快速濾過型凈化結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定茶葉中氟蟲腈及其代謝物殘留量

杜 鑫，何家國，易珊珊，陳紹輝

(南充農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)中心，四川 南充 637000)

茶葉中富含氨基酸、茶多酚、黃酮、茶多糖等營養(yǎng)物質(zhì)，具有抗氧化、助消化、抗疲勞、抗癌和抗炎的作用，有助于降低患高膽固醇和心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)人體健康有很大益處[1-2]。茶樹適宜生長在地勢(shì)高、濕度大的地區(qū)，茶葉在生長過程中易出現(xiàn)病蟲害。氟蟲腈是一種苯基吡唑類殺蟲劑，對(duì)害蟲以胃毒作用為主，兼有觸殺和一定的內(nèi)吸作用，其作用機(jī)制在于阻礙昆蟲γ-氨基丁酸控制的氯化物代謝，造成其神經(jīng)功能受損，從而引起死亡，對(duì)作物無藥害，被廣泛用于蔬菜、水果、茶葉等農(nóng)產(chǎn)品領(lǐng)域[3-5]。但是，大量研究表明其有神經(jīng)毒性作用，長期攝入可能導(dǎo)致肝腎損傷[4-5]。在現(xiàn)行的食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)中[17]，氟蟲腈殘留物為氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜之和，以氟蟲腈表示，但尚未規(guī)定茶葉中氟蟲腈的最大殘留限量。

茶葉中含有大量的色素、嘌呤生物堿和茶多酚等物質(zhì)，基質(zhì)復(fù)雜，而茶葉農(nóng)藥殘留的含量較低，嚴(yán)重影響檢測(cè)[15-16]。良好的凈化前處理方法不僅消除大部分基質(zhì)干擾，還可以延長分析儀器使用壽命。QuEChERS方法具有操作簡(jiǎn)易、溶劑用量少、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于各類樣品的前處理過程[6-9]?？焖贋V過型凈化法(multi-plug filtration cleanup，m-PFC)是一種結(jié)合固相萃取凈化原理和QuEChERS方法新開發(fā)的一種新型快速樣品前處理凈化技術(shù)[10-16]。該技術(shù)通過篩板將復(fù)合型多壁碳納米管(MWCNTs)、乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)和十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)等固相材料固定于注射器中，通過單次或反復(fù)推拉注射器活塞，使提取液中的色素、有機(jī)酸、脂肪、糖類等雜質(zhì)與填料層作用，但目標(biāo)物不被吸附，從而實(shí)現(xiàn)萃取凈化一步完成，從而大大縮短凈化時(shí)間，凈化速度快，前處理效率高，已用于雞蛋[10]、海產(chǎn)品[11]、大豆[12]、果蔬[13]、人參[14]、茶葉[15-16]等多種農(nóng)藥殘留檢測(cè)前處理。本研究將m-PFC凈化方法與UPLC-MS/MS技術(shù)相結(jié)合，建立了同時(shí)快速檢測(cè)茶葉中氟蟲腈及其代謝物殘留量檢測(cè)方法，優(yōu)化了測(cè)定條件，實(shí)現(xiàn)了簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確檢測(cè)大批量茶葉樣品。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑 Waters ACQUITY UPLC H-Class/Xevo TQ-S超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜儀，ML802型分析天平，GD16plus高速研磨均質(zhì)儀，3-18KS型高速冷凍離心機(jī)，Vortex Genius 3型旋渦混合器，Milli-Q型超純水儀，50 mL離心管，PTFE (0.22 μm)針筒式微孔濾膜。

氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈硫醚等標(biāo)準(zhǔn)品濃度均為1 000 mg/L。甲醇、乙腈、濃氨水、甲酸均為質(zhì)譜級(jí)，乙酸為優(yōu)級(jí)純。QuEChERS鹽包(含 4g MgSO4，1g NaCl，1.5 g檸檬酸鈉)、QuEChERS試劑盒、陶瓷均質(zhì)子(2 cm×1 cm)。KNORTH m-PFC C-5(深色基質(zhì))凈化柱(5 mL/800 mg，300 mg MgSO4，130 mg C18，250 mg PSA，120 mg MWCNTs，貨號(hào)ZC69022-C5)。

