人端粒i-motif:結(jié)構(gòu)、識(shí)別和生物學(xué)功能

黃鈞柳, 張 昀, 崔曉杰1),*

(1)民族地區(qū)生態(tài)環(huán)境國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中央民族大學(xué)), 北京 100081;2)中央民族大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 化學(xué)與環(huán)境學(xué)系,北京 100081)

i-motif(intercalated motif,iM)是一種四螺旋核酸高級(jí)結(jié)構(gòu),由富含胞嘧啶的堿基束利用空間排布穿插形成。1953年Waston和Crick首次提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)(B-DNA)后,人們就開始不斷加深對(duì)DNA形態(tài)的研究。自20世紀(jì)60年代以來,多種不同形態(tài)的非B-DNA,例如A型雙螺旋、Z型雙螺旋、發(fā)夾結(jié)構(gòu)、三鏈體(例如H-DNA)和四鏈體(例如G-四鏈體和i-motif)DNA等相繼被發(fā)現(xiàn),其生物相關(guān)性也引起了廣泛關(guān)注[1,2]。位于人端粒末端的TTAGGG重復(fù)序列已被證實(shí)能在體內(nèi)形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)[3],并且在抑制端粒酶活性和端粒復(fù)制等過程中發(fā)揮重要作用[4]。隨后,與其相對(duì)應(yīng)的富C序列形成的高級(jí)結(jié)構(gòu)也引起研究者越來越多的關(guān)注。1962年,Richard等[5]利用X射線衍射技術(shù)在晶體中發(fā)現(xiàn)了半質(zhì)子化胞嘧啶堿基對(duì)的存在。次年,Langridge和Rich[6]采用同樣的技術(shù)證實(shí),在pH5.5的酸性緩沖溶液中,富含胞嘧啶的核酸序列能夠形成一種平行的雙鏈結(jié)構(gòu),并表明了胞嘧啶的質(zhì)子化是該結(jié)構(gòu)形成的基礎(chǔ)。1992年,Ahmed和Henderson[7]利用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)發(fā)現(xiàn),端粒富胞嘧啶序列能夠在近中性條件下通過C-CH+堿基對(duì)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。之后,1993年Gehring[8]等第1次在弱酸性條件下通過核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)手段解析得到富C序列d(TCCCCC)形成的四鏈體結(jié)構(gòu),并命名為i-motif結(jié)構(gòu)。此后,越來越多的研究表明,能形成i-motif的富C序列在人類染色體端粒和基因啟動(dòng)子等區(qū)域廣泛存在,具有潛在重要生物學(xué)功能,是除核酸G-四鏈體外的癌癥治療策略開發(fā)的新靶點(diǎn)[9-11]。

人染色體末端富C序列形成的端粒i-motif在生物體內(nèi)行使著重要的生物學(xué)功能,對(duì)維持端粒結(jié)構(gòu)、抑制端粒酶活性以及TERRA轉(zhuǎn)錄等有重要作用。因此,人端粒i-motif與癌癥的發(fā)生密切相關(guān),以其獨(dú)特的空間結(jié)構(gòu)作為藥物靶點(diǎn),對(duì)于癌癥等疾病的治療策略的開發(fā)具有重要意義。對(duì)端粒i-motif結(jié)構(gòu)和功能的研究有助于拓展人們對(duì)于核酸高級(jí)結(jié)構(gòu)的理解與認(rèn)識(shí),并推動(dòng)現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展。

1 核酸i-motif結(jié)構(gòu)

