4-辛基衣康酸抑制脂多糖誘導(dǎo)的小鼠顱骨炎性骨吸收的效果研究

溫從鵬， 童無憂， 陳旭卓， 賴林鋒

（1.溫州市中心醫(yī)院口腔科，溫州 325000；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，杭州 310000；3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔外科，上海 200011）

骨代謝是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程，通常由成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成和破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收共同調(diào)控[1]。骨穩(wěn)態(tài)是維持骨骼完整性和正常功能的必要條件[2]。然而機(jī)體內(nèi)的炎癥、氧化應(yīng)激和激素等因素的共同影響，常導(dǎo)致破骨細(xì)胞的過度形成，引起骨吸收增強(qiáng)，尤其在口腔頜面部，可誘發(fā)包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、種植體周圍炎和牙周炎等在內(nèi)的各類骨溶解性疾病，嚴(yán)重?fù)p害患者的生理和心理健康[3-4]。目前對(duì)于骨溶解性疾病的治療，主要包括非甾體類抗炎藥、雌激素類藥物、雙膦酸鹽和各類單抗藥物等，然而這些藥物因副作用大、價(jià)格昂貴等，各自都存在臨床應(yīng)用的局限性[5]。因此，近年來出現(xiàn)了一系列針對(duì)抑制破骨細(xì)胞及其炎癥反應(yīng)的相關(guān)新型藥物研究，開發(fā)一種安全且高效的藥物治療方法勢在必行。

骨溶解通常伴發(fā)炎癥反應(yīng)，其特征是大量浸潤的免疫細(xì)胞和破骨細(xì)胞[6]。在眾多的免疫細(xì)胞中，巨噬細(xì)胞為分泌炎癥因子的主要來源，在骨溶解過程中起到了關(guān)鍵作用。在核因子κB 受體活化因子配體（RANKL）的刺激下，巨噬細(xì)胞可以分化為體內(nèi)唯一具有骨吸收功能的細(xì)胞——破骨細(xì)胞。已有越來越多的證據(jù)[7-8]表明，包括腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6 和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）在內(nèi)的炎癥因子，可以在沒有RANKL 的情況下直接誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化。同時(shí)，TNF-α、IL-1β等炎癥因子與RANKL 具有較強(qiáng)的協(xié)同作用，亦可通過刺激RANKL 及其受體RANK 的表達(dá)，上調(diào)破骨細(xì)胞形成，促使炎性骨溶解的發(fā)生[9]。因此，鑒于炎癥因子和RANKL 之間的緊密聯(lián)系，在骨溶解微環(huán)境中，有必要對(duì)BMMs 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收進(jìn)行聯(lián)合干預(yù)。

衣康酸（itaconate，ITA）是一種由巨噬細(xì)胞自身合成的小分子代謝物產(chǎn)物，在細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)中起到重要作用[10]。然而ITA 作為一種羧酸，極性較強(qiáng)且不易穿透細(xì)胞膜，在大多數(shù)情況下難以被實(shí)際應(yīng)用。4-辛基衣康酸（4-OI）作為ITA 的衍生物，具有較強(qiáng)的細(xì)胞膜滲透性，因此是研究ITA 生物學(xué)功能的理想替代物[11]。近年來，已有廣泛研究[12-14]證實(shí)，ITA 可通過多種途徑發(fā)揮其抗炎作用：①ITA可通過上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子ATF3 的表達(dá)，干擾IκB 的降解，進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)核心信號(hào)NF-κB 通路的激活；②ITA 可通過與泛素連接酶kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（kelch-like ECH-associated protein-1，KEAP1）發(fā)生反應(yīng)，激活細(xì)胞內(nèi)的抗氧化樞紐蛋白——核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor-2，Nrf 2）的釋放和入核，進(jìn)而增加其下游抗炎及抗氧化產(chǎn)物的表達(dá)；③ITA 可通過激活Nrf 2，在轉(zhuǎn)錄水平直接抑制炎癥相關(guān)基因的表達(dá)；④ITA 可通過抑制三羧酸循環(huán)中的琥珀酸脫氫酶的活性，降低線粒體活性氧（ROS）的產(chǎn)生。此前研究[15-17]曾報(bào)道，4-OI 可有效激活Nrf 2 發(fā)揮抗炎、抗氧化的作用，在關(guān)節(jié)炎、腹膜炎、急性肺損傷及骨質(zhì)疏松等疾病中都有較好的治療效果。然而目前尚不清楚4-OI 是否對(duì)炎性骨溶解具有相似的治療效果。本研究旨在探討4-OI 對(duì)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的小鼠顱骨溶解的治療效果。

