骨筋丸膠囊中血竭摻雜龍血竭鑒別研究

譚志偉，湯珺，張靜

1.吉安市食品藥品檢驗檢測中心，江西 吉安 343000；2.江西省藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質量評價重點實驗室，江西省藥品與醫(yī)療器械質量工程技術研究中心，江西 南昌 330029

骨筋丸膠囊是由乳香、沒藥、血竭等14 味中藥組成的中藥成方制劑，血竭在組方中起著重要作用?！吨袊幍洹罚?］規(guī)定血竭的來源為棕櫚科植物麒麟竭果實滲出的樹脂加工而成。而龍血竭原植物則為百合科劍葉龍血樹［2］。二者收載于不同的標準，功效不完全相同，化學成分也有區(qū)別，其中血竭素、血竭紅素等為血竭的主要成分［3-5］；而龍血竭的主要成分為龍血素A、龍血素B 等二氫查耳酮類化合物和其他化合物［6-8］。由于兩者價格有差異，龍血竭較便宜，因此在中藥制劑生產(chǎn)過程中也不排除有些藥品生產(chǎn)企業(yè)為降低成本或在不知情的情況下，使用了龍血竭或摻雜有龍血竭的血竭投料的可能。

本次研究涉及12 家生產(chǎn)企業(yè)5 個質量標準，其中3 個檢驗標準缺少對血竭的質控項目，其余2個質量標準分別為《國家食品藥品監(jiān)督管理總局國家藥品標準》WS3-B-2571-97-5［9］和WS3-B-2571-97-11［10］，均以薄層色譜法控制血竭質量，但檢驗過程中發(fā)現(xiàn)該薄層色譜法受溫度濕度影響較大，展開效果不理想，無法很好區(qū)分血竭和龍血竭，尤其無法區(qū)分骨筋丸膠囊中血竭摻雜龍血竭的情況。為了考察骨筋丸膠囊處方中的血竭是否按標準投料的情況，本研究經(jīng)篩選指標以龍血素B 為檢測指標，建立了HPLC-DAD 法，對12 家生產(chǎn)企業(yè)47批次骨筋丸膠囊進行了龍血素B 的檢查。

1 儀器與試藥

安捷倫1260 高效液相色譜儀（包括二極管陣列檢測器，美國安捷倫公司）；SQP 電子天平、AR-2140 電子天平（德國賽多利斯公司）；KQ-500DE超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

龍血素B 對照品（批號111558-201407，含量為99.9%，中國食品藥品檢定研究院）。水為超純水，乙腈為色譜純，其余試劑為分析純。

61 批次骨筋丸膠囊（去除重復批號后為47 批次）均為2021 年江西省評價性抽檢樣品，涉及12個生產(chǎn)企業(yè)。陰性樣品為自制。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse-C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B）為流動相；流速為1.0 mL/min；測定波長為277 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL；按照表1 梯度洗脫。

表1 流動相梯度洗脫表

2.2 對照品溶液的制備

取龍血素B 對照品10.93 mg，精密稱定，置25 mL 棕色容量瓶中，加甲醇制成每1 mL 含436.76 μg的龍血素B 標準貯備液。精密吸取龍血素B 標準貯備液適量，用甲醇稀釋成濃度為43.68 μg/mL的溶液，作為對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取骨筋丸膠囊內(nèi)容物，混勻，研細，取約1.5 g（約相當于血竭原藥材0.15 g），精密稱定，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，密塞，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性樣品溶液的制備

為考察本方法的專屬性，試驗共自制以下三種溶液：（1）模擬血竭投料樣品溶液：取血竭適量，按照骨筋丸膠囊處方工藝制成相應的模擬制劑。按“2.3”項下方法制備成溶液，即得。（2）模擬龍血竭投料樣品溶液：取龍血竭適量，按照骨筋丸膠囊處方工藝，以龍血竭代替血竭投料，制成相應的模擬制劑。按“2.3”項下方法制備成溶液，即得。（3）骨筋丸膠囊中缺血竭陰性對照溶液：取處方中除血竭外的其余13 味藥材，按處方比例和制劑工藝制備不含血竭的陰性對照樣品，按“2.3”項下方法制備成缺血竭的陰性對照溶液。

2.5 專屬性試驗

精密吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各20 μL，按“2.1”項下色譜條件進行測定，結果陰性樣品無干擾，色譜峰分離良好，表明該方法專屬性強，典型色譜圖（見圖1）。