i-motif結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)為C-CH+堿基對(duì)(Fig.1A),由1個(gè)中性胞嘧啶和1個(gè)質(zhì)子化胞嘧啶通過3個(gè)Hoogsteen氫鍵連接而成。C-CH+堿基對(duì)之間穿插排布構(gòu)成由兩個(gè)平行雙螺旋結(jié)構(gòu)組合而成的四螺旋i-motif結(jié)構(gòu)(Fig.1B)[12,13]。i-motif結(jié)構(gòu)有多種分類方式,根據(jù)形成該結(jié)構(gòu)的寡聚核苷酸鏈數(shù)目的不同,可分為單分子 i-motif(分子內(nèi)i-motif),雙分子i-motif 和四分子i-motif(合稱分子間i-motif)三類(Fig.1C)[14-16]。根據(jù)末端C-CH+堿基對(duì)位于5＇端或是3＇端,又可將i-motif分為5＇E 構(gòu)型和3＇E構(gòu)型兩種(Fig.1D),且二者之間存在自由的動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)換[17,18]。不同序列的兩種構(gòu)型穩(wěn)定性不同,磷酸基團(tuán)間的排斥力和糖環(huán)間的吸引力之間的平衡是決定哪種構(gòu)型更穩(wěn)定的關(guān)鍵[19,20]。根據(jù)環(huán)區(qū)(loop)長(zhǎng)度還能將單分子 i-motif分為短環(huán)區(qū)(I 類)i-motif和長(zhǎng)環(huán)區(qū)(II 類)i-motif(Fig.1E)[21]。短環(huán)區(qū)i-motif優(yōu)先在酸性pH值(5.8～6.4)下形成,而長(zhǎng)環(huán)區(qū)i-motif則可在略高pH值(～6.6)下形成[22],其環(huán)區(qū)堿基之間的相互作用被認(rèn)為是穩(wěn)定II 類i-motif 的主要因素[23]。

Fig.1 i-motif structure scheme (A) C-CH+ base pair; (B) NMR structure of the i-motif formed by a fragment of the human telomeric C-rich strand (PDB ID: 1ELN); (C) Structure of Intramolecular i-Motif (left) , Bimolecular i-Motif (middle) and Tetramolecular i-Motif (right); (D) Schematic diagram of the 3′E (left) and 5′E (right) intermolecular i-motif structures; (E) Representative Class I (left) and Class II (right) intramolecular i-motifs. (Fig.A and C refer to reference [13], Fig.D refers to reference [18] and Fig.E refers to reference [21])

可形成i-motif結(jié)構(gòu)的富C序列在人類基因組中廣泛分布,主要集中在基因的啟動(dòng)子、內(nèi)含子、著絲粒和端粒末端等區(qū)域[24]。目前研究較充分的i-motif序列包括原癌基因c-Myc核酸酶超敏元件(nuclease hypersensitive element,NHE)III富C序列[25]、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 (vascular endothelial growth factor,VEGF)基因啟動(dòng)子區(qū)富C序列[26]、B 細(xì)胞淋巴瘤2(B cell lymphoma 2,Bcl2)P1 啟動(dòng)子區(qū)富C序列[27]、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma,Rb)基因5＇末端富C序列[28]、α衛(wèi)星DNA富C序列[29]以及端粒末端富C序列[30]等,這些序列所形成的i-motif 結(jié)構(gòu)在基因的表達(dá)調(diào)控、染色體著絲粒定位、DNA復(fù)制調(diào)控以及端粒酶活性抑制等過程中發(fā)揮著重要作用[31]。原癌基因c-MycNHE III富C序列是目前研究較深入的能形成i-motif結(jié)構(gòu)的序列之一:c-Myc基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子具有調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞生長(zhǎng)的功能。研究發(fā)現(xiàn),核不均一核糖核蛋白K(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K,hnRNP-K)和腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白質(zhì)NM23-H2能夠特異性地與NHE III富C序列結(jié)合并激活該區(qū)域的啟動(dòng)子,從而促進(jìn)原癌基因c-Myc轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行[32,33];而i-motif結(jié)構(gòu)的形成則會(huì)影響hnRNP-K和NM23-H2與NHE III的結(jié)合,抑制轉(zhuǎn)錄激活。VEGF是血管系統(tǒng)發(fā)育和分化[34,35]的關(guān)鍵因子,在促進(jìn)血管生成[36]以及腫瘤的存活、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[37]等過程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn),VEGF基因近端啟動(dòng)子區(qū)富C序列對(duì)于其轉(zhuǎn)錄激活至關(guān)重要:當(dāng)富C序列形成i-motif結(jié)構(gòu)時(shí),能夠阻礙與腫瘤細(xì)胞的血管生成和生長(zhǎng)相關(guān)的特異性蛋白1 (specificity protein 1,Sp1)與其結(jié)合,進(jìn)而造成VEGF基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控沉默[38,26]。人端粒富C序列位于染色體末端,研究發(fā)現(xiàn),其會(huì)形成大量i-motif高級(jí)結(jié)構(gòu),為端?；钚哉{(diào)控及癌癥等疾病治療藥物開發(fā)提供了重要位點(diǎn)。因此,對(duì)其結(jié)構(gòu)、小分子識(shí)別及生物學(xué)功能等的研究具有重要理論和應(yīng)用意義,將在下文進(jìn)行詳細(xì)介紹。