1 材料和方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑

4-OI（Selleck 公司，美國）；大腸埃希菌來源的LPS（InvivoGen 公司，美國）；重組小鼠巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）、重組小鼠RANKL（RD 公司，美國）；α-MEM培養(yǎng)液（HyClone 公司，美國）；胎牛血清（Avantor 公司，美國）；青霉素-鏈霉素（Gibco 公司，美國）；CCK-8 試劑盒、ROS 檢測試劑盒（DCFH-DA）、4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，中國）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑（TaKaRa 公司，日本）；iNOS 一抗、免疫熒光二抗（CST 公司，美國）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

RAW 264.7 小鼠巨噬細(xì)胞系購買于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。使用含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素-鏈霉素的α-MEM 培養(yǎng)液，于37 ℃、5%的CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞系。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80%～90%時(shí)，需進(jìn)行傳代或種板。為了避免對(duì)細(xì)胞系造成刺激，常使用直接吹打或細(xì)胞刮收集細(xì)胞，而不使用胰蛋白酶。

使用全骨髓法提取小鼠原代骨髓來源巨噬細(xì)胞（BMMs）。簡而言之，從4～6 周齡C57/BL6 雄性小鼠的股骨和脛骨中收集骨髓細(xì)胞，重懸于含有30 ng/mL M-CSF 的完全α-MEM 培養(yǎng)液中，于37 ℃、5%的CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)原代細(xì)胞。培養(yǎng)液每2 d 換液1 次，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80%～90%時(shí)，需使用含0.25%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）的胰蛋白酶消化，隨后進(jìn)行傳代或種板。

1.3 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

將RAW 264.7巨噬細(xì)胞和BMMs以8×103個(gè)/孔的密度種于96 孔板。待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度（6.25、12.5、25、50、100 μmmol/L）4-OI。繼續(xù)培 養(yǎng)RAW 264.7 巨噬細(xì)胞24 h 和48 h；而對(duì)于BMMs，則繼續(xù)培養(yǎng)48 h 和96 h。隨后向每個(gè)孔中加入10 μL的CCK-8 溶液。避光孵育2 h 后，于酶標(biāo)儀上檢測450 nm 波長處的吸光度值。將空白對(duì)照組細(xì)胞活力設(shè)定為100%，以此為基準(zhǔn)計(jì)算每組的細(xì)胞活力百分比。

1.4 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）

將RAW 264.7 巨噬細(xì)胞以5×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度種于6 孔板。待細(xì)胞貼壁后，分別加入100 ng/mL 的LPS 及不同 濃度的4-OI（12.5、50 μmmol/L）作用24 h。根據(jù)說明書，使用RNA提取試劑盒（Axygen 公司，美國）提取細(xì)胞中的總RNA。使用PrimeScriptTMRT Reagent Kit（TaKaRa公司，日本）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄（1 000 ng 總RNA 體系）。使用TB Green?Premix Ex TaqTMKit（TaKaRa 公司，日本）配制反應(yīng)體系。隨后使用ABI7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（Applied Biosystems 公司，美國）進(jìn)行RT-qPCR。以β-actin 作為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCt來計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

