LC-MS法對畜禽肉中四環(huán)素類藥物含量的測定與分析

張永芳，李曉

1.鄭州科技學院食品科學與工程學院（鄭州 450000）；2.鄭州科技學院鄭州市食品安全快速檢測重點實驗室（鄭州 450000）

四環(huán)素類藥物是由金黃色鏈霉菌所形成的一類抗菌化合物，能夠抑制細菌蛋白質(zhì)合成，主要包括四環(huán)素、土霉素、金霉素和強力霉素等，畜牧業(yè)中多用于治療畜禽疾病和改善飼料利用率[1]。但四環(huán)素類藥物的過度使用，不僅會使畜禽動物產(chǎn)生耐藥性，導致疾病的突然爆發(fā)，對畜牧業(yè)的發(fā)展造成一定威脅；而且畜禽肉制品中藥物殘留還會通過食物鏈富集作用進入人體，從而產(chǎn)生中毒、過敏反應、三致作用（致癌、致畸、致突變作用）、病原菌耐藥性及對影響胃腸道菌群等，危害人體健康[2]。我國相關(guān)法律規(guī)定，四環(huán)素類藥物的最大殘留限量在食品動物肌肉組織中為100～600 μg/kg[3]。四環(huán)素類藥物檢測技術(shù)主要免疫分析法（放射免疫分析、熒光免疫分析等）[4]、理化分析法（薄層色譜法、高效液相色譜法、液相色-譜質(zhì)譜法）[5-8]。其中液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS）將液相色譜和質(zhì)譜優(yōu)點結(jié)合起來，其分離能力強、高選擇性、高靈敏度，被廣泛地應用在食品分析領域中[9]。此次研究依據(jù)GB/T 21317—2007《動物源性食品中四環(huán)素類獸藥殘留量檢測方式 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法與高效液相色譜法》，對畜禽類樣品的前處理、質(zhì)譜和色譜條件進行優(yōu)化，以建立一個更便捷、高效的LC-MS快速檢測方法，為四環(huán)素類藥物的檢測提供快速、有效的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗材料選自鄭州市銀合農(nóng)貿(mào)市場隨機選擇的豬肉、雞肉和鴨肉。

無水硫酸鈉：分析純，福晨（天津）化學試劑有限公司；乙二胺四乙酸二鈉（分析純，天津致遠化學試劑有限公司）；乙酸乙酯（分析純，天津致遠化學試劑有限公司；檸檬酸（分析純，天津致遠化學試劑有限公司）；磷酸氫二鈉（分析純，天津市永大化學試劑有限公司）；乙酸（色譜純，天津致遠化學試劑有限公司）；乙腈：色譜純，福晨（天津）化學試劑有限公司，天津致遠化學試劑有限公司；甲醛（色譜純，天津致遠化學試劑有限公司）；甲酸（色譜純，天津致遠化學試劑有限公司）；標準物質(zhì)：土霉素、四環(huán)素、金霉素、強力霉素，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH（純度均大于95%）；純凈水（一級，杭州娃哈哈集團有限公司）。

1.2 儀器與設備

賽默飛TSQ Quantis Plus三重四極桿質(zhì)譜儀（美國）；電子分析天平（TXB622L，日本島津）；電子分析天平（AUX120，日本島津）；氮吹儀（HSC-24B，天津恒奧科技有限公司）；旋渦混勻器（IKA/艾卡MS3，德國）；多管旋渦混合儀（E0AAHM-01，上海安譜實驗科技股份有限公司）；超聲波清洗機（SB25-12DTD，寧波新芝）；高速冷凍離心機（3K15，北京五洲東方科技發(fā)展有限公司）；50 mL尖底離心管（北京蘭杰科技有限公司）；15 mL尖底離心管（北京蘭杰科技有限公司）；HLB固相萃取柱（60 mg/3 mL，江蘇杰島高新材料科技有限公司）；攪碎機；試驗所用一次性吸管、一次性使用無菌注射器及0.22 μm有機濾膜，皆由河南省安必諾檢測技術(shù)有限公司實驗室提供。

1.3 溶液配制

1.3.1 四環(huán)素標準儲備液的配制

依據(jù)純度折算為100%質(zhì)量的四環(huán)素、土霉素、強力霉素、金霉素各稱取10.0 mg，分別通過用甲醇溶解將其定容至100 mL容量瓶內(nèi)，所獲得的質(zhì)量濃度為100 mg/L，在-18 ℃以下保存，儲備液放入棕色瓶中，可儲存1年以上。