2 人端粒i-motif

人端粒是位于染色體末端的核蛋白質(zhì)復(fù)合物,在維持基因組完整性、細(xì)胞衰老和癌癥進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。端粒末端存在2～20 kb的雙鏈(TTAGGG)/(CCCTAA)重復(fù)序列和1個(gè)富G 3＇懸垂單鏈(Fig.2A)[39,40]。端粒酶是一種存在于早期胚胎、成體干細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和少數(shù)體細(xì)胞中的核糖核蛋白質(zhì)復(fù)合物[41-43]。當(dāng)端粒末端3＇懸垂單鏈處于開放狀態(tài)時(shí),端粒酶可在S期通過端粒保護(hù)蛋白1(protection of telomeres 1, POT1)N端OB結(jié)構(gòu)域被招募到端粒末端與之結(jié)合,并依靠自身的RNA模板進(jìn)行復(fù)制來達(dá)到維持端粒長(zhǎng)度的作用[44]。而當(dāng)其向后折回進(jìn)入雙鏈區(qū)時(shí)則會(huì)通過與互補(bǔ)鏈配對(duì)形成T-loop和D-loop結(jié)構(gòu),將端粒末端包裹起來發(fā)揮保護(hù)作用。端粒酶的過度表達(dá)能夠維持端粒長(zhǎng)度使細(xì)胞永生,從而可能促進(jìn)癌細(xì)胞的生成,最終引發(fā)癌癥;相反,端粒酶的活性丟失也將導(dǎo)致端粒DNA的縮短,致使端粒功能的喪失最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[45]。

Fig.2 Human telomere structure scheme (A)The repeat sequence at the end of human telomere;(B)The structure of telomeric i-motif. (Fig.A and B refer to reference [40] and [13], respectively)

2000年,Phan[46]等采用NMR方法,對(duì)人類端粒末端富C重復(fù)序列d[(CCCTAA)3CCCT]形成的高級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析,發(fā)現(xiàn)其在酸性環(huán)境中會(huì)形成5＇E 構(gòu)型分子內(nèi)i-motif。該結(jié)構(gòu)母核由2個(gè)嵌插的各含有3對(duì)C-CH+堿基對(duì)的雙螺旋堆疊而成,在母核結(jié)構(gòu)上部有1個(gè)TAA環(huán)區(qū),下部有2個(gè)TAA 環(huán)區(qū),共形成2個(gè)大溝區(qū)和2個(gè)小溝區(qū)(Fig.2B)。該端粒i-motif結(jié)構(gòu)的獲得為端粒結(jié)構(gòu)和功能研究,以及以端粒富C序列為靶點(diǎn)的藥物分子開發(fā)等工作奠定了基礎(chǔ)。

3 端粒i-motif穩(wěn)定性的影響因素

與主要通過相鄰層間的π-π堆疊效應(yīng)而穩(wěn)定存在的核酸G-四鏈體結(jié)構(gòu)不同,i-motif結(jié)構(gòu)中相鄰C-CH+堿基對(duì)中胞嘧啶芳環(huán)間的重疊較小,因而其穩(wěn)定性相對(duì)較差。研究表明,i-motif結(jié)構(gòu)不僅受到核酸序列、結(jié)構(gòu)修飾、C-CH+堿基對(duì)個(gè)數(shù)以及環(huán)長(zhǎng)度等內(nèi)在因素的影響,還受到pH、分子擁擠和離子環(huán)境等外在因素(環(huán)境因素)的影響。在不同條件下,端粒i-motif的穩(wěn)定性有顯著差別。

