白（pI6.6）和溶菌酶（pI10.8），當緩沖液pH=8.0時，雞蛋清中的蛋白除溶菌酶外，其余蛋白表面均帶有負電荷，不能被陽離子交換介質(zhì)吸附，所以這些蛋白均流穿，此時只有帶有正電荷的溶菌酶被保留在介質(zhì)上[27]。

分別對流穿液和洗脫液進行收集，通過凝膠電泳對其純度進行分析，結(jié)果如圖6所示，其中，泳道2為洗脫色譜峰收集液，泳道3為流穿色譜峰收集液，泳道4為標準溶菌酶溶液。由電泳圖可見，流穿液中不含溶菌酶，并且洗脫液中除溶菌酶外不含其它雜蛋白，證明制備的介質(zhì)可以很好地實現(xiàn)溶菌酶的分離。

3結(jié)論

以大孔PGMA-EDMA微球為基質(zhì)，通過水解、活化和偶聯(lián)三步反應制備了強陽離子交換層析介質(zhì)。首先對烯丙基活化反應進行了系統(tǒng)考察，建立了烯丙基活化最優(yōu)方法?；诖嘶罨|(zhì)，系統(tǒng)考察了各因素對磺酸基偶聯(lián)反應的影響規(guī)律，獲得了偶聯(lián)磺酸配基的最佳制備工藝條件。對不同配基密度介質(zhì)的吸附性能進行了比較，發(fā)現(xiàn)其蛋白結(jié)合載量隨離子交換容量增加而增大，同時其回收率也隨之上升。將制備的強陽離子交換層析介質(zhì)用于雞蛋清中溶菌酶的分離，獲得了較好的分離效果。