地黃花葉病毒河南分離物的CP基因克隆及序列分析

馮陳尉, 李正剛, 郭 梟, 莊新建, 丁詩文, 董卓倬, 賀 振, 王鐵霖, 張 坤*

(1. 揚(yáng)州大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 江蘇揚(yáng)州 225009; 2. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 廣州 510640; 3. 廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510640; 4. 中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心, 北京 100700)

地黃(RehmanniaglutinosaLibosch.)又名地髓、生地等,因其地下塊根呈黃白色而得名,為玄參科(Scrophulariaceae)地黃屬(Rehmannia)多年生草本植物,最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》中,被列為上品中藥[1]。在田間生產(chǎn)中,連作和依靠塊莖進(jìn)行營養(yǎng)繁殖是導(dǎo)致地黃質(zhì)量和產(chǎn)量下降的主要原因[2], 地黃花葉病、輪紋病等是地黃生長過程中的主要病害[3]。

我國最早在河南省報(bào)道了地黃花葉病毒 (rehmannia mosaic virus, ReMV)[4], 其為煙草花葉病毒屬(Tobamovirus)成員[5], 是地黃生長過程中較易攜帶和傳播的一種植物病毒,侵染后會(huì)引起地黃產(chǎn)量及質(zhì)量降低[6]。目前在我國北京、山西、河南以及國外日本、韓國等地均有ReMV的報(bào)道[7]。侯紅琴等[6]于2007年發(fā)現(xiàn)ReMV的粒子形態(tài)為桿狀,經(jīng)過機(jī)械摩擦能侵染茄科、十字花科等10多種植物,表現(xiàn)出枯萎及花葉等癥狀,且體外存活期長。雷彩燕[8]研究表明地黃花葉病毒基因組由6 395個(gè)核苷酸組成,含4個(gè)開放閱讀框架(open reading frame, ORF), 分別編碼126、183、30和17.5 ku蛋白質(zhì); 基因組5′末端和3′末端分別有71和204 nt的非編碼區(qū),其中外殼蛋白(coat protein,CP)基因起始于5 712 nt處,終止于6 191 nt處。本研究對(duì)河南焦作溫縣地黃種植園中疑似地黃花葉病毒病樣品進(jìn)行鑒定與分析,利用RT-PCR方法成功克隆出ReMV河南分離物的CP基因核苷酸序列,測序后與NCBI數(shù)據(jù)庫中已有的核苷酸序列進(jìn)行比對(duì),分析該地區(qū)地黃花葉病毒基因的變異與進(jìn)化情況,為地黃花葉病毒的鑒定、防治及致病機(jī)制的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料及主要試劑、儀器

1) 樣品: 2019年夏,從河南省焦作市溫縣某中草藥園內(nèi)的地黃種植區(qū)內(nèi),采集具有葉片黃化、花葉、褪綠和壞死枯斑等典型病毒侵染癥狀的地黃樣品22份,用干燥劑和液氮處理后于-80 ℃冰箱保存。

2) 試劑: RTase M-MLV、5×M-MLV Buffer、dNTP Mixture、Recombinat RNase Inhibitor [寶生物工程(大連)公司], ReMV的ELISA檢測試劑盒(上海哈靈生物科技公司), DNA Marker、FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit試劑盒、2×TaqMaster Mix、RNA-easyTMIsolation Reagent試劑盒、FastPure Gel DNA膠回收試劑盒等(南京諾唯贊生物科技公司), pMD19-T載體[擎科生物科技(南京)公司]。

3) 儀器: T100 Thermal Cycler PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)[Bio-Rad(美國)公司], EPS 600凝膠電泳儀[天能科技(上海))公司], D3024R臺(tái)式高速微量冷凍離心機(jī)[塞洛捷克科技(美國)公司], Research plus手動(dòng)移液槍[艾本德科技 (德國) 公司], 無酶PCR管、離心管、槍頭等[愛思進(jìn) (美國) 公司]。

1.2 試驗(yàn)方法

根據(jù)GenBank中發(fā)布的不同地區(qū)ReMV分離物的CP基因核苷酸序列,使用BioEdit、SnapGene軟件設(shè)計(jì)引物,引物序列為CPReMV-F (5′-ATGTCTTATACAATTGCAACTCCAT-3′)和CPReMV-R (5′-TCAAGTTGCGGGACCAGAAG-3′)。引物由南京擎科生物科技公司合成。