3.1 端粒i-motif可在偏酸性和中性pH下形成

鑒于i-motif的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),其主要在偏酸性環(huán)境下形成。i-motif結(jié)構(gòu)單元的形成依賴于胞嘧啶的半質(zhì)子化,胞嘧啶的pKa約4.6,當(dāng)pH在4～7時(shí),部分胞嘧啶質(zhì)子化形成i-motif結(jié)構(gòu),且當(dāng)pHpKa(4.6)時(shí),所形成的i-motif結(jié)構(gòu)最為穩(wěn)定。因此,端粒i-motif結(jié)構(gòu)被普遍認(rèn)為主要在偏酸性條件下形成;當(dāng)pH低于4時(shí),胞嘧啶會(huì)完全質(zhì)子化,從而無法形成穩(wěn)定的C-CH+堿基對(duì),進(jìn)而無法形成i-motif結(jié)構(gòu);當(dāng)pH大于7時(shí),胞嘧啶去質(zhì)子化使得i-motif解鏈成單鏈形式,最終轉(zhuǎn)變?yōu)闊o規(guī)則線圈,也無法形成穩(wěn)定的i-motif結(jié)構(gòu)[47-49]。

雖然以往研究認(rèn)為i-motif結(jié)構(gòu)主要在偏酸性環(huán)境中形成,但隨著i-motif結(jié)構(gòu)研究的逐步深入,有研究發(fā)現(xiàn),端粒i-motif在近生理pH下也可以形成。2010年,zhou等[47]采用光譜技術(shù)和聚丙烯酰胺凝膠電泳實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在低溫條件下端粒i-motif能夠在中性和弱堿性pH條件下形成,但對(duì)于大多數(shù)生物體來說,這種低溫和生理溫度相差較大。此外,Wright等[50]通過系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),當(dāng)序列中每個(gè)胞嘧啶束至少含有5個(gè)C堿基時(shí),可以在室溫和生理pH下折疊成穩(wěn)定的i-motif結(jié)構(gòu),而端粒i-motif序列每個(gè)胞嘧啶束中含有3個(gè)C堿基,在pH大于6時(shí)即無法折疊成i-motif結(jié)構(gòu)。盡管這些體外研究對(duì)端粒i-motif在生理pH下能否形成提出了疑義,但真實(shí)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境除pH外還包括多種其他因素,例如擁擠環(huán)境、離子強(qiáng)度等。在這些環(huán)境下,端粒i-motif的形成和穩(wěn)定性也受到研究者的廣泛關(guān)注[51]。直到2022年,Abdelhamid組[52]通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)技術(shù)在中性pH環(huán)境下觀察到折疊的端粒i-motif結(jié)構(gòu),為端粒i-motif能在生理pH下形成提供了直接證據(jù),也為探究其在中性pH下的折疊機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。這些研究表明,理論上只能在偏酸性環(huán)境形成的i-motif結(jié)構(gòu),具有在生理pH下形成的潛力。

3.2 分子擁擠環(huán)境對(duì)i-motif的作用受擁擠分子濃度以及尺寸大小的共同影響

細(xì)胞內(nèi)環(huán)境被核酸、蛋白質(zhì)、多糖、小分子和各種離子等密集占據(jù),這種現(xiàn)象被稱為分子擁擠[53]。研究證明,向體系中添加高分子量的聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)模擬細(xì)胞內(nèi)分子擁擠環(huán)境,能夠提高端粒i-motif的熱穩(wěn)定性,但對(duì)其結(jié)構(gòu)并未明顯影響[54],原因可能是分子擁擠環(huán)境提供的空間位阻使得i-motif的解鏈過程受到阻礙[55]。Mahmoud組[56]和Wright組[50,57]研究了不同pH的二甲胂酸鈉緩沖溶液(sodium cacodylate buffer,SCB)中端粒i-motif結(jié)構(gòu)的形成情況。他們的結(jié)果表明,在不存在PEG分子的情況下,當(dāng)SCB溶液的pH大于6時(shí),端粒富C序列便不能折疊形成i-motif結(jié)構(gòu)。而周俊等[53]的研究發(fā)現(xiàn),在pH5.8的SCB溶液中加入40% PEG 200后,端粒i-motif結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定性得到了3.5 ℃的提高。以上結(jié)果表明,分子擁擠環(huán)境具有穩(wěn)定i-motif結(jié)構(gòu)的作用。

