• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    布氏田鼠盲腸中纖維素分解菌的分離鑒定及其產(chǎn)酶條件優(yōu)化

    2024-01-10 00:52:20顧明慧范瑞洋王道晨于明浩魏萬紅楊生妹
    關(guān)鍵詞:布氏田鼠氮源

    顧明慧, 范瑞洋, 王道晨, 顧 晨, 于明浩, 魏萬紅, 楊生妹

    (揚(yáng)州大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 江蘇揚(yáng)州 225009)

    纖維素是自然界中數(shù)量最多的可再生資源之一[1]。由于其特殊的晶體結(jié)構(gòu)在自然條