1) 總RNA提取: 按文獻(xiàn)[9]的方法進(jìn)行,略加改進(jìn)。取0.2 g疑似帶毒地黃樣品,液氮冷卻后轉(zhuǎn)入液氮預(yù)冷的1.5 mL離心管中,磨成粉末; 加入RNA提取液和RNA緩沖液各600 μL, 劇烈混勻,靜置5 min, 渦旋振蕩, 4 ℃下12 000 r·min-1離心20 min; 吸取上清,加入等量RNA提取液,混勻后于冰上靜置, 4 ℃下12 000 r·min-1離心20 min; 吸取上清,加入等體積異丙醇, -20 ℃沉淀1 h, 4 ℃離心10 min; 棄去上清,加入70%乙醇1 mL, 4 ℃離心5 min; 棄去上清,加入100%乙醇1 mL, 4 ℃離心5 min; 真空抽干,溶于30 μL DEPC-H2O中備用。

2) 反轉(zhuǎn)錄: 取5 μL總RNA為模板,利用RTase M-MLV、5×M-MLV Buffer、dNTP Mixture、Recombinat RNase Inhibitor反轉(zhuǎn)錄試劑,合成cDNA.

3) PCR擴(kuò)增: 以cDNA為模板,使用Phanta高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得ReMVCP基因序列。50 μL PCR反應(yīng)體系中, cDNA 1 μL, 正反引物各2 μL, Phanta Max Super-Fidelity 1 μL, dNTP Mix 1 μL, 2×Phanta Max Buffer 25 μL, ddH2O 18 μL。程序設(shè)置: 95 ℃預(yù)變性3 min; 95 ℃變性15 s, 53 ℃ 退火30 s, 72 ℃延伸1 min, 共28個(gè)循環(huán); 72 ℃再延伸5 min, 25 ℃冷卻1 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測后,使用FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit試劑盒純化回收,克隆至pMD19-T載體中,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株,隨機(jī)挑選6個(gè)陽性單克隆送至上海生工生物工程公司測序,測序結(jié)果使用BioEdit、SnapGene、MEGA、DNAMAN等軟件進(jìn)行序列比對(duì)與分析,從NCBI中的BankIt (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/WebSub/index.cgi)提交序列。所得序列使用NCBI中的BLAST程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)搜索相似性序列并下載所有已發(fā)布的地黃花葉病毒CP基因序列,使用BioEdit的ClustalW Multiple alignment功能進(jìn)行所有CP基因核苷酸的序列比對(duì),比對(duì)結(jié)果導(dǎo)入MEGA軟件,利用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹 (設(shè)置Boostrap為1 000)[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 地黃花葉病毒病株癥狀

通過觀察、比較發(fā)現(xiàn),健康地黃葉片翠綠,植株挺拔,整體長勢好 (圖1.A)。部分疑似感病的地黃植株長勢與健康植株相對(duì)較弱,植株偏矮小; 葉緣變色,葉片有輕微黃化、褪綠和花葉癥狀; 下部葉片還伴有壞死斑出現(xiàn),并有向上位葉發(fā)展的趨勢; 新生葉片則無明顯癥狀,僅在葉緣有零星花葉癥狀 (圖1.A)。初步推斷上述癥狀可能是病毒侵染所致。

圖1 地黃疑似受病毒侵染后癥狀及分子鑒定圖*Fig.1 Symptoms and molecular identification of R.glutinosa after suspected virus infection* A. 健康地黃與疑似感病地黃; B. CPReMVRT-PCR檢測結(jié)果; C. CPReMV序列與GenBank登陸號(hào)。* A. healthy and suspected diseased R.glutinosa; B. detection of rehmannia mosaic virus in R.glutinosa samples by RT-PCR; C. the GenBank login number and sequence of CPReMV.

2.2 ReMV CP基因克隆

從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載所有已發(fā)布的不同地區(qū)ReMV分離物的CP基因核苷酸序列,通過SnapGene軟件設(shè)計(jì)引物,進(jìn)行RT-PCR檢測。PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示,本試驗(yàn)的4個(gè)地黃樣品均檢測出大小為480 bp的條帶(圖1.B), 與NCBI中公布的ReMVCP保守核苷酸序列大小一致。為獲得更為準(zhǔn)確的地黃花葉病毒河南分離物的CP基因序列,對(duì)PCR產(chǎn)物切膠回收并純化,構(gòu)建至pMD19-T載體中,轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α, 隨機(jī)挑選陽性單克隆測序。使用BioEdit處理測序結(jié)果,獲得ReMV河南焦作分離物(建議命名為ReMV-JZ等)CP基因核苷酸序列。

