低溫?zé)踔笱喔C增強(qiáng)免疫功能研究

陰佳璐，袁滿，鄂敬文，周時蒙，張悅，王東亮

1.河北省燕窩鮮燉技術(shù)創(chuàng)新中心（廊坊 065700）；2.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院綜合檢測中心（北京 100176）

免疫包含先天性免疫和適應(yīng)性免疫，是人體重要的保護(hù)性生理功能[1]。免疫力低下容易受到外界病原體的感染，從而更容易患上各種疾病，因此增強(qiáng)免疫有助于預(yù)防感染性疾病、惡性腫瘤和自身免疫性疾病的發(fā)生，對維持人體健康具有重要意義[2-3]。免疫系統(tǒng)由免疫器官、免疫細(xì)胞和免疫因子三部分組成，這些指標(biāo)的變化代表機(jī)體免疫功能的改變[4]?，F(xiàn)代科學(xué)研究表明，功能性食品在增強(qiáng)人類健康狀況、降低患病風(fēng)險方面起著重要作用，可作為滿足消費者提升免疫需求首要選擇[5]。

燕窩是金絲燕利用其唾液分泌物與羽毛或草屑而制成的巢穴，作為傳統(tǒng)中式滋補(bǔ)品，距今有600多年食用歷史[6]。燕窩因其營養(yǎng)價值、藥用價值和經(jīng)濟(jì)價值，已成為我國重要的產(chǎn)業(yè)，據(jù)統(tǒng)計2021年燕窩行業(yè)總銷售額已突破400億元。燕窩主產(chǎn)地分布在印度尼西亞、馬來西亞、泰國等東南亞地區(qū)[7]。現(xiàn)代科學(xué)研究顯示，燕窩中含有蛋白質(zhì)、唾液酸、礦物質(zhì)等多種營養(yǎng)成分。蛋白質(zhì)作為燕窩的主要成分，其含量可達(dá)到燕窩干重的42%～63%。此外，唾液酸在燕窩的生物活性中也起著重要作用，含量占比一般為7%～12%[8-10]。古籍記載燕窩具有潤肺滋陰、調(diào)補(bǔ)虛勞、化痰止咳、益氣補(bǔ)中、潤腸開胃等效用[11]。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，研究顯示燕窩具有調(diào)節(jié)免疫、抗病毒、改善皮膚、抗氧化、促進(jìn)神經(jīng)發(fā)育、維護(hù)骨骼和關(guān)節(jié)健康等多種作用[12-13]。

體外及體內(nèi)的研究表明，干燕窩可通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞、脾淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞功能，以及調(diào)節(jié)IFN-γ、TNF等免疫因子水平起到增強(qiáng)免疫作用[14-17]。但仍缺乏對燉煮燕窩調(diào)節(jié)免疫作用相關(guān)研究，并且缺乏有效劑量證明。因此，采用正常小鼠模型進(jìn)行試驗，探討低溫?zé)踔笱喔C體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)作用，可為低溫?zé)踔笱喔C進(jìn)一步作為增強(qiáng)免疫功能性食品的開發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

低溫?zé)踔笱喔C（北京小仙燉生物科技有限公司提供，經(jīng)凍干處理后得到凍干粉）。超凈工作臺（蘇州安泰有限公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（上海一恒有限公司）；離心機(jī)（sigma有限公司）；恒溫水浴鍋（力辰科技有限公司）；酶標(biāo)儀（賽默飛有限公司）；綿羊紅細(xì)胞（SRBC）、雞紅細(xì)胞、生理鹽水、Hank’s液（pH 7.2）、RPMI-1640培養(yǎng)液、小牛血清、青鏈霉素、刀豆蛋白A（ConA）、1%冰醋酸、1mol/L的HCl、異丙醇、瓊脂糖、YAC-1細(xì)胞、MTT、PBS緩沖液、補(bǔ)體（豚鼠血清）、SA緩沖液、乳酸鋰、碘硝基氯化四氮唑、吩嗪二甲酯硫酸鹽、氧化型輔酶Ⅰ、Tris-HCl、文齊氏試劑、1% NP40、印度墨汁、0.1%Na2CO3、Giemsa染液等：所有試劑均采購自上海麥克林生化科技股份有限公司。