1.3.2 混合標準工作溶液的配制

根據(jù)需要，將0.1%甲酸+5%甲醇水溶液稀釋至所用濃度，制備混合標準工作溶液以便立即使用。

1.3.3 其他溶液的配制

1.3.31 0.1 mol/L檸檬酸溶液

準確稱取21.01 g檸檬酸，用水定容至1 000 mL，搖勻，使其溶解。

1.3.32 0.2 mol/L磷酸氫二鈉溶液

準確稱取28.41 g磷酸氫二鈉，用水定容至1 000 mL，搖勻，使其溶解。

1.3.33 Mcllvaine緩沖溶液

將1 000 mL 0.1 mol/L檸檬酸溶液與625 mL 0.2 mol/L磷酸氫二鈉溶液混合。

1.3.34 0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvine緩沖溶液

稱取60.5 g乙二胺四乙酸二鈉放入1 625 mL Mcllvaine緩沖溶液中，并旋渦1 min，使其完全溶解。

1.3.35 甲醇+水

準確量取5 mL甲醇和95 mL水將其混合。

1.3.36 甲醇+乙酸乙酯

量取10 mL甲醇與90 mL乙酸乙酯混合。

1.3.37 OasisHLB固相萃取柱

規(guī)格為60 mg/30 mL，使用前用5 mL甲醇和5 mL水進行預處理，保持柱體濕潤。

1.3.38 0.1%甲酸

量取1 mL甲酸，用水定容至1 000 mL。

1.3.39 5%甲醇

量取5 mL甲醇，用水定容至100 mL。

1.3.3.10 0.1%甲酸-5%甲醇

1 000 mL 0.1%甲酸與100 mL 5%甲醇混合。

1.3.3.11 1%乙酸乙腈溶液

準確量取10 mL乙酸與990 mL乙腈，將其混勻。

1.4 試驗方法

1.4.1 樣品制備及貯存

為防止（豬肉、雞肉、鴨肉）在空氣中受到污染或殘留物量發(fā)生改變，在所有樣品中分別取800 g，通過機器高速攪拌均勻攪碎，均分成2份，1份為備樣，1份用做分析，裝入干凈自封袋中，密封過后貼標簽做標記，2份別用于留樣和分析，將標記的樣品在-18℃以下的溫度下冷凍儲存。

1.4.2 測定步驟

1.4.21 國標方法的樣品前處理[10]

稱取2.0 g（精確到0.01 g）待測樣品，分別放入50 mL尖底離心管中，依次加入20，20和10 mL的0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvainc緩沖液，并在冰水中進行超聲波處理，進行3次提取，每次旋渦1 min，超聲波處理10 min，離心速度3 000 r/min，離心5 min（溫度控制在15 ℃），合并上清液，定容至50.0 mL，渦旋5 000 r/min，冷凍離心10 min（溫度控制為15 ℃），并用濾紙過濾，耐心等待凈化。

用移液槍精準吸取10 mL提取液，以1滴/s的速度過HLB固相萃取柱，使用前用5 mL甲醇和5 mL水進行活化。等待液體全部流完，依次用5 mL水和5 mL甲醇-水淋洗HLB固相萃取柱，全部倒掉流出液，抽干5 min，用10 mL甲醇+乙酸乙酯進行洗脫，將洗脫液用氮氣吹至近干（溫度控制40 ℃以下），加入1 mL 0.1%甲酸5%甲醇水溶解雜質(zhì)，過0.22 μm濾膜，用LC-MS法測定。

1.4.22 優(yōu)化后的樣品前處理

準確稱取2.0 g（精確到0.01 g）樣品已被攪碎后的試樣放入50 mL尖底離心管中，在離心管中添加4 g無水硫酸鈉和4 g乙二胺四乙酸二鈉，加入10 mL 1%乙酸乙腈，對其進行渦旋提取5min，利用超聲波10 min，按6 000 r/min離心5 min。用一次性5 mL吸管，吸取5 mL上清液放入15 mL離心管中，收集溶液在40 ℃內(nèi)水浴，直到氮氣吹至近干，加1 mL 0.1%甲酸5%甲醇水溶液溶解雜質(zhì)，上振蕩器渦旋1 min，超聲波3 min，按9 000 r/min離心3 min，離心完后，棄去上層油脂，立即用注射器吸出，并通過0.22 μm有機濾膜上機，供LC-MS法測定。