1.2 樣品制備 茶葉(綠茶、白茶、紅茶、黑茶等)樣品均購買于某地茶葉加工廠和市場(chǎng)銷售門市。取代表性的茶葉樣品500 g放入粉碎機(jī)中粉碎，樣品全部過425 μm的標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng)篩，混勻后裝入裝入潔凈的聚乙烯塑料樣品袋中，密封并注明標(biāo)記，將試樣放于-18℃冷凍保存.

1.3 樣品提取 準(zhǔn)確稱取2 g(精確到0.01 g)粉碎后的茶葉樣品于50 mL離心管中，加入10 mL水渦旋混勻后靜置浸泡10 min，依次加入1顆陶瓷均質(zhì)子、1袋QuEChERS鹽包和10.00 mL 乙酸+乙腈溶液(1+99，V/V)，擰緊離心管蓋，放入低溫(5℃)高速研磨均質(zhì)儀中3 000 r/min均質(zhì)提取4 min，然后5 000 r/min離心3 min，收集上清液待凈化。

1.4 樣品凈化 QuEChERS方法：吸取5 mL上清液加到內(nèi)含1 200 mg MgSO4+400 mg PSA+400 mg GCB的15 mL塑料離心管中，渦旋混勻2 min，5 000 r/min離心3 min，吸取2 mL上清液過0.22 μm濾膜，待上機(jī)測(cè)定。

m-PFC凈化法：在凈化柱前端串聯(lián)裝上2個(gè)0.22 μm有機(jī)微孔濾膜，置于進(jìn)樣瓶上方，移取2 mL上清液于m-PFC凈化柱中，緩慢推動(dòng)注射桿，控制液滴速度1滴/s，混勻后即得待測(cè)液，用UPLC-MS/MS分析，實(shí)驗(yàn)流程(圖1)。

圖1 樣品前處理流程圖

1.5 儀器檢測(cè)條件

1.5.1 色譜條件 Waters XBridge C18色譜柱(100 mm×3.0 mm，3.5 μm)，柱溫40℃，樣品室溫度18℃，進(jìn)樣體積1.0 μL；流動(dòng)相為含有體積分?jǐn)?shù)為0.05%甲酸的甲醇(A)、體積分?jǐn)?shù)為0.1%氨水的水溶液(B)及乙腈(C)組成的混合溶液，并按(表1)中的梯度洗脫程序分離目標(biāo)物。

表1 UPLC流動(dòng)相組成和梯度洗脫程序

1.5.2 質(zhì)譜條件 用電噴霧離子源，毛細(xì)管電壓為3.0 kV，錐孔氣和脫溶劑氣都用高純氮?dú)?，錐孔氣流量為150 L/h，脫溶劑氣溫度為500℃，其流量為1 000 L/h，碰撞氣為高純氬氣，其流量為0.10 mL/min。采用電噴霧負(fù)離子模式(ESI-)和選擇多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)方式采集數(shù)據(jù)，質(zhì)譜儀信號(hào)采集時(shí)間段為3.5～7.6 min，利用在線切換閥將其他時(shí)間段的液相色譜流動(dòng)相切換到廢液，從而減小儀器污染，延長儀器使用壽命。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 分別準(zhǔn)確吸取4種待測(cè)物的標(biāo)準(zhǔn)溶液各1.00 mL 置于10.0 mL 容量瓶中，乙腈稀釋配制成 100 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液。用乙腈逐級(jí)稀釋配制成10、1 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4℃冰箱冷藏避光保存。稱取篩選出的空白茶葉樣品按前處理方法制成基質(zhì)溶液，按比例準(zhǔn)確加入一定體積的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配制成不同濃度的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相色譜-質(zhì)譜條件優(yōu)化 在ESI-模式下，選取甲醇(A相)、水(B相)和乙腈(C相)為流動(dòng)相。樣品提取液為酸化乙腈，選擇在水相中加入少量氨水來改善目標(biāo)物的峰形拖尾，并提高4種農(nóng)藥的電噴霧離子化效率。另外，在甲醇中加入少量甲酸后，形成了一個(gè)穩(wěn)定的緩沖體系，有利于實(shí)樣中目標(biāo)物檢測(cè)。為方便摸索優(yōu)化條件，先用甲醇+水(50+50，V/V)配制了0.50 mg/L氟蟲腈及其代謝物的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