1.5 細(xì)胞免疫熒光

將RAW 264.7 細(xì)胞以5×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于共聚焦皿，待細(xì)胞貼壁后，分別加入100 ng/mL的LPS 及不同濃度（12.5、50 μmmol/L）4-OI 作 用24 h。隨后依次使用4%多聚甲醛固定、含0.5%Triton X-100 的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）通透及免疫熒光封閉液封閉。使用免疫熒光一抗稀釋液稀釋一抗（iNOS 一抗使用比例為1∶100），4 ℃下過夜孵育。第2 天使用PBS 稀釋二抗（山羊抗兔熒光二抗，使用比例為1∶500），室溫?fù)u床孵育1 h。使用5 μg/mL 的DAPI 避光孵育5 min。隨后于共聚焦顯微鏡下觀察（DAPI：405 nm激發(fā)光；iNOS：488 nm激發(fā)光）。拍攝完畢后，在Image J 軟件上對(duì)陽性細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，算得各組的陽性細(xì)胞相對(duì)百分率（陽性細(xì)胞數(shù)/DAPI 數(shù)×100%）。

1.6 ROS 檢測

將RAW 264.7 細(xì)胞以5×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于共聚焦皿，待細(xì)胞貼壁后，分別加入100 ng/mL的LPS 及不同濃度（12.5、50 μmmol/L）4-OI 作用24 h。隨后使用ROS 檢測試劑盒（DCFH-DA）檢測細(xì)胞內(nèi)ROS 水平。按照 1∶1 000 的比例用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA 探針，于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中避光孵育20 min，在共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光強(qiáng)度。拍攝完畢后，在Image J 軟件上對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算各組細(xì)胞的相對(duì)熒光強(qiáng)度（實(shí)驗(yàn)組熒光強(qiáng)度/對(duì)照組熒光強(qiáng)度×100%）。

1.7 抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色

將小鼠BMMs 以1×104個(gè)/孔的密度接種于96 孔板，待細(xì)胞貼壁后，分別加入50 ng/mL 的RANKL 及不同濃度（12.5、50 μmmol/L）4-OI，隔天換液，持續(xù)誘導(dǎo)5 d。待破骨細(xì)胞形成后，使用4%多聚甲醛室溫固定15 min，用PBS 漂洗2 次后，加入TRAP 染液，于37 ℃下染色1 h。隨后用PBS 漂洗2 次，于倒置顯微鏡下，每孔隨機(jī)選取5 個(gè)視野拍照。拍攝完畢后，將照片導(dǎo)入Image J 軟件中，統(tǒng)計(jì)各孔破骨細(xì)胞（細(xì)胞核≥3 個(gè)）的數(shù)量和面積。

1.8 LPS 誘導(dǎo)的小鼠顱骨溶解模型的建立

本研究中的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已獲得上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：SH9H-2020-A1-1），并嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為6 周齡C57BL/6 雄性小鼠[體質(zhì)量約（20±2）g]，共 15 只，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物平均分為3 組：假手術(shù)組（PBS）、LPS 組（10 mg/kg LPS）、4-OI 治療組（10 mg/kg LPS+5 mg/kg 4-OI）。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，手術(shù)及取材均在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行。

腹腔注射2%戊巴比妥以麻醉小鼠，使用脫毛膏脫除小鼠頭部毛發(fā)，切開皮膚，暴露顱骨，使用剝離子剝開骨膜，在人字縫中間植入浸泡過200 μg LPS 的明膠海綿（4 mm×4 mm×2 mm）。對(duì)于假手術(shù)組，則植入PBS 浸泡的明膠海綿（4 mm×4 mm×2 mm）；3 d 后待創(chuàng)口愈合，LPS 組于小鼠顱頂處局部注射200 μg 的LPS；4-OI 組則分別于小鼠顱頂處局部注射200 μg 的LPS，以及腹腔注射100 μg的4-OI，隔天注射，直到造模第14 天，對(duì)小鼠進(jìn)行安樂死并取材。將取材后的顱骨于4%多聚甲醛中固定48 h，流水過夜后，保存于75%乙醇中。

1.9 Micro-CT 檢測

使用高分辨率micro-CT 掃描機(jī)（Scanco Medical AG 公司，瑞士）對(duì)樣本進(jìn)行掃描（分辨率10 μm，掃描電壓70 kV，電流200 μA，曝光時(shí)間300 ms）。掃描后對(duì)標(biāo)本進(jìn)行三維重建和分析。

