miR-25通過調(diào)節(jié)TGF-β信號傳導通路促進胃癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移*

宋釘町 馬博 曹博威 來比江·吾斯曼 張文斌

胃癌（gastric cancer，GC）是胃腸道一種常見的惡性疾病，相關統(tǒng)計顯示，胃癌已成為全球第五大癌癥，是繼肺癌、結(jié)直腸癌和肝癌的第四大死亡原因[1]。在我國，盡管胃癌的發(fā)病率和死亡率都在下降，但仍處于世界較高水平，且存在性別和年齡差異，疾病負擔集中在高齡人群，而我國的人口老齡化逐漸加重，了解其可能的發(fā)病機制，并實施精準性防控策略刻不容緩[2-3]。隨著現(xiàn)代分子生物學的不斷發(fā)展，microRNA（miRNA）在胃癌的早期診斷、疾病干預和預后評價中發(fā)揮了越來越重要的作用。miRNA 是單鏈、高度保守的小分子非編碼RNA，含有20～24 個寡核苷酸，以組織特異性的方式表達。miRNA 主要是通過與目標mRNA 3'非編碼區(qū)的堿基配對進行交互作用，利用mRNA 的降解或翻譯抑制，對目標基因的表達進行調(diào)控，到現(xiàn)在為止，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，多達30%的人類基因的表達都受到它的調(diào)控，并對人體生長發(fā)育，細胞增殖、凋亡，以及新陳代謝等重要的生理過程產(chǎn)生影響[4-5]。胃癌的增殖與轉(zhuǎn)移是一個多步驟、多階段、多因素調(diào)控的持續(xù)而復雜的生物學過程，在此過程中miRNA 發(fā)揮著重要的作用[6]，但其機制尚不明確。因此，我們將以人胃癌細胞SGC-7901 為切入點，從細胞和分子兩個層面，深入探討miR-25 在人胃癌細胞SGC-7901 增殖、侵襲、遷移、凋亡等方面的作用及其可能的作用機制，為闡明miR-25在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃癌細胞SGC-7901 購自普諾賽（貨號：CL-0206），采用上海生工生物工程股份有限公司制備的miR-25 及內(nèi)參U6 引物，使用從杭州朗基科技儀器有限公司采購的熒光PCR 定量分析（型號：Q2000B），使用Elabscience 公司生產(chǎn)的Annexin V-APC/7-AAD 雙染法細胞凋亡檢測試劑盒（貨號：E-CK-A218），從合肥白鯊生物科技有限公司購入總RNA 提取試劑（貨號：BS259A），自北京凱奧科技發(fā)展有限公司購入酶標儀及超微量分光光度計（型號：K5800），CCK-8（貨號：BA00208）、beta-Actin（貨號：bs-0061R）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）抗體（貨號：bs-0086R）均購于中國Bioss 公司，從Solarbio 公司購入BCA 蛋白濃度測定試劑盒（貨號：PC0020），細胞流式儀（型號：LSRII）購自BD 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將凍存的人胃癌細胞SGC-7901從液氮罐中取出，37 ℃水浴鍋中解凍復蘇，室溫下每分鐘1 000 r，離心5 min，棄去上清液，轉(zhuǎn)入60 mm 的細胞培養(yǎng)皿中，5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。在顯微鏡下觀察人胃癌細胞SGC-7901 的生長密度，達到細胞培養(yǎng)皿面積的90%左右時，用無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2 次，0.25%胰蛋白酶消化后傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染及分組 6 孔板一個孔接種（1～4）×105個對數(shù)期生長的貼壁細胞，37 ℃培養(yǎng)過夜，第二天觀察細胞密度在40%～60%時，進行慢病毒感染。根據(jù)人胃癌細胞SGC-7901 的MOI=10，分別往細胞中加入滴度為1×108TU/mL 的空載慢病毒和干擾慢病毒200 μL，分別設置正常組、miR-25 干擾慢病毒組和miR-25 干擾慢病毒空載組。