2.3 ReMV CP基因序列比對(duì)分析

通過NCBI中的BankIt程序上傳所得核苷酸序列,獲得ReMV-JZCP的GenBank登錄號(hào)為OM964874 (圖1.C)。將所有已報(bào)道的9條ReMVCP基因與ReMV-JZCP基因核苷酸序列進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)ReMV-JZCP基因序列與來自美國的ReMV分離物的CP基因(登錄號(hào)為MF348202.1)相似性最低為94.1%, 與來自韓國、日本以及我國山西、河南ReMV分離物的CP基因(登錄號(hào)為MG418836.1、KU133476.1、JX575184.1、JQ285996.1、LC571586.1、EF375551.1、NC 009041.1)均達(dá)到97.9%。這說明ReMVCP序列較為保守,在遺傳分化上地域差異不明顯。

2.4 ReMV CP基因的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析

ReMV河南焦作分離物的CP基因與我國河南鄭州和山西分離物以及韓國分離物的親緣關(guān)系較近,與日本分離物(登錄號(hào)為AB6281881.1)和美國分離物(登錄號(hào)為MF348202.1)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖2), 因此ReMV-JZ又與其他地區(qū)發(fā)現(xiàn)的分離物存在一定的遺傳分化。

圖2 基于CPReMV核苷酸序列構(gòu)建的ReMV不同分離物的系統(tǒng)進(jìn)化樹*Fig.2 Phylogenetic tree of obtained CPReMV nucleotide sequences and other deposited sequences in NCBI* 圖中節(jié)點(diǎn)處數(shù)字為重復(fù)1 000次所得到的自舉百分率。* The number at the node shows the bootstrap percentage obtained by repeating 1 000 times in the figure.

2.5 ReMV CP的序列一致性分析

地黃花葉病毒河南焦作分離物(登錄號(hào)為OM964874, 下同)與日本分離物(LC571586.1)、韓國分離物(MG418836.1、KU133476.1)、山西分離物(JQ285996.1、JX575184.1)、鄭州分離物(NC_009041.1、EF37555.1)序列相似性較高,均在98%以上; 與美國分離物(MF348202.1)、日本分離物(AB628188.1)序列相似性僅為94%, 說明親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖3)。該結(jié)果與系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹結(jié)果相一致。

3 討論

地黃在世界多個(gè)國家均有種植,且隨著地黃有效成分的不斷開發(fā)利用,人們對(duì)地黃的需求量也日益增長。由于耕種制度與地理環(huán)境的不同,不同種植區(qū)內(nèi)地黃遭受到多種不同病毒的影響?，F(xiàn)階段發(fā)現(xiàn)感染地黃的主要病毒類型有TMV、ToMV、ReMV、CMV、BBWV2、PVX、CIRV等[11-15]。

本研究于2019年夏從河南省焦作地區(qū)采集若干疑似受病毒侵染而呈現(xiàn)出花葉、枯萎等癥狀的地黃樣品,利用RT-PCR檢測確定了所采地黃樣品被ReMV侵染,同時(shí)對(duì)河南溫縣地區(qū)ReMV的分子變異和遺傳分化情況進(jìn)行了調(diào)查研究,通過與國內(nèi)河南鄭州和山西地區(qū),以及國外韓國、日本、美國報(bào)道的ReMV分離物CP基因進(jìn)行序列比對(duì)及分析,結(jié)果表明不同地區(qū)間ReMV分離物的CP基因在親緣關(guān)系上總體很接近,但隨著地理距離的擴(kuò)大也存在一定差異,這可能是不同地區(qū)的耕作制度、氣候、環(huán)境等多種因素綜合作用加速了病毒的進(jìn)化與變異。本研究通過對(duì)ReMV的CP基因序列進(jìn)行分析,為河南焦作地區(qū)ReMV的發(fā)生、分布、基因進(jìn)化與變異分析及地黃病毒病防治,保障地黃產(chǎn)業(yè)安全生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。

4 結(jié)論

結(jié)合前期高通量測序結(jié)果進(jìn)行引物設(shè)計(jì),通過RT-PCR技術(shù)成功克隆出地黃花葉病毒河南分離物的CP基因,結(jié)合NCBI中發(fā)布的地黃花葉病毒其他地區(qū)分離物的CP基因,構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹,結(jié)果表明河南焦作分離物與山西、鄭州及韓國分離物處于同一分支,其可能存在相同的傳染源; 但與日本、美國分離物的親緣關(guān)系較遠(yuǎn),說明其又存在一定的遺傳分化,這可能與其侵染了不同寄主有關(guān),序列一致性分析與該結(jié)果相一致。該研究有助于加強(qiáng)對(duì)ReMV的防控,豐富了對(duì)ReMV基因組的研究,為后續(xù)針對(duì)ReMV的改造奠定了基礎(chǔ)。