1.10 組織切片染色

將樣本置于10%的EDTA 溶液（pH=7.4）中，在室溫下脫鈣，每3 天更換1 次脫鈣液，連續(xù)脫鈣4 周。隨后將樣本進(jìn)行脫水、浸蠟、包埋、切片，再分別進(jìn)行蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin，HE）、TRAP及組織免疫熒光染色處理。使用Image J 軟件對(duì)iNOS 陽性細(xì)胞百分比及TRAP 陽性細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用GraphPad Prism 8.0 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。正常分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行2 組間差異分析，使用單因素方差分析（one-way analysis of variance，ANOVA）進(jìn)行多組間差異分析，組間差異比較采用Tukey 檢驗(yàn)。P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4-OI 對(duì)RAW 264.7 巨噬細(xì)胞及小鼠原代BMMs的細(xì)胞毒性檢測

如 圖1A 所 示，4-OI 含有典型的α、β-不 飽和羧酸結(jié)構(gòu)，提示該化合物具有較活潑的化學(xué)性質(zhì)。CCK-8 結(jié)果顯示，4-OI 在100 μmmol/L 的濃度范圍內(nèi)不會(huì)影響RAW 264.7 巨噬細(xì)胞的細(xì)胞活性（圖1B）。對(duì)于小鼠原代BMMs，在48 h 培養(yǎng)后，100 μmmol/L 濃度范圍內(nèi)的4-OI 無明顯細(xì)胞毒性，而培養(yǎng)96 h 后，100 μmmol/L 的4-OI 則表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性（圖1C）（P<0.001）。因此，我們選取對(duì)細(xì)胞無毒性的2 組（12.5、50 μmmol/L 4-OI）進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 4-OI 可有效抑制LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞促炎相關(guān)基因表達(dá)

RT-qPCR 結(jié)果（圖2A）顯示，在LPS 的刺激下，促炎相關(guān)基因如TNF-α、IL-1β、IL-6 和iNOS 的mRNA 表達(dá)量均顯著增加，提示炎癥反應(yīng)體系構(gòu)建成功。而對(duì)于12.5 μmmol/L 和50 μmmol/L 的4-OI 處理組，促炎相關(guān)基因的表達(dá)水平較LPS 組均顯著降低，且具有濃度依賴性。隨后，我們通過免疫熒光進(jìn)一步觀察4-OI 對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥的抑制效果。如圖2B 和圖2C 所示，在LPS 的刺激下，炎癥巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物iNOS 的表達(dá)顯著升高，而在12.5 μmmol/L 和50 μmmol/L 的4-OI 處理下，iNOS表達(dá)均顯著下降（P<0.001）。以上結(jié)果均提示4-OI對(duì)LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞促炎相關(guān)基因的表達(dá)具有較為高效的抑制效果。

圖2 4-OI 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥的影響Figure 2 The effect of 4-OI on LPS-induced inflammation of macrophage

2.3 4-OI 可有效降低炎癥巨噬細(xì)胞內(nèi)的ROS 水平

如圖3A 所示，經(jīng)100 ng/mL 的LPS 誘導(dǎo)后，RAW 264.7 巨噬細(xì)胞內(nèi)的ROS 水平顯著上升。而在不同濃度4-OI 的作用下，細(xì)胞內(nèi)ROS 水平均顯著下降（P<0.01），且高濃度（50 μmmol/L）的4-OI較低濃度（12.5 μmmol/L）降低得更為明顯（圖3B）。

圖3 4-OI 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的炎癥巨噬細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的影響Figure 3 The effect of 4-OI on ROS level in inflammatory macrophages

2.4 4-OI 可有效抑制RANKL 誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化

圖4A 中TRAP 染色結(jié)果顯示，經(jīng)50 ng/mL 的RANKL 刺激5 d 后，可見大量TRAP 陽性的多核破骨細(xì)胞形成，而不同濃度4-OI 處理組中，TRAP 陽性細(xì)胞的數(shù)量（圖4B）及面積占比（圖4C）則顯著減少（P<0.01），提示4-OI 具有較為理想的破骨分化抑制效果。

圖4 4-OI 對(duì)RANKL 誘導(dǎo)的破骨分化的影響Figure 4 The effect of 4-OI on RANKL-induced osteoclastogenesis