1.2.3 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測miR-25的轉(zhuǎn)染效率 收集3 組人胃癌細胞SGC-7901，提取總RNA 并檢測純度及濃度。遵逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將miRNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。 基于GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列設計miR-25 的qRT-PCR 引物（F-CATTGCACTTGTCTCGGTCTGA） 及U6 的qRTPCR 引物（F-AGCACATATACTAAAATTGGAACGAT），PCR 擴增以cDNA 為模板進行。反應程序為：95 ℃5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，45 個循環(huán)，反應體系為10 μL。將提取的RNA 吸取2 μL 用超微量分光光度計測定RNA 濃度。每組實驗重復3 次，取平均值。

1.2.4 細胞增殖實驗（cell counting kit-8，CCK-8）慢病毒感染成功后，在96 孔平板中接種細胞[（1～2）×104細胞]并培養(yǎng)24 h，在每個孔中添加10 μL 的CCK-8 溶液，并持續(xù)在培養(yǎng)箱中溫育1～4 h。酶標儀檢測450 nm 波長下各孔的吸光值，計算細胞存活率。實驗重復3 次，取平均值。

1.2.5 Transwell 法檢測細胞侵襲 Matrigel 膠按1∶8的比例用RPMI 1640 培養(yǎng)基稀釋，將Transwell 小室底部膜覆蓋在上室表面，在37 ℃下放置4 h，讓Matrigel 聚合為凝膠，對細胞進行2～3 min 的消化，然后停止消化，離心，將培養(yǎng)基取出，用PBS 沖洗2 次，再用無血清的培養(yǎng)基重新懸浮。將細胞密度調(diào)節(jié)到每毫升1.0×105。在Transwell 小室內(nèi)添加100 μL 的細胞懸液。在24 孔平板下腔中添加750 μL 含血清的培養(yǎng)基，將小腔置于平板中，置于5% CO2培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)24 h。

1.2.6 細胞劃痕實驗（cell scratch assay） 檢測細胞遷移能力，用marker 筆在6 孔板背后，每隔1 cm均勻的劃一條橫穿過孔的基準線，取對數(shù)生長期細胞消化重懸為細胞懸液，約5×105個細胞每孔的密度接種至6 孔板內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)至細胞貼壁。使用同一20 μL 槍頭以直尺輔助垂直基準線劃痕，使不同孔之間的劃痕寬度盡量一致，使用PBS 清洗3 次，去除游離細胞，觀察劃痕處清晰筆直且無細胞殘留，以基準線輔助拍攝0、24 h 照片。計算公式：傷口愈合百分比=[初始面積（0 h）-24 h 的面積]/初始面積×100%。

1.2.7 細胞凋亡實驗 將轉(zhuǎn)染后的不同組分的細胞，用胰蛋白酶消化后，用Annexin V-APC/7-AAD染色，用流式細胞儀測定細胞的凋亡率。

1.2.8 蛋白質(zhì)印跡法（western blotting） 完成細胞蛋白抽提后，嚴格按照BCA 蛋白濃度測定試劑盒說明書進行蛋白定量，以目標蛋白的分子量為依據(jù)，選用10%配膠試劑盒配膠，待檢測蛋白樣品上樣量為20 μg/孔，待膠凝固之后，將膠連同玻璃板從架子上拿下，裝進電泳內(nèi)槽中，加樣面向內(nèi)，將內(nèi)槽放進電泳外槽中，在內(nèi)槽中加滿電泳液（要注意內(nèi)槽安裝的密封性，避免漏液），在外槽中加入電泳液到內(nèi)槽高度約1/3 處。接上電源，用50～85 V的低壓讓試樣穿過濃縮膠，30 min 后，等蛋白質(zhì)分子達到分離膠時，再把電壓提高到100～130 V，直至溴酚藍達到膠體的最底面（大約1.5 h），切斷電源，停止電泳，封閉，轉(zhuǎn)模，溫育，然后把試樣放到膠體成像儀上進行圖像處理，并拍照記錄。

1.3 統(tǒng)計學處理

所得數(shù)據(jù)均以SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件處理。計量資料以（±s）表示，兩組間比較用t 檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞轉(zhuǎn)染后miR-25 的表達水平

與正常組miR-25 表達水平[（1.003±0.098）%]相比，miR-25 干擾慢病毒組[（0.287±0.122）%]明顯更低，差異有統(tǒng)計學意義（t=10.160，P＜0.05）；正常組與miR-25 干擾慢病毒空載組miR-25 表達水平[（0.803±0.151）%]比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=0.026，P＞0.05）。見圖1。