圖1 高效液相色譜圖：A.龍血素B對照品溶液；B.模擬龍血竭投料樣品溶液；C.模擬血竭投料樣品溶液；D.供試品溶液（批號：190305）；E.缺血竭陰性對照溶液

2.6 線性關系考察

精密吸取龍血素B 標準貯備溶液適量，用甲醇制成濃度分別為174.70、87.35、43.68、21.84、8.74、3.49 μg/mL 的系列標準溶液。分別吸取上述標準溶液各20 μL，注入液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件進行測定，以峰面積（Y）為縱坐標，相應的對照品濃度（X）為橫坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程為：Y=29.000X+14.355（r=1.000）。結果表明，龍血素B 在濃度3.49～174.70 μg/mL 范圍內(nèi)與峰面積的線性關系良好。

2.7 精密度試驗

精密吸取龍血素B 對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，連續(xù)平行進樣6 次，計算龍血素B 峰面積的RSD 為0.01%，表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取同一份骨筋丸膠囊供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h 進樣測定，計算龍血素B 峰面積的RSD為0.007%。結果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 重復性試驗

分別取骨筋丸膠囊樣品（批號：190305）6 份，每份約1.5 g，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，計算龍血素B平均含量為0.820 3 mg/g,RSD 為0.70%，表明該方法重復性良好。

2.10 加樣回收率試驗

取已知含量骨筋丸膠囊樣品（批號：190305）6份，每份約0.75 g，精密稱定，分別加入龍血素B標準溶液（濃度為218.38 μg/mL）3 mL，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，計算加樣回收率，結果見表2。由表2 可知，該方法準確度良好。

表2 龍血素B加樣回收率試驗結果（n=6）

2.11 47 批次樣品結果

對12 家生產(chǎn)企業(yè)的47 批次樣品進行了龍血素B 的檢查，結果有4 家企業(yè)共11 批次樣品中檢測出龍血素B。以現(xiàn)行質量標準中的薄層色譜法檢測合格的樣品中亦有檢測出龍血素B 的情況，測定結果見表3，檢出率為23.4%。提示部分生產(chǎn)企業(yè)可能存在以龍血竭代替血竭投料或以摻雜龍血竭的血竭投料的情況，需建立相應的檢驗方法對骨筋丸膠囊的中的血竭質量進行控制。

表3 47批次骨筋丸膠囊樣品測定結果 mg/g

3 討論

本研究通過HPLC-DAD 方法發(fā)現(xiàn)龍血竭和血竭藥材紫外光譜特征有差異。龍血竭主要特征成分為龍血素A、龍血素B 等。本研究嘗試以龍血素A作為檢測的指標性成分，但在實驗過程中發(fā)現(xiàn)龍血竭中的龍血素A（保留時間20.193 min）與血竭中的某一成分（保留時間20.098 min）色譜保留時間基本相同，但光譜最大吸收不同，龍血素A 在277 nm 處有最大吸收，血竭中的這一成分在290 nm 有最大吸收。將血竭和龍血竭以不同比例摻偽，發(fā)現(xiàn)當血竭里摻偽龍血竭比例比較大的情況下，可發(fā)現(xiàn)樣品在該保留時間的色譜峰在277 nm 波長處吸收最大，紫外吸收光譜與龍血素A 對照品一致。但當摻入龍血竭比例較少的情況下，色譜峰在290 nm下有最大吸收，與血竭中的這一色譜峰吸收光譜一致。因此以龍血素A 為鑒別特征，可能存在假陰性的情況。龍血竭中龍血素B 在277 nm 波長處也有最大吸收，而血竭在龍血素B 色譜峰（保留時間21.501 min）處無相應色譜吸收峰。因此本方法選用龍血素B 為指標性成分，建立了骨筋丸膠囊中龍血竭摻偽血竭的檢查方法，專屬性較好。

以本研究擬定的方法對47 批次骨筋丸膠囊進行檢測，有11 批次檢出龍血素B，檢出率高達23.4%，其中有2 批次檢出龍血素B 的樣品為按現(xiàn)行法定標準中薄層色譜法檢測合格的樣品。所以為了保障患者用藥安全性和有效性，應盡快完善現(xiàn)有質量標準，防止出現(xiàn)“合格的劣藥”的現(xiàn)象。

本實驗以龍血素B 為指標性成分采用HPLC 法進行快速篩查，同時采用DAD 檢測器結合色譜峰紫外光譜圖進行確證，能夠有效鑒別出骨筋丸膠囊中龍血竭代替血竭投料的情況，尤其是能夠鑒別出以摻雜龍血竭的血竭投料的情況。該方法具有直觀、可靠、專屬、可重復性等特點，能夠有效用于骨筋丸膠囊的血竭質量控制。