2.5 4-OI 可有效抑制LPS 誘導(dǎo)的小鼠顱骨溶解

Micro-CT 掃描的重建結(jié)果顯示，LPS 組的顱骨表面出現(xiàn)了廣泛性的骨溶解，具體表現(xiàn)為深而大的骨吸收坑。相比之下，4-OI 治療組中的小鼠骨溶解范圍明顯局限，骨吸收坑較LPS 組淺而?。▓D5A）。Micro-CT 定量分析結(jié)果顯示，4-OI 治療組的骨體積分?jǐn)?shù)（bone volume/tissue volume，BV/TV）與LPS組相比，得到顯著改善（圖5B，P<0.05）。同時(shí)，經(jīng)4-OI 治療后，顱骨表面骨溶解的孔隙率明顯降低（圖5C，P<0.05），與LPS 組相比，孔隙率降低超過35%，提示4-OI 具有明顯的骨溶解抑制效果。

圖5 Micro-CT 檢測4-OI 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的小鼠顱骨溶解的治療效果Figure 5 Micro-CT detection of the effect of LPS-induced murine calvarial osteolysis treated by 4-OI

如圖6A 所示，HE 和TRAP 染色均顯示，LPS組的小鼠顱骨具有廣泛的溶骨性破壞，提示模型構(gòu)建成功。HE 染色可見LPS 組內(nèi)炎癥細(xì)胞的浸潤及組織缺損程度較假手術(shù)組明顯增加，而4-OI 治療組有效抑制了炎癥浸潤及組織破壞的水平。組織免疫熒光染色亦顯示，LPS 組內(nèi)iNOS 陽性細(xì)胞百分比較假手術(shù)組顯著增加，而4-OI 治療組內(nèi)iNOS 陽性細(xì)胞百分比顯著降低（圖6B，P<0.01）。TRAP染色結(jié)果可見LPS 組中骨小梁的邊緣存在大量TRAP 陽性的破骨細(xì)胞，而在4-OI 組中，TRAP 陽性破骨細(xì)胞的數(shù)量則顯著降低（圖6C，P<0.001），提示4-OI 對(duì)炎性骨溶解病變中的破骨細(xì)胞具有較好的抑制效果。

圖6 組織學(xué)檢測4-OI 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的小鼠顱骨溶解的治療效果Figure 6 Histology detection of the effect of LPS-induced murine calvarial osteolysis treated by 4-OI

3 討論

一般而言，骨溶解與炎癥反應(yīng)關(guān)系密切。炎癥反應(yīng)和骨吸收的過度激活可引發(fā)包括骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松、牙周炎和種植體周圍炎等一系列骨溶解性疾病。然而，目前臨床上應(yīng)用的藥物存在骨壞死、腎毒性及易過敏等副作用。因此有必要開發(fā)一種可預(yù)防和治療炎性骨溶解的新型藥物。作為細(xì)胞內(nèi)的一種免疫代謝產(chǎn)物，衣康酸具有α，β-不飽和羧酸結(jié)構(gòu)，可通過邁克爾加成反應(yīng)烷基化內(nèi)源性蛋白中的半胱氨酸殘基，發(fā)揮其生物學(xué)作用[10]。在此，本研究探究衣康酸衍生物4-OI 對(duì)炎性骨溶解的治療效果，以期進(jìn)一步擴(kuò)大衣康酸及其衍生物在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。