端粒i-motif結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定性受溶液中擁擠分子濃度以及尺寸大小的共同影響。閆永鳳組[58]對(duì)端粒富C序列d[(CCCTAA)3CCC]在加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)(10%、20%和40 %)和不同尺寸大小(PEG200、PEG400、PEG600和PEG1000)的溶液中所形成的i-motif結(jié)構(gòu)進(jìn)行了熱穩(wěn)定性研究。其結(jié)果發(fā)現(xiàn),在pH值為4.5的0.02 mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4緩沖溶液中,當(dāng)加入的擁擠分子較小時(shí)(PEG200、PEG400),隨著擁擠分子質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高,i-motif結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定性逐漸降低;當(dāng)尺寸適中時(shí)(PEG600),少量的擁擠分子(10%)可以增強(qiáng) i-motif的熱穩(wěn)定性,但隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加(20%,40%),i-motif結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定性將會(huì)被減弱;尺寸比較大時(shí)(PEG1000),隨著擁擠分子質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,i-motif結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定性也不斷增強(qiáng)。綜合上述研究可以發(fā)現(xiàn),擁擠分子PEG對(duì)于端粒i-motif結(jié)構(gòu)的形成和熱穩(wěn)定性存在一定影響,但是不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)和分子大小的PEG對(duì)端粒i-motif的影響存在著差異。近些年,以端粒i-motif為癌癥治療靶點(diǎn)的研究受到越來越多的關(guān)注,而i-motif結(jié)構(gòu)的形成與存在是該研究的前提。這些分子擁擠條件下端粒i-motif結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性的研究對(duì)近生理?xiàng)l件下端粒富C序列的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)探索提供了有利支撐。

3.3 不同陽離子環(huán)境對(duì)i-motif結(jié)構(gòu)具有不同作用

陽離子普遍存在于生物系統(tǒng)當(dāng)中,并且在核酸折疊以及高級(jí)核酸結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定性等方面發(fā)揮著十分重要的作用[59-61]。并且與G-四鏈體結(jié)構(gòu)主要受陽離子性質(zhì)影響不同,i-motif結(jié)構(gòu)受到陽離子性質(zhì)、離子強(qiáng)度和緩沖溶液性質(zhì)的共同影響。Gao組[17]利用FRET熔融方法,研究了在不同緩沖溶液中K+濃度變化對(duì)端粒i-motif熱穩(wěn)定性的影響。其結(jié)果發(fā)現(xiàn),在磷酸緩沖溶液(phosphate buffer,PB)和SCB溶液中,隨著K+濃度從0增大到500 mM,端粒i-motif的穩(wěn)定性逐漸增強(qiáng)。而在雙(2-羥乙基)氨基(三羥甲基)甲烷緩沖溶液(Bis[2-Hydroxyethyl] imino Tris-(Hydroxymethyl)-methane,Bis-Tris)和4-嗎啉乙磺酸緩沖溶液(2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid,MES)中則呈現(xiàn)相反的結(jié)果。作者推測(cè),在不同的緩沖溶液中,K+對(duì)i-motif結(jié)構(gòu)的影響可能存在不同的作用機(jī)制:在PB和SCB緩沖液中,帶正電的K+在一定程度上中和帶負(fù)電的i-motif骨架結(jié)構(gòu)所產(chǎn)生的靜電排斥力,從而增強(qiáng)i-motif結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性;而在Bis-Tris和MES緩沖液中,K+與氫離子形成競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系,阻止胞嘧啶質(zhì)子化,進(jìn)而破壞胞嘧啶對(duì)中Hoogsteen氫鍵的形成, 破壞i-motif結(jié)構(gòu)的折疊。該機(jī)制的提出有利于促進(jìn)K+對(duì)端粒i-motif熱穩(wěn)定性影響的探究,并表明了在不同緩沖溶液中K+對(duì)端粒i-motif結(jié)構(gòu)的影響不同。