2.2 抑制miR-25 表達對人胃癌細胞SGC-7901 增殖的影響

與正常組增殖率[（100±0）%]相比，miR-25干擾慢病毒組[（64.81±8.67）%]明顯更低，差異有統(tǒng)計學意義（t=10.260，P＜0.05）；正常組與miR-25干擾慢病毒空載組增殖率[（93.17±9.49）%]比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=0.039，P＞0.05）。

2.3 Transwell 檢測細胞侵襲性結(jié)果

將Transwell 小室放入顯微鏡下，隨機選擇3 個視野，計算通過基底膜的細胞數(shù)目。與對照組[（287.7±11.5）個]相比，miR-25 干擾慢病毒組侵襲能力[（190.7±10.02）個]明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.201，P＜0.05）；正常組與miR-25 干擾慢病毒空載組的侵襲能力[（304±10.58）個]比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=0.039，P＞0.05）。見圖2。

圖2 各組細胞侵襲結(jié)果

2.4 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力結(jié)果

完成實驗后，從0、24 h 兩個時間點，觀察細胞遷移的面積（200×），進而計算遷移率。與對照組遷移率[（69.53±7.34）%]相比，miR-25 干擾慢病毒組[（46.56±9.251）%]明顯更低，差異有統(tǒng)計學意義（t=5.251，P＜0.05）；正常組與miR-25 干擾慢病毒空載組的遷移率[（61.845±9.759）%]比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=0.477，P＞0.05）。見圖3。

圖3 各組細胞劃痕結(jié)果

2.5 人胃癌細胞SGC-7901 凋亡結(jié)果

與正常組細胞凋亡率[（15.13±3.36）%]相比，miR-25 干擾慢病毒組[（22.17±3.15）%]更高，差異有統(tǒng)計學意義（t=6.591，P＜0.05）；正常組與miR-25 干擾慢病毒空載組細胞凋亡率遷移率[（15.360±0.821）%] 比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=0.004，P＞0.05）。流式圖Q1 表示這一部分的細胞是壞死的，但也可能存在少量的后期凋亡的細胞或是被機械破壞的細胞。Q2 代表此區(qū)域的細胞為晚期凋亡細胞。Q3 代表此區(qū)域的細胞為活細胞。Q4 代表此區(qū)域的細胞為早期凋亡細胞。見圖4。

圖4 各組SGC-7901細胞凋亡結(jié)果

2.6 人胃癌細胞SGC-7901 中TGF-β 蛋白表達情況

與正常組TGF-β 蛋白表達量[（0.610±0.03）mg/mL]相比，miR-25 干擾慢病毒組[（0.751±0.03）mg/mL]顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（t=6.501，P＜0.05）；正常組與miR-25 干擾慢病毒空載組的TGF-β 蛋白表達量[（0.751±0.030）mg/mL]比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=0.485，P＞0.05）。各組樣本中TGF-β 蛋白表達量條帶見圖5。

圖5 各組樣本中TGF-β蛋白表達量條帶圖

3 討論

越來越多的研究表明，miRNA 的表達異常與多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展、遠處轉(zhuǎn)移及預后密切相關[7-11]。miR-25 定位在人7q22.1 染色體上的miRNA-7 上[12]，Guo 等[7]的研究表明miR-25 通過直接抑制B 細胞易位基因2（BTG2）的表達促進食管鱗狀細胞癌的進展，miR-25 的敲除有助于抑制食管癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。有研究發(fā)現(xiàn)食管癌患者血漿外泌體中的miR-25 表達水平明顯高于健康人群，且與食管癌組織中的表達量呈正相關，提示外泌體miR-25 可作為食管癌早期診斷的生物標志物[13]。Hesari 等[14]對乳腺癌患者的研究表明，miR-25 的表達降低與其臨床分期、轉(zhuǎn)移和生存時間顯著相關。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-25 在非小細胞肺癌患者血清中的表達水平與外周浸潤、病理分級、腫瘤直徑、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床特點有很強的相關性，它還會對患者的5 年生存率產(chǎn)生影響，可以作為評價患者預后的一種重要的腫瘤標志物。我國學者對結(jié)腸癌的一項研究顯示，miR-25-3p 在結(jié)腸癌患者中明顯增高，且與患者的臨床病理指標呈正相關，是結(jié)腸癌診斷及判斷患者預后的潛在標志物[15]。miR-25是一個在胃癌組織中高表達的微小RNA，我們的實驗結(jié)果表明，下調(diào)miR-25 可顯著抑制人胃癌細胞SGC-7901 的增殖、遷移和侵襲能力，并誘導其凋亡。本項目擬深入研究miR-25 對胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響，并在分子水平上闡明其可能的作用機制。