采取質(zhì)譜直接進(jìn)樣的方式來優(yōu)化質(zhì)譜條件，在不同流動(dòng)相體系對(duì)氟蟲腈及其代謝物進(jìn)行了全掃描，分析其響應(yīng)信號(hào)強(qiáng)度，結(jié)合儀器“Intellistart”功能快速優(yōu)化出的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)(表2)。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：由于氟蟲腈及其代謝物在分子結(jié)構(gòu)式上都有氨基，既可以得到一個(gè)質(zhì)子形成[M+H]+，又可以失去一個(gè)質(zhì)子形成[M-H]-。在電噴霧負(fù)離子模式下，氟蟲腈及其代謝物基線響應(yīng)更低，干擾更小，這是由于其結(jié)構(gòu)中含有較多的鹵代基和氨基，在電噴霧離子源內(nèi)更易失去電子形成負(fù)離子。采用色譜進(jìn)樣，觀察目標(biāo)物的保留時(shí)間、峰形、響應(yīng)信號(hào)強(qiáng)度，優(yōu)化后的流動(dòng)相梯度體系(表1)，氟蟲腈及其代謝物的標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖(圖2)。結(jié)果表明，4種農(nóng)藥在7 min內(nèi)全部出峰，峰形及分離度很好，都有較強(qiáng)的分子離子峰強(qiáng)度。采用甲醇-乙腈-水體系并加入少量氨水和甲酸后，提高了目標(biāo)物的離子化效率，有效改善了目標(biāo)物峰形，增強(qiáng)了目標(biāo)物響應(yīng)信號(hào)，有利于提高方法選擇性和靈敏度。

表2 氟蟲腈及其代謝物在MRM模式下UPLC-MS/MS分析的質(zhì)譜參數(shù)

圖2 氟蟲腈及其代謝物的試劑標(biāo)準(zhǔn)溶液MRM色譜圖(5 μg/L)

2.2 提取劑優(yōu)化 初步選取乙腈、甲醇、丙酮等有機(jī)溶劑作為提取劑，按添加50 μg/kg濃度水平進(jìn)行樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)，比較分析了3種溶劑的提取效率。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：用丙酮和甲醇為提取劑時(shí)，浸提出的雜質(zhì)較多，提取液比較渾濁，導(dǎo)致基質(zhì)效應(yīng)比較嚴(yán)重。乙腈具有極性大、穿透性強(qiáng)，通過鹽析法除掉茶葉中的色素、蛋白質(zhì)、糖分等大部分雜質(zhì)，茶葉提取液顏色更加澄清，極大地減弱部分基質(zhì)干擾。氟蟲腈及其代謝產(chǎn)物為含有較多氨基的弱堿性化合物，其在酸性溶劑中的溶解度大于中性溶劑，進(jìn)一步考察了乙酸+乙腈溶液(1+99，V/V)提取效率，發(fā)現(xiàn)其提取效果優(yōu)于乙腈，故選用乙酸+乙腈溶液(1+99，V/V)溶液作為提取溶劑。另外，茶葉樣品在用有機(jī)溶劑提取前加適量水使其充分潤濕溶脹，可提高提取效率。