除K+外,一些其他陽離子對(duì)端粒i-motif結(jié)構(gòu)的影響也已有報(bào)道。Henry組[62]通過FRET滴定實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),高濃度的Ag+可以在近生理pH下促進(jìn)端粒i-motif結(jié)構(gòu)的形成,并且其形成的i-motif結(jié)構(gòu)由C-Ag+-C和C-H+-C兩種結(jié)構(gòu)單元共同構(gòu)成。Saxena組[63]也通過圓二色譜(circular dichroism,CD)等多種實(shí)驗(yàn)方法發(fā)現(xiàn),Mg2+可以在生理pH和分子擁擠 (40% PEG200) 的條件下穩(wěn)定端粒i-motif。除了以上已經(jīng)被證實(shí)可以穩(wěn)定端粒i-motif結(jié)構(gòu)的陽離子外,2014年Kim組[64]發(fā)現(xiàn),高濃度的Li+可以促進(jìn)端粒i-motif結(jié)構(gòu)解折疊進(jìn)而導(dǎo)致端粒i-motif穩(wěn)定性下降。2023年該組[65]利用FRET技術(shù)探究了單價(jià)陽離子(Li+,Na+,K+)對(duì)端粒i-motif穩(wěn)定性的影響,發(fā)現(xiàn)隨著單價(jià)陽離子濃度的增加,端粒i-motif的穩(wěn)定性逐漸下降。因此該組提出了i-motif結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的平衡由單價(jià)陽離子的兩種拮抗作用所控制:減少靜電排斥力和破壞胞嘧啶堿基對(duì)間的氫鍵作用。這些研究結(jié)果進(jìn)一步表明,高濃度的不同單價(jià)陽離子對(duì)端粒i-motif的穩(wěn)定性影響不同,也為單價(jià)陽離子可以在近生理pH下促進(jìn)i-motif結(jié)構(gòu)的形成提供了依據(jù)。

除上述pH、分子擁擠條件和離子性質(zhì)等影響因素外,富C序列能否形成i-motif結(jié)構(gòu)還受DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程中形成的核酸負(fù)超螺旋結(jié)構(gòu)等影響[66,67]。綜合對(duì)這些復(fù)雜環(huán)境因素下端粒i-motif結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的研究為闡釋其生理相關(guān)性,以及篩選和開發(fā)以其為靶點(diǎn)的藥物分子提供了基礎(chǔ)。

4 端粒i-motif配體分子及生物學(xué)功能

盡管在人類基因組中廣泛分布的潛在i-motif結(jié)構(gòu)可能參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控和端粒功能維持等多方面生物進(jìn)程,但i-motif在生理環(huán)境下是否存在,一直以來是該結(jié)構(gòu)是否具有生理相關(guān)性的爭(zhēng)論點(diǎn)。直至2018年,Christ和Dinger組的研究[51]首次為人類細(xì)胞核中存在i-motif結(jié)構(gòu)給出了直接證據(jù):研究者們篩選出一種i-motif特異性高靈敏抗體iMab并將其用于活細(xì)胞染色,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在基因的調(diào)控區(qū)域例如端粒、啟動(dòng)子區(qū)等廣泛存在i-motif位點(diǎn),且位點(diǎn)的多少與細(xì)胞周期所處階段及胞內(nèi)pH有關(guān)。同年,Sagun組[68]利用單分子濃度躍變策略,首次發(fā)現(xiàn)了端粒i-motif在中性pH和無作用力條件下半衰期約為3 s,表明端粒i-motif具有能夠與相關(guān)蛋白質(zhì)因子相互作用繼而參與到細(xì)胞基因調(diào)控的生命周期。2020年,King組[69]研究發(fā)現(xiàn),在人類細(xì)胞中G-四鏈體和i-motif的形成相互影響。因此,利用配體分子誘導(dǎo)和穩(wěn)定G-四鏈體或i-motif結(jié)構(gòu)可能會(huì)導(dǎo)致另外一個(gè)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性降低,造成其所在基因組結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變。這些工作為i-motif結(jié)構(gòu)在體內(nèi)存在并與關(guān)鍵生物進(jìn)程例如基因表達(dá)、端粒調(diào)控等相關(guān)提供了有力支撐,同時(shí)也為采用配體分子調(diào)控i-motif穩(wěn)定性進(jìn)而調(diào)控基因表達(dá)和細(xì)胞活性的疾病治療策略,以及藥物開發(fā)研究奠定了理論基礎(chǔ)。