試驗使用體重18～22 g的SPF級雌性ICR小鼠[許可證號SCXK（京）2021-0006，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司]。小鼠飼養(yǎng)期間自由攝入食物及飲水，飼料喂以塊狀標(biāo)準(zhǔn)（SPF級）飼料，動物飼料來自北京科澳協(xié)力飼料有限公司[許可證號SCXK（京）2019-0003]。動物房溫度恒定在20～26 ℃，濕度維持在40%～70%。

試驗設(shè)置空白對照組及低、中、高劑量低溫?zé)踔笱喔C組。采用經(jīng)口灌胃的方式進(jìn)行，低、中、高劑量設(shè)為人體推薦低溫?zé)踔笱喔C食用量的5，10和30倍，即0.188，0.375和1.125 g/kg。按0.2 mL/（10 g·Bw）給予灌胃。連續(xù)灌胃30 d，每周根據(jù)體重調(diào)整灌胃量。選用正常動物模型，隨機(jī)選取192只ICR小鼠，平均分為4個免疫指標(biāo)組。免疫指標(biāo)1組進(jìn)行遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)試驗、臟器/體重比值、半數(shù)溶血值測定和抗體生成細(xì)胞檢測；免疫指標(biāo)2組進(jìn)行碳廓清試驗；免疫指標(biāo)3組進(jìn)行巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞能力試驗；免疫指標(biāo)4組進(jìn)行ConA誘導(dǎo)小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗和NK活性測定試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 小鼠臟器/體重比值測定

小鼠稱重后頸椎脫臼處死，取脾臟和胸腺，去盡筋膜，用濾紙吸干臟器表面血污，稱重，計算脾臟/體重比值和胸腺/體重比值。

1.2.2 足跖增厚法測定遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)

取新鮮的脫纖維羊血，生理鹽水洗滌3次，每只小鼠腹腔注射0.2 mL 2%（V/V，用生理鹽水配制）SRBC，致敏后4 d測量左后足跖部厚度，同一部位測量3次，取平均值。在測量部位皮下注射20 μL 20%（V/V，用生理鹽水配制）SRBC，注射后于24 h測量左后足跖部厚度，同一部位測量3次取平均值，以攻擊前后足跖厚度的差值表示遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的程度。

1.2.3 ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗

小鼠處死后在75%酒精的燒杯中滅菌10 min后，無菌取脾，置于裝有高壓滅菌的3 cm×3 cm的4層紗布的無菌平皿中，加入適量無菌Hank’s液，用紗布將脾包住，用彎頭鑷輕輕將脾磨碎，制成單細(xì)胞懸液，用Hank’s液洗3次，每次按1 000 r/min離心10 min，計數(shù)活細(xì)胞數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度2×107個/mL，取0.4 mL細(xì)胞懸液分兩孔加入24孔板中，總體積每孔1 mL，其中一孔加入75 μL ConA液，另一孔作為對照，置于5% CO2，37 ℃培養(yǎng)72 h。在培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔輕輕吸取0.7 mL上清液，加入0.7 mL不含小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，同時每孔加入50 μL 5 mg/mL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入1 mL酸性異丙醇，吹打均勻，使紫色結(jié)晶完全溶解。移入96孔板中，在酶標(biāo)儀上進(jìn)行測定，波長為570 nm。

1.2.4 抗體生成細(xì)胞檢測試驗

取新鮮的脫纖維羊血，用生理鹽水洗滌3次，每只小鼠腹腔注射0.2 mL 2%（V/V，用生理鹽水配制）SRBC，致敏后4 d處死小鼠，取全脾制成細(xì)胞懸液，加入8 mL Hank’s溶液。將表層培養(yǎng)基加熱溶解后，與等量雙倍Hank’s液混合，分裝小試管，每管0.5 mL，向管內(nèi)加50 μL 10%（V/V，用SA緩沖液配制）壓積SRBC和20 μL脾細(xì)胞懸液，迅速混勻，傾倒至已刷瓊脂糖薄層的玻片上；待瓊脂凝固后，將玻片水平扣放在片架上，放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1.5 h，用SA緩沖液稀釋的補(bǔ)體（1︰8）放入玻片架凹槽內(nèi)，繼續(xù)孵育2.0 h，計數(shù)溶血空斑數(shù)。