2.3 凈化方式選擇 在傳統(tǒng)QuEChERS方法中，主要以PSA、C18、GCB等為凈化吸附劑。PSA利用陰離子交換吸附蛋白質(zhì)、糖類和極性較高的物質(zhì)，C18主要用于吸附脂肪和脂類等非極性干擾物，GCB常作為弱極性或非極性吸附劑來除去色素和甾醇等疏水性化合物。試驗(yàn)用未經(jīng)凈化的綠茶、紅茶、白茶和黑茶空白基質(zhì)提取液直接配制了50 μg/L氟蟲腈及其代謝物的混合基質(zhì)溶液，接著用QuEChERS凈化法和m-PFC柱凈化法處理同一批空白基質(zhì)提取液，用凈化后的茶葉基質(zhì)溶液配制50 μg/L標(biāo)液作為對(duì)照，一起上機(jī)檢測(cè)，比較分析了兩種凈化方法對(duì)氟蟲腈及其代謝物的萃取凈化效果和回收率，結(jié)果(圖3)。

圖3 QuEChERS和m-PFC凈化法對(duì)目標(biāo)物回收率的影響

選取綠茶、白茶、紅茶、黑茶等基質(zhì)，用QuEChERS和m-PFC法凈化樣品時(shí)，氟蟲腈及其代謝物的回收率均>80%，且m-PFC法回收率均高于QuEChERS法。QuEChERS法降低了目標(biāo)物回收率或是由于凈化填料中的GCB對(duì)具有平面結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥具有很強(qiáng)的親和力，吸附了少量的苯基吡唑類結(jié)構(gòu)的氟蟲腈及代謝物，導(dǎo)致回收率降低。據(jù)相關(guān)研究[10-16]，MWCNTs是一種納米級(jí)中空材料，不僅結(jié)構(gòu)獨(dú)特且具有不同的電子、化學(xué)性能和高比表面積，表面鍵合不同的官能團(tuán)或配合物，改善其溶解性和分散性，使其能夠改善分散固相萃取對(duì)基質(zhì)干擾化合物的去除效果，常用其替代GCB去除基質(zhì)中天然色素、固醇類、生物堿等大分子干擾物，對(duì)茶葉中雜質(zhì)如色素、有機(jī)酸、茶多酚等吸附容量更大，吸附能力更強(qiáng)，還能改善對(duì)具有苯并雜環(huán)類結(jié)構(gòu)農(nóng)藥的吸附問題。

此外，QuEChERS凈化包凈化法移取上清液振搖凈化后需要再次離心，m-PFC柱采用注射器式設(shè)計(jì)，凈化過程不需旋渦振蕩和離心，每一批次樣品(16個(gè))前處理時(shí)間可控制在20 min以內(nèi)，比QuEChERS凈化管操作更加簡(jiǎn)便。MWCNTs和PSA配合使用提高了凈化效率，有效降低了基質(zhì)中雜質(zhì)的干擾，提高了目標(biāo)物的回收率。綜合凈化效果和提取效率，后續(xù)試驗(yàn)選取m-PFC柱凈化，茶葉空白基質(zhì)及基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖(圖4、5)，凈化后的茶葉空白基質(zhì)不干擾目標(biāo)物的測(cè)定。

圖4 綠茶空白基質(zhì)MRM色譜圖

圖5 氟蟲腈及其代謝物的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液MRM色譜圖 (50 μg/L)

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的影響 基質(zhì)效應(yīng)(ME)是液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)方法中普遍存在的現(xiàn)象，可能是色譜分離中的共流出物影響了待測(cè)目標(biāo)物的離子化效率或樣品基質(zhì)影響了離子源電噴霧離子化效率，從而導(dǎo)致目標(biāo)物響應(yīng)信號(hào)的增強(qiáng)和減弱[6-8]。用基質(zhì)空白和試劑空白分別配制50 μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用色譜進(jìn)樣來獲得目標(biāo)物的定量離子色譜峰面積，重復(fù)測(cè)定3次。采用相對(duì)響應(yīng)值法來計(jì)算4種目標(biāo)物ME的相對(duì)強(qiáng)度(ME=農(nóng)藥在基質(zhì)中的定量離子對(duì)峰面積/農(nóng)藥在試劑中的定量離子對(duì)峰面積)，考察了不同茶葉樣品基質(zhì)的影響，結(jié)果(圖6)。選取的4種茶葉樣品基質(zhì)，氟蟲腈的ME值為1.11～1.19，氟甲腈的ME值為0.82～0.94，氟蟲腈硫醚的ME值為0.92～1.02，氟蟲腈砜的ME值為0.92～0.99，氟蟲腈有略微基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，其余3種代謝物有較小的基質(zhì)減弱效應(yīng)。