i-motif特異性配體分子的篩選開發(fā)一直是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。早在i-motif結(jié)構(gòu)在體內(nèi)存在被證實(shí)之前,研究者們就通過在體外條件下篩選端粒i-motif配體分子并研究其生物活性來探究該結(jié)構(gòu)的生物相關(guān)性。2000年,Hurley組[70]首次報(bào)道了廣譜G-四鏈體配體分子TMPyP4可以在酸性pH下結(jié)合并穩(wěn)定端粒TAACCC重復(fù)序列形成的i-motif結(jié)構(gòu),并通過NMR實(shí)驗(yàn)推斷,其可能通過溝槽結(jié)合方式與端粒i-motif相互作用。之后,Qu組[71-73]通過系列研究發(fā)現(xiàn),單壁碳納米管(single-wall carbon nanotubes,SWNTs)能夠在生理?xiàng)l件下通過與端粒i-motif 5＇端大溝區(qū)結(jié)合選擇性識(shí)別并穩(wěn)定人端粒i-motif,這為在體內(nèi)和體外條件下通過選擇性識(shí)別端粒i-motif結(jié)構(gòu)進(jìn)而研究其生理功能提供了可能性。2012年,Qu組[72]進(jìn)一步報(bào)道了SWNTs在K562細(xì)胞和HeLa細(xì)胞中對(duì)端粒活性的調(diào)控及其作用機(jī)制:在SWNTs的存在下,端粒末端富C序列及其互補(bǔ)鏈上的富G序列能折疊成i-motif結(jié)構(gòu)和G-四鏈體結(jié)構(gòu),并阻礙端粒酶與端粒末端的結(jié)合,進(jìn)而影響其生物學(xué)功能。i-motif和G-四鏈體的持續(xù)存在還會(huì)導(dǎo)致端粒解包裹,引發(fā)后期橋的形成和端粒融合,造成端粒功能障礙。此外,SWNTs能夠誘導(dǎo)端粒結(jié)合蛋白質(zhì)例如端粒重復(fù)結(jié)合因子 2(telomeric repeat binding factor 2,TRF2)和POT1與端粒的解離,引起3′懸垂降解。這些端粒結(jié)構(gòu)和功能障礙最終導(dǎo)致端粒DNA的損傷應(yīng)答,激活DNA修復(fù)通路,引起p16、p21介導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞衰老及凋亡。這項(xiàng)工作首次為在癌細(xì)胞中通過穩(wěn)定端粒i-motif結(jié)構(gòu)進(jìn)而抑制端粒酶活性,并調(diào)控端粒功能提供了證據(jù),為端粒i-motif的生物相關(guān)性提供了有力支撐。

此后,一些其他能夠與端粒i-motif相互作用的配體分子也相繼被報(bào)道。例如已知的G-四鏈體配體分子小檗堿、BRACO-19、Phen-DC3、Pyridostatin、RHPS4和菲咯啉衍生物等被證實(shí)能與端粒i-motif相互作用(Fig.3)[74,75]。Gargallo[76]組和Jaro?ov[77]組分別發(fā)現(xiàn),小檗堿和Escholidine可能以十分微弱的靜電相互作用與端粒i-motif相結(jié)合。藥物米托蒽醌及其類似物可以在生理?xiàng)l件下(pH 7.4)誘導(dǎo)形成并穩(wěn)定端粒i-motif,且其與i-motif結(jié)構(gòu)的結(jié)合親和力高于G-四鏈體或雙鏈DNA[78]。一種環(huán)狀四惡唑化合物L(fēng)2H2-4OTD是弱的G-四鏈體穩(wěn)定劑,但被證實(shí)能夠結(jié)合到端粒i-motif環(huán)1、環(huán)3及其鄰近區(qū)域并與之相互作用[79]。此外,Chikhale組[80]采用分子對(duì)接篩選和FRET技術(shù)研究發(fā)現(xiàn),含糖天然產(chǎn)物分子黃芩苷和京尼平苷酸能與端粒i-motif相互作用,但對(duì)端粒i-motif熱穩(wěn)定性的影響不大。綜合上述研究可以發(fā)現(xiàn),目前已報(bào)道的多數(shù)配體分子并不能夠特異性識(shí)別端粒i-motif,且無法在生理pH下穩(wěn)定該結(jié)構(gòu)。因此,對(duì)于端粒i-motif特異性配體的篩選工作仍然值得關(guān)注。