1.4.3 色譜條件與質(zhì)譜條件

1.4.31 色譜條件

色譜柱Accucore C18（150 mm×2.1 mm，2.6 μm）；柱溫30 ℃；流速0.3 mL/min；進樣量10 μL；流動相A2為0.1%甲酸水，B1相為甲醇。

表1 梯度洗脫條件

1.4.32 質(zhì)譜條件

離子源，采用電噴霧離子；掃描方式，采用正離子掃描；檢測方式，采用多重反應監(jiān)測（SRM）；噴霧電壓3 500 V；鞘氣壓力35 Arb；輔助氣壓力5 Arb；尾吹氣壓力0 Arb；離子傳輸管溫度350 ℃；霧化溫度350 ℃。

表2 化合物檢測離子對

1.5 方法驗證

1.5.1 線性范圍

選取空白樣品，加入標準系列標準溶液，按照優(yōu)化后的前處理步驟進行操作，上機檢測，縱坐標（y）表示峰值面積，橫坐標（x）表示溶液濃度，繪制標準曲線，得到線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)R2值，判斷線性關(guān)系是否良好。

1.5.2 標準曲線和加標回收率試驗

1.5.21 標準曲線

配制系列的標準溶液，用0.1%甲酸5%甲醇水溶液配制5，10，25，50和100 μg/mL的系列工作液，分別從低濃度到高濃度進樣，縱坐標表示峰面積，橫坐標表示溶液濃度，制作標準曲線。

1.5.22 加標回收率試驗

準確稱取2.0 g（精確到0.01 g）樣品，將樣品（豬肉、雞肉、鴨肉）分別做3次平行樣品，將樣品在不同濃度下制備3個50 mL尖底離心管，分別為20，50和100 μg/kg質(zhì)量分數(shù)添加4種藥物混合標液。運用式（1）計算[11]，并進行3次平行試驗，計算平均回收率。

1.5.3 檢測限和定量限的確定

檢出限的定義為添加較低含量目標物進行添加回收試驗時可產(chǎn)生3倍信噪比（rSN≥3）的化合物的質(zhì)量濃度，而定量限是指通過添加法經(jīng)測定方法的全過程測定可以可靠地確定樣品中化學污染物的最低濃度，一般也認為是至少產(chǎn)生10倍信噪比（rSN≥10）的化合物的質(zhì)量濃度[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器方法優(yōu)化結(jié)果

四環(huán)素類藥物（四環(huán)素、土霉素、金霉素、強力霉素）混合標準溶液、豬肉空白樣品、雞肉空白樣、鴨肉空白樣品添加藥物。樣品加標濃度為100 μg/mL，將國標方法與該方法平均回收率進行比較見表3，該方法采用1%乙酸乙腈提取溶劑，回收率優(yōu)于國標法，該方法準確度高、操作過程簡便快捷、成本低。

表3 國標法和試驗方法平均回收率

由表3的檢測結(jié)果可知，優(yōu)化后的試驗方案中采用1%乙酸乙腈，提取效果好，樣品中四環(huán)素類藥物（四環(huán)素、土霉素、金霉素、強力霉素）的加標回收率均比優(yōu)化前要高。國標法試驗方法的豬肉加標的平均回收率為48.3%～109.6%，雞肉加標的平均回收率49.7%～115.6%，鴨肉加標的平均回收率50.9%～60.6%；SRSD為2%～11%。優(yōu)化后的試驗方法測得豬肉加標的平均回收率82.8%～119.5%，雞肉加標的平均回收率83.2%～120.4%，鴨肉加標的平均回收率86.9%～94.6%，SRSD為0.7%～3.6%。

試驗比較1%乙酸乙腈和0.1 mol/L Na2EDTAMcllvainc緩沖液提取效果，但0.1 mol/L Na2EDTAMcllvaine緩沖溶液提取液，渾濁且黏稠，雜質(zhì)多，濾紙過濾時間長，容易堵塞HLB柱。針對HLB柱堵塞問題，在緩沖溶液中加入乙腈，有利于促進沉淀蛋白，提取液變清透，當乙腈含量增加，沉淀蛋白效果更佳，但使用HLB柱凈化時，為降低乙腈含量需要稀釋提取液，過程繁瑣。試驗中優(yōu)化乙酸含量，發(fā)現(xiàn)加入1%乙酸時，提取效果更優(yōu)，可獲得很高的待測物的加標回收率。因此，采用1%乙酸乙腈進行提取。另外，動物源性食品中脂肪含量較高，對回收率和檢測結(jié)果造成一定程度影響，提取溶液用乙腈時，大量干擾物質(zhì)會被抽離出來，大部分干擾物是油脂，為將樣品中的油脂類的干擾物抽離出去，采用高速冷凍離心去除油脂，該方法在低溫情況下會將油脂類的干擾物從溶液中分離出來，以達到最佳的凈化分離效果。復溶后，高速冷凍離心能很好地去除樣品中的油脂類干擾物。