在本研究中，我們首先對(duì)4-OI 的細(xì)胞毒性進(jìn)行了檢測。使用不同濃度的4-OI 分別處理RAW 264.7 巨噬細(xì)胞和小鼠原代BMMs，并分別于24、48 h 和48、96 h 進(jìn)行CCK-8 檢測。結(jié)果顯示4-OI對(duì)RAW 264.7 巨噬細(xì)胞和小鼠原代BMMs 的安全濃度 分別為100 μmmol/L 和50 μmmol/L，因此我們選取了對(duì)細(xì)胞無毒性的2 組濃度（12.5、50 μmmol/L）進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在確定了4-OI 的細(xì)胞安全濃度后，我們進(jìn)一步探究了4-OI 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的抑制效果。首先，使用100 ng/mL 的LPS 刺激RAW 264.7 巨噬細(xì)胞24 h，與此同時(shí)加入濃度為12.5 μmmol/L 和50 μmmol/L 的4-OI 進(jìn)行處理。結(jié)果顯示，4-OI 可以在不影響細(xì)胞活性的情況下，有效地抑制LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)，以濃度依賴性的方式降低TNF-α、IL-1β、IL-6 和iNOS 的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，同時(shí)有效抑制iNOS的蛋白表達(dá)水平。巨噬細(xì)胞在炎癥因子的作用下可發(fā)生呼吸爆發(fā)，導(dǎo)致線粒體氧耗量迅速增加，產(chǎn)生大量的ROS，進(jìn)而導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生，氧化應(yīng)激進(jìn)一步促進(jìn)炎癥因子的產(chǎn)生，引發(fā)炎癥-氧化應(yīng)激-炎癥的惡性循環(huán)[18-19]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在50 μmmol/L 4-OI 作用下的炎癥巨噬細(xì)胞中，DCFHDA 熒光強(qiáng)度與未加LPS 刺激的對(duì)照巨噬細(xì)胞相當(dāng)，提示此時(shí)4-OI 對(duì)ROS 具有強(qiáng)效的抑制作用，具體可能通過降低線粒體ROS 產(chǎn)生、抑制炎癥因子表達(dá)和增加抗氧化產(chǎn)物生成而實(shí)現(xiàn)。隨后，我們進(jìn)一步對(duì)4-OI 對(duì)破骨細(xì)胞分化的作用效果進(jìn)行探究。TRAP 染色結(jié)果顯示，4-OI 可以有效抑制破骨細(xì)胞的分化，降低破骨細(xì)胞數(shù)量及面積。以上結(jié)果均提示，4-OI 具備良好的體外抗炎、抗氧化和抗破骨細(xì)胞分化功能。

為了進(jìn)一步探究4-OI 的體內(nèi)治療效果，我們構(gòu)建了LPS 誘導(dǎo)的小鼠炎性骨溶解模型。在造模后第3 天，于治療組小鼠腹腔注射4-OI，隔天注射，并于造模后第14 天取材。LPS 即內(nèi)毒素，是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要組成部分，可作為一種有效的炎癥誘導(dǎo)劑，在體內(nèi)模擬炎性骨溶解的發(fā)生[20]。LPS可通過激活巨噬細(xì)胞表面的Toll 樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4），進(jìn)而誘導(dǎo)NF-κB 通路和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）通路的激活，產(chǎn)生持續(xù)的炎癥反應(yīng)[21]。Micro-CT 結(jié)果顯示，4-OI 可有效改善LPS 所誘導(dǎo)的顱骨溶解，BV/TV 及孔隙率指標(biāo)較LPS 組相比，均有顯著改善。與Micro-CT 結(jié)果相似，組織學(xué)切片染色及定量分析亦表明，4-OI 可有效地抑制LPS 誘導(dǎo)的骨溶解進(jìn)展，骨溶解處周圍炎癥浸潤和組織缺損程度明顯降低，同時(shí)iNOS 陽性細(xì)胞百分比顯著下降，提示4-OI具有理想的體內(nèi)炎癥骨溶解治療效果。

然而，本研究也存在一定的局限性。首先，本研究尚未對(duì)4-OI 抑制巨噬細(xì)胞炎癥及破骨細(xì)胞分化進(jìn)行更深一步的機(jī)制研究。其次，4-OI 能否通過口服用藥的方式有效抑制炎性骨溶解疾病的進(jìn)展，亦是下一步需要探究的一個(gè)重要問題。最后，4-OI是否可能會(huì)影響成骨細(xì)胞行為，也需要在后續(xù)的研究中進(jìn)一步探討。

綜上所述，本研究證實(shí)衣康酸的衍生物4-OI 在體外可以有效地降低炎癥巨噬細(xì)胞內(nèi)促炎因子的表達(dá)，降低細(xì)胞內(nèi)ROS 水平，抑制RANKL 誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化，在體內(nèi)亦可以有效地緩解LPS 誘導(dǎo)的小鼠炎性顱骨溶解，對(duì)于口腔頜面部骨溶解相關(guān)疾病的治療具有極大的應(yīng)用前景。