1.2.5 血清溶血素半數(shù)溶血值（HC50）的測定

取新鮮的脫纖維羊血，用生理鹽水洗滌3次（2 000 r/min，10 min），每只鼠腹腔注射0.2 mL 2%（V/V，用生理鹽水配制）壓積SRBC，致敏后4 d，摘除眼球取血于1.5 mL離心管內(nèi)，放置約1 h，使血清充分析出，按2 000 r/min離心10 min，收集血清。用SA緩沖液稀釋300倍，將0.1 mL稀釋后的血清置96孔板內(nèi)，依次加入0.05 mL 10%（V/V）SRBC和0.1 mL（用SA緩沖液按1︰8稀釋）補(bǔ)體，置于37 ℃恒溫水浴保溫30 min，冰浴終止反應(yīng)。按1 500 r/min離心10 min，取0.05 mL上清液，加0.15 mL文齊氏試劑，同時，取0.012 5 mL 10%（V/V，用SA緩沖液配制）壓積 SRBC，加文齊氏試劑至0.2 mL，至另一96孔板，充分混勻。放置10 min后，在540 nm波長下，用酶標(biāo)儀分別測定各孔光密度。溶血素的量以半數(shù)溶血值（HC50）表示。

1.2.6 小鼠碳廓清試驗

給予小鼠尾靜脈注射用生理鹽水4倍稀釋的印度墨汁，待墨汁注入后，立即計時。分別在注入墨汁后的2 min和10 min后，從眼內(nèi)眥靜脈叢取20 μL血，并將其加到2 mL 0.1% Na2CO3溶液中，用酶標(biāo)儀在600 nm波長處測定光密度，以Na2CO3溶液作空白對照，其中注入墨汁后的2 min所取血標(biāo)本光密度記為OD1，注入墨汁后的10 min所取血標(biāo)本光密度記為OD2。小鼠稱重處死后取肝臟、脾臟稱重。根據(jù)動物體重、肝重和脾重計算吞噬指數(shù)。按式（3）和（4）計算吞噬指數(shù)a。

1.2.7 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗

每只小鼠腹腔注射1 mL 5%壓積雞紅細(xì)胞懸液。間隔2.5 h，頸椎脫臼處死動物，將其仰位，正中剪開腹壁皮膚，經(jīng)腹腔注射2 mL生理鹽水，轉(zhuǎn)動小鼠1 min。吸出1 mL腹腔洗液，平均分滴于2片載玻片上，放入墊有濕紗布的搪瓷盒內(nèi)，移至37 ℃孵箱孵育30 min。孵畢，于生理鹽水中漂洗，以除去未貼片細(xì)胞，晾干。以1︰1丙酮-甲醇溶液固定（V/V，1︰1配制），經(jīng)4%（V/V）Giemsa-磷酸鹽緩沖液染色3 min，用蒸餾水漂洗晾干。油鏡下計數(shù)吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)及被吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù)，每張片計數(shù)100個，按式（5）和（6）計算吞噬百分率和吞噬指數(shù)。

1.2.8 NK細(xì)胞活性測定試驗

前24 h將靶細(xì)胞YAC-1進(jìn)行傳代培養(yǎng)，用前以Hank’s液洗3次，用含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105個/mL。小鼠頸椎脫臼處死，無菌取脾，制成脾細(xì)胞懸液，用Hank’s液洗3次，按1 000 r/min離心10 min，用1 mL含10%小牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基重懸，用臺盼藍(lán)活細(xì)胞染色計數(shù)（活細(xì)胞數(shù)應(yīng)在95%以上），調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107個/mL，使效靶比50︰1。取靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞各100 μL，加入U型96孔培養(yǎng)板中，靶細(xì)胞自然釋放孔加靶細(xì)胞和培養(yǎng)液各100 μL，靶細(xì)胞最大釋放孔加靶細(xì)胞和1% NP40各100 μL，上述均設(shè)3個平行孔，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)4 h，將96孔培養(yǎng)板以1 500 r/min離心5 min，每孔吸取100 μL上清液置平底96孔培養(yǎng)板中，同時加入100 μL LDH基質(zhì)液，避光反應(yīng)10 min，每孔加入30 μL 1 mol/L的HCl溶液終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀492 nm處測光密度。NK活性按式（7）計算。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗所得數(shù)據(jù)均采用GraphPad Prism 9.4數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”（Mean±SD）的形式表示。組間比較采用LSD檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫?zé)踔笱喔C對小鼠免疫臟器/體重比值的影響