2.2 四環(huán)素類藥物（四環(huán)素、土霉素、金霉素、強力霉素）標準曲線線性關(guān)系

配制一系列的標準溶液，按照低濃度到高濃度依次進樣，質(zhì)量濃度為5，10，25，50和100 μg/mL的系列工作液，以峰面積為縱坐標，對應濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

2.2.1 四環(huán)素標準工作曲線

四環(huán)素在不同濃度不同樣品經(jīng)過檢測后，求得的回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表4，由有相關(guān)系數(shù)（R2＞0.999）可知，四環(huán)素在5～100 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系較好，適合用于樣品的檢測。

表4 檢測豬肉、雞肉、鴨肉中四環(huán)素工作曲線的回歸方程及相關(guān)系數(shù)

2.2.2 土霉素標準工作曲線

土霉素在不同濃度不同樣品經(jīng)過檢測后，求得的回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表5，由相關(guān)系數(shù)（R2＞0.999）可知，土霉素在質(zhì)量濃度范圍5～100 μg/mL時，線性關(guān)系較好，適合用于樣品的檢測。

表5 檢測豬肉、雞肉、鴨肉中土霉素工作曲線的回歸方程及相關(guān)系數(shù)

2.2.3 金霉素的標準工作曲線

金霉素不同濃度不同樣品經(jīng)過檢測后，求得的回歸方程及相關(guān)系數(shù)，見表6。由相關(guān)系數(shù)（R2＞0.999）可知，金霉素在質(zhì)量濃度范圍5～100 μg/mL時，線性關(guān)系比較好，適合用于樣品的檢測。

表6 檢測豬肉、雞肉、鴨肉中金霉素工作曲線的回歸方程及相關(guān)系數(shù)

2.2.4 測定強力霉素的標準工作曲線

配制的強力霉素不同濃度不同樣品進過檢測后，求得的回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表7。由相關(guān)系數(shù)（R2＞0.999）可知，強力霉素在5～100 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系較好，適合用于樣品的檢測。

表7 檢測豬肉、雞肉、鴨肉中強力霉素工作曲線的回歸方程及相關(guān)系數(shù)

四環(huán)素類藥物在質(zhì)量濃度范圍5～100 μg/mL之間，不同濃度與響應值（峰值面積）呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，R2值在0.999～1之間，均大于0.999。

2.3 回收率和相對標準偏差

2.3.1 豬肉樣品

檢測時用豬肉樣品在20，50和100 μg/mL這3個水平質(zhì)量濃度上分別進行添加回收率試驗，并且進行3次平行試驗。四環(huán)素類藥物（四環(huán)素、土霉素、金霉素、強力霉素）在不同樣品中準確度結(jié)果見表8。

表8 測定豬肉中四環(huán)素類藥物（四環(huán)素、土霉素、金霉素、強力霉素）回收率

由表8可知，測定豬肉中四環(huán)素類藥物（土霉素、金霉素、四環(huán)素、強力霉素）的回收率在20，50和100 μg/kg這3個質(zhì)量分數(shù)水平：豬肉中加標質(zhì)量分數(shù)20 μg/kg時，四環(huán)素、土霉素、強力霉素、金霉素平均回收率分別為85.5%，86%，137.2%和126.1%。加標質(zhì)量分數(shù)50 μg/kg時，四環(huán)素、土霉素、強力霉素、金霉素平均回收率分別為108.9%，115%，113.2%和107.8%。加標質(zhì)量分數(shù)100 μg/kg時，四環(huán)素、土霉素、強力霉素、金霉素平均回收率分別為86%，82.8%，119.5%和85.8%。

2.3.2 雞肉樣品

檢測時用雞肉樣品在20，50和100 μg/kg這3個水平質(zhì)量分數(shù)上分別進行添加回收率試驗，并且進行3次平行試驗。四環(huán)素類藥物（土霉素、金霉素、四環(huán)素、強力霉素）在不同樣品中準確度結(jié)果見表9。