除了尋找能夠穩(wěn)定端粒i-motif的配體分子外,有研究還發(fā)現(xiàn)了能夠破壞端粒i-motif結(jié)構(gòu)的配體分子。2021年,Li組[81]經(jīng)過廣泛篩選,發(fā)現(xiàn)吖啶二聚體DI26能夠特異性結(jié)合端粒i-motif并破壞其構(gòu)象和穩(wěn)定性,在A549細(xì)胞中下調(diào)TERRA轉(zhuǎn)錄水平并激活A(yù)TR依賴性DNA損傷應(yīng)答,抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和增殖。這項(xiàng)工作為端粒i-motif在調(diào)節(jié)與端粒酶活性、端粒結(jié)構(gòu)維持以及異染色質(zhì)形成密切相關(guān)的TERRA轉(zhuǎn)錄中的作用提供了重要基礎(chǔ)。端粒i-motif配體分子的篩選及其生物相關(guān)性研究有助于豐富人們對(duì)于端粒i-motif高級(jí)結(jié)構(gòu)在端粒酶活性抑制、端粒結(jié)構(gòu)維持,以及TERRA表達(dá)調(diào)控等方面作用的認(rèn)知,將為以端粒i-motif為靶點(diǎn)的癌癥治療新策略研究及藥物分子開發(fā)提供深入前景。

5 問題與展望

i-motif作為一種特殊的核酸二級(jí)結(jié)構(gòu),經(jīng)過幾十年的研究,人們對(duì)其認(rèn)知已經(jīng)逐漸從結(jié)構(gòu)特點(diǎn)延伸到生物學(xué)功能。但相對(duì)于其他核酸高級(jí)結(jié)構(gòu)例如G-四鏈體而言,i-motif的研究仍較為滯后。篩選開發(fā)能夠在生理?xiàng)l件下與i-motif特異性識(shí)別和穩(wěn)定該結(jié)構(gòu)的配體分子,并探究其在基因表達(dá)調(diào)控中的作用,仍是未來i-motif研究領(lǐng)域需要攻克的難題。

盡管有強(qiáng)有力的證據(jù)表明,富C序列在體外可以形成i-motif結(jié)構(gòu),近年來i-motif特異性抗體的開發(fā)也為其在細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)存在提供了直接證據(jù)[33],但這種四鏈DNA結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定性依賴于酸性條件,而活細(xì)胞是一個(gè)近中性且充斥著大量生物大分子和陽離子的復(fù)雜環(huán)境,人體內(nèi)端粒i-motif形成必然受到pH、擁擠環(huán)境和陽離子等多種因素影響。因此,對(duì)于端粒i-motif結(jié)構(gòu)在生理?xiàng)l件下折疊機(jī)制的探索仍需進(jìn)行。

存在于人類染色體端粒末端的核酸i-motif在抑制端粒酶活性和TERRA表達(dá)調(diào)控等方面具有重要作用。如前所述,SWNTs能夠識(shí)別并穩(wěn)定端粒i-motif,從而抑制端粒酶活性并導(dǎo)致端粒功能障礙,最終致使癌細(xì)胞凋亡[72];而配體分子DI26能夠破壞端粒i -motif結(jié)構(gòu),下調(diào)TERRA轉(zhuǎn)錄,最終引起端粒酶陰性癌細(xì)胞的凋亡[81]。這些都為以端粒i-motif為藥物靶點(diǎn)的癌癥治療新策略提供了前景。但迄今為止能夠與端粒i-motif特異性識(shí)別并結(jié)合的配體分子仍然較少,并且多為人工合成小分子,細(xì)胞毒性較大。而天然產(chǎn)物配體分子,例如小檗堿等則不具有選擇特異性,嚴(yán)重制約了以其為靶點(diǎn)的抗癌藥物開發(fā)。此外,由于端粒i-motif在近生理pH下難以折疊,目前的配體分子篩選研究大都在酸性條件下進(jìn)行,與真實(shí)細(xì)胞環(huán)境差異較大。因此,尋找能夠在近生理?xiàng)l件(中性pH, 高鉀離子濃度,分子擁擠)下特異性識(shí)別端粒i-motif的天然產(chǎn)物配體分子是一個(gè)十分值得關(guān)注的研究方向。

綜上所述,端粒i-motif作為一種能在染色體末端大量存在的特殊核酸高級(jí)結(jié)構(gòu),其折疊機(jī)制、配體識(shí)別及生物相關(guān)性等在未來仍需更廣泛和深入的研究。相關(guān)領(lǐng)域的研究進(jìn)展,將對(duì)基于染色體端粒高級(jí)結(jié)構(gòu)的癌癥發(fā)生機(jī)制及治療策略和藥物開發(fā)等提供重要依托。