TGF-β 信號傳導在包括癌癥在內(nèi)的炎癥性疾病的進展中發(fā)揮了重要作用。TGF-β 通過抑制細胞生長和刺激細胞凋亡來維持哺乳動物組織的穩(wěn)態(tài)。癌細胞過度產(chǎn)生TGF-β 導致局部纖維化和免疫抑制微環(huán)境，促進腫瘤生長，并與癌細胞的侵襲性和轉(zhuǎn)移性行為相關[16]。人體內(nèi)大多數(shù)有核細胞都有分泌TGF-β 的能力，在癌癥發(fā)生時，TGF-β 主要由腫瘤浸潤區(qū)的腫瘤細胞、基質(zhì)細胞和巨噬細胞分泌[17]，主要是通過上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）來促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[18]，在此信號途徑被活化之后，可以使上皮細胞更具有侵襲性，從而增加上皮細胞的生長速度和遷移能力[19]。同時，TGF-β通過刺激B 淋巴細胞和T 淋巴細胞凋亡，引發(fā)腫瘤微環(huán)境的免疫抑制，阻止腫瘤內(nèi)浸潤免疫細胞的激活，讓腫瘤逃脫宿主免疫的監(jiān)視[20-21]。有研究表明，阻斷TGF-β 信號通路可有效阻止癌細胞在體內(nèi)發(fā)生EMT[22]。一項關于胰腺癌（PC）的研究表明，在PC 早期，TGF-β 是一種具有抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡，激活自噬，通過基質(zhì)成纖維細胞抑制生長因子信號傳導，抑制炎癥，抑制血管生成，從而保持正常組織動態(tài)平衡的重要的腫瘤抑制因子，而在PC 晚期，通過誘導EMT 逃避細胞凋亡，從而促進腫瘤微環(huán)境的形成，促進晚期腫瘤的進展[23-24]。但TGF-β 對早期腫瘤的抑制作用如何被癌細胞的侵襲性和轉(zhuǎn)移性反應所取代的機制尚不明確[25]。由于TGF-β 的表達與不良預后相關，且其轉(zhuǎn)導途徑不同于細胞因子，因此TGF-β 及其信號轉(zhuǎn)導途徑為靶向治療提供了新思路，目前研究最廣泛的化合物是TβRⅠ抑制劑Galunisertib，也被稱為LY2157299，已被證明具有在體外抑制肺癌和乳腺癌細胞生長的作用[26]。

為進一步證實并探討miR-25 對TGF-β 信號傳導通路促進胃癌增殖和轉(zhuǎn)移的影響，本研究通過降低胃癌細胞miR-25 表達并對人胃癌細胞SGC-7901 進行了TGF-β 蛋白的測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在miR-25 干擾慢病毒組中，TGF-β 蛋白表達量顯著增加。進一步驗證，miR-25 通過TGF-β 信號傳導通路促進胃癌增殖和轉(zhuǎn)移。但本研究未展開探討miR-25 調(diào)控TGF-β 信號傳導通路促進胃癌增殖和轉(zhuǎn)移的具體機制及其是否對除早期生長反應蛋白2（EGR2）[27]、富含半胱氨酸蛋白（RECK）[28]、磷酸酶與張力蛋白同源物基因（PTEN）[29]、BTG2[30]等已知的基因以外的某些基因具有靶向調(diào)控作用從而促進胃癌的發(fā)生發(fā)展，這將是后續(xù)實驗的研究重點。

綜上所述，miR-25 表達下調(diào)可顯著抑制人胃癌細胞SGC-7901 的增殖、遷移和侵襲能力，并可促進其凋亡，從分子水平進一步闡明胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移的可能機制，本研究將有助于深入理解胃癌的發(fā)病機理，并可能為胃癌的防治提供新的思路。