由表9可知，測定雞肉中四環(huán)素類藥物（土霉素、金霉素、四環(huán)素、強力霉素）的回收率在20，50和100 μg/kg這3個質(zhì)量分數(shù)水平：雞肉中加標質(zhì)量分數(shù)20 μg/kg時，四環(huán)素、土霉素、強力霉素、金霉素平均回收率分別為128.6%，96.6%，211.6%和158.3%；加標質(zhì)量分數(shù)50 μg/kg時，四環(huán)素、土霉素、強力霉素、金霉素平均回收率分別為149.6%，106.9%，136.1%和109.2%；加標質(zhì)量分數(shù)100 μg/kg時，四環(huán)素、土霉素、強力霉素、金霉素平均回收率分別為83.2%，90.6%，120.4%和95.9%。

表9 測定雞肉中四環(huán)素類藥物（四環(huán)素、土霉素、金霉素、強力霉素）回收率

2.3.3 鴨肉樣品

檢測時用鴨肉樣品在20，50和100 μg/kg這3個水平質(zhì)量分數(shù)上分別進行添加回收率試驗，并且進行3次平行試驗。四環(huán)素類藥物（土霉素、金霉素、四環(huán)素、強力霉素）在不同樣品中準確度結(jié)果見表10。

表10 測定鴨肉中四環(huán)素類藥物（四環(huán)素、土霉素、金霉素、強力霉素）的回收率

由表10可知，測定鴨肉中四環(huán)素類藥物（土霉素、金霉素、四環(huán)素、強力霉素）的回收率在20，50和100 μg/kg這3個質(zhì)量分數(shù)水平：鴨肉中加標質(zhì)量分數(shù)20 μg/kg時，四環(huán)素、土霉素、強力霉素、金霉素平均回收率分別為183.4%，164.1%，163.3%和118.5%；加標質(zhì)量分數(shù)50 μg/kg時，四環(huán)素、土霉素、強力霉素、金霉素平均回收率分別為144.7%，169.8%，190.5%和129.6%；加標質(zhì)量分數(shù)100 μg/kg時，四環(huán)素、土霉素、強力霉素、金霉素平均回收率分別為86.9%，87.5%，94.6%和88.6%。

綜上，試驗方法檢測豬肉、雞肉、鴨肉中四環(huán)素類藥物殘留，準確稱取2.0 g（精確到0.01 g）樣品，樣品中添加混合標準工作液，加標質(zhì)量分數(shù)分別為20，50和100 μg/kg，按照優(yōu)化后的前處理進行操作，四環(huán)素平均回收率為83.2%～183.4%，土霉素平均回收率為82.8%～169.8%，強力霉素為94.6%～211.6%，金霉素為85.8%～158.3%，SRSD在0.7%～9.0%之間，SRSD均小于10%，均符合獸藥殘留分析的要求。

2.4 檢測限和定量限的確定

加標水平5 μg/kg情況下，測得四環(huán)素、土霉素、金霉素、強力霉素的rSN≥3，加標水平25 μg/kg情況下，測得四環(huán)素、土霉素、金霉素、強力霉素的rSN≥10。因此，樣品中的檢出限為5 μg/kg，定量限為25 μg/kg。

3 結(jié)語

試驗采用LC-MS法對四環(huán)素類藥物進行檢測與研究，通過對樣品前處理的優(yōu)化，使用1%乙酸乙腈溶液提取，提取效果好，樣品的回收率高。LC-MS法測定四環(huán)素類藥物素殘留，對豬肉、雞肉、鴨肉進行回收率試驗，測得四環(huán)素平均回收率83.2%～183.4%，土霉素平均回收率82.8%～169.8%，強力霉素平均回收率94.6%～211.6%，金霉素平均回收率85.8%～158.3%。通過對4種四環(huán)素類藥物質(zhì)量濃度5～100 μg/mL內(nèi)范圍進行考察，不同濃度與響應值（峰值面積）都有良好的線性關(guān)系，R2≥0.999，準確度較高。優(yōu)化后的方法檢出限為5 μg/kg，而定量限為25 μg/kg，優(yōu)化后的方法靈敏度較好，因此更符合四環(huán)素獸藥殘留的定量分析。過試驗數(shù)據(jù)與研究，試驗方法簡便快捷、提取回收率高、準確度和靈敏度高，適合廣泛應用于動物源性食品中檢測四環(huán)素類藥物，HLB固相萃取柱市場價1支最低在6元左右，優(yōu)化后的前處理降低了成本。