圖6 氟蟲腈及其代謝在4種茶葉基質(zhì)中的ME

用反相高效液相色譜法分離目標(biāo)化合物，減少了共流出物的基質(zhì)干擾，還用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液校正方法對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行補(bǔ)償。但是，在大批量茶葉樣品檢測(cè)過程中，茶葉樣品種類眾多，很難做到每一種茶葉檢測(cè)均匹配基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。為此，對(duì)農(nóng)藥在白茶、紅茶、黑茶基質(zhì)中的ME與綠茶基質(zhì)的ME做了對(duì)比分析，結(jié)果(圖7)。4種農(nóng)藥的ME值均在0.95～1.14，說明不同茶葉品種間的基質(zhì)效應(yīng)差異并不明顯，在篩選時(shí)可選擇一種茶類的空白基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行定量分析。

圖7 在白茶、紅茶、黑茶的微乳劑/綠茶的ME

2.5 方法的線性范圍和檢出限 用綠茶空白基質(zhì)配制4種農(nóng)藥的混合標(biāo)液，以每種農(nóng)藥的質(zhì)量濃度(x，μg/L)為橫坐標(biāo)，定量離子對(duì)的色譜峰面積(y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性擬合，結(jié)果(表3)。標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)系數(shù)r均>0.999，用Masslynx V4.1軟件計(jì)算信噪比(S/N)，以S/N=3計(jì)算得到方法的檢出限為1.2～1.8 μg/kg。

表3 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下氟蟲腈及其代謝物的線性范圍、線性相關(guān)系數(shù)和檢出限

2.6 方法的回收率、精密度和定量限 稱取2 g綠茶、紅茶、白茶、黑茶于50 mL離心管中，分別添加5.00、10.0、500 μg/kg 3個(gè)濃度水平的農(nóng)藥，渦旋1 min，密封過夜，次日按照1.2～1.6節(jié)條件進(jìn)行樣品前處理及上機(jī)檢測(cè)，每個(gè)濃度水平做3個(gè)平行質(zhì)控樣。以回收率表示準(zhǔn)確度，以回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)表示精密度，結(jié)果(表4)。氟蟲腈及其代謝物在4種不同茶葉基質(zhì)中的加標(biāo)回收率為76.4%～104.1%，RSD為2.7%～6.4%，均滿足農(nóng)藥殘留檢測(cè)的要求[18]，表明該方法準(zhǔn)確度較高，精密度良好。經(jīng)加標(biāo)回收率試驗(yàn)驗(yàn)證，定量限均為5.0 μg/kg。

表4 氟蟲腈及代謝物在茶葉樣品的加標(biāo)回收率和精密度(n=3)

2.7 實(shí)樣檢測(cè) 用該方法對(duì)某地茶葉加工廠和門市抽取的40個(gè)茶葉樣品進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品做平行雙樣。均沒有檢出氟蟲腈及其代謝物。

3 結(jié)論

試驗(yàn)將m-PFC柱凈化法和UPLC-MS/MS技術(shù)結(jié)合用于快速檢測(cè)茶葉中氟蟲腈及其代謝物殘留量，凈化過程不需要旋渦振蕩和離心，大幅提升檢測(cè)效率，比傳統(tǒng)QuEChERS凈化管操作更加快捷高效。該方法具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、準(zhǔn)確度和精密度良好等優(yōu)點(diǎn)，適用于大批量茶葉中氟蟲腈及其代謝物的快速定量檢測(cè)，也可為制定氟蟲腈在茶葉中的限量值提供參考。