低溫?zé)踔笱喔C對小鼠胸腺及脾臟質(zhì)量比值的影響如表1所示。胸腺和脾臟是機(jī)體重要的免疫器官，可通過調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)在機(jī)體免疫功能中發(fā)揮重要作用，它們的質(zhì)量比值在一定程度上表明機(jī)體先天免疫的能力[4]。試驗中，經(jīng)口給予小鼠不同劑量低溫?zé)踔笱喔C30 d，與空白對照組相比，小鼠胸腺/體重比值和脾臟/體重比值無顯著性差異（P＞0.05），表明低溫?zé)踔笱喔C對免疫器官指數(shù)無影響。

表1 低溫?zé)踔笱喔C對小鼠臟器/體重比值的影響（±SD，n=12）

表1 低溫?zé)踔笱喔C對小鼠臟器/體重比值的影響（±SD，n=12）

2.2 低溫?zé)踔笱喔C對小鼠細(xì)胞免疫功能的影響

遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)是由于抗原進(jìn)入機(jī)體后，細(xì)胞在局部接受抗原信息轉(zhuǎn)化為致敏淋巴細(xì)胞。致敏淋巴細(xì)胞再次接觸相同抗原時，釋放出多種淋巴因子，促使血流中單核細(xì)胞向局部聚集和吞噬抗原。遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)是以淋巴細(xì)胞和單核-巨噬細(xì)胞浸潤為主的滲出性炎癥，因此可通過測量皮膚再次受相同抗原刺激后的腫脹厚度反映細(xì)胞免疫功能的強(qiáng)弱[18]。試驗結(jié)果如表2所示，小鼠足趾腫脹度在各劑量組與對照組間比較無顯著性差異。

表2 低溫?zé)踔笱喔C對小鼠足趾腫脹和ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗的影響（±SD，n=12）

表2 低溫?zé)踔笱喔C對小鼠足趾腫脹和ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗的影響（±SD，n=12）

淋巴細(xì)胞是適應(yīng)性免疫反應(yīng)的關(guān)鍵參與細(xì)胞，主要負(fù)責(zé)激活抗原呈遞和有絲分裂原刺激過程。脾臟淋巴細(xì)胞增殖是激活細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)的重要生物標(biāo)志物，而這種活性是由有絲分裂原ConA誘導(dǎo)，通常用于評估T或B淋巴細(xì)胞活性[19-22]。低溫?zé)踔笱喔C對小鼠淋巴細(xì)胞增殖試驗結(jié)果如表2所示，低溫?zé)踔笱喔C中劑量組可以顯著促進(jìn)ConA刺激的脾淋巴細(xì)胞增殖（P＜0.01）。

2.3 低溫?zé)踔笱喔C對小鼠體液免疫功能的影響

溶血空斑試驗是一種定量測量樣品增強(qiáng)體液免疫反應(yīng)的方法，可用于檢測和計數(shù)產(chǎn)生IgM及其他類型免疫球蛋白的抗體生成細(xì)胞（漿細(xì)胞），溶血空斑數(shù)即為抗體生成細(xì)胞數(shù)，可用于表征體液免疫功能強(qiáng)弱[23]。低溫?zé)踔笱喔C對小鼠抗體生成細(xì)胞數(shù)如表3所示，各劑量組均可以顯著增加小鼠抗體生成細(xì)胞數(shù)（P＜0.01）。此外，血清溶血素水平作為體液免疫的重要指標(biāo)，可以反映B細(xì)胞與特定抗原接觸后分泌溶血素的能力[24]。小鼠半數(shù)溶血值（HC50）在高、中、低劑量與對照組間比較均無顯著性差異（P＞0.05）。

表3 低溫?zé)踔笱喔C對抗體生成細(xì)胞數(shù)和HC50的影響（±SD，n=12）

表3 低溫?zé)踔笱喔C對抗體生成細(xì)胞數(shù)和HC50的影響（±SD，n=12）

2.4 低溫?zé)踔笱喔C對小鼠單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

碳廓清試驗可以評估樣品對網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（reticuloendothelial system，RES）的影響，RES是由吞噬細(xì)胞組成的彌散系統(tǒng)，RES細(xì)胞在從血流中清除顆粒方面起著至關(guān)重要的作用[25]。當(dāng)小鼠靜脈注射含有膠體碳的墨水時，巨噬細(xì)胞會吞噬墨水中的碳顆粒，墨水（碳顆粒）從血液中清除的速度稱為吞噬指數(shù)，吞噬細(xì)胞在宿主防御中起著不可或缺的作用[26]。如表4所示，高劑量組低溫?zé)踔笱喔C增加血液中膠體碳的清除率，顯著提高吞噬指數(shù)，這可能是因為高劑量組低溫?zé)踔笱喔C組小鼠RES活性增加所致。

表4 低溫?zé)踔笱喔C對小鼠單核-巨噬細(xì)胞碳廓清能力和小鼠巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞能力的影響（±SD，n=12）

表4 低溫?zé)踔笱喔C對小鼠單核-巨噬細(xì)胞碳廓清能力和小鼠巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞能力的影響（±SD，n=12）

吞噬細(xì)胞包括單核巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，具有對顆粒性異物進(jìn)行吞噬和消化的功能，在機(jī)體固有性免疫中發(fā)揮重要作用。小鼠腹腔注射雞紅細(xì)胞后，會被腹腔中的巨噬細(xì)胞吞噬。因此通過計算腹腔巨噬細(xì)胞吞噬百分率和吞噬指數(shù)，可有效評估小鼠吞噬細(xì)胞的吞噬功能[27]。試驗結(jié)果如表4所示，各劑量組低溫?zé)踔笱喔C均可以顯著提高小鼠巨噬細(xì)胞吞噬率及吞噬指數(shù)（P＜0.01）。

2.5 低溫?zé)踔笱喔C對小鼠NK細(xì)胞活性的影響

NK細(xì)胞處于保護(hù)機(jī)體免受病原體侵襲和感染的第一道防線，以非特異性殺死病原體和受感染細(xì)胞而聞名，證明NK細(xì)胞在免疫系統(tǒng)的早期階段控制感染中發(fā)揮作用[28-29]。NK細(xì)胞還可通過釋放免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和趨化因子、調(diào)節(jié)DC活性及粒細(xì)胞生長和分化調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，NK細(xì)胞在先天性免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，并起到從先天性免疫反應(yīng)到適應(yīng)性免疫反應(yīng)的橋梁作用[30]。

因此為確定低溫?zé)踔笱喔C對NK細(xì)胞活性影響，測定從共培養(yǎng)的脾細(xì)胞和YAC-1細(xì)胞獲得的上清液中乳酸脫氫酶（LDH）的相對量。試驗結(jié)果如表5所示，與空白對照組相比，低中劑量組低溫?zé)踔笱喔C的NK細(xì)胞活性無顯著性影響，而高劑量組低溫?zé)踔笱喔C可以顯著促進(jìn)NK細(xì)胞活性（P＜0.05），表明低溫?zé)踔笱喔C具有通過NK細(xì)胞自身誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)機(jī)制來改善免疫系統(tǒng)的潛力。

表5 低溫?zé)踔笱喔C對小鼠NK細(xì)胞活性的影響（±SD，n=12）

表5 低溫?zé)踔笱喔C對小鼠NK細(xì)胞活性的影響（±SD，n=12）

3 結(jié)論

綜上所述，試驗揭示低溫?zé)踔笱喔C的免疫調(diào)節(jié)功能。依據(jù)動物試驗結(jié)果，低溫?zé)踔笱喔C不僅可以顯著提高小鼠抗體生成細(xì)胞數(shù)，增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞能力，還可有效提升NK細(xì)胞活性，結(jié)果表明低溫?zé)踔笱喔C可作為一種增強(qiáng)免疫功能性食品。試驗結(jié)果進(jìn)一步為燕窩保健食品開發(fā)利用提供科學(xué)的參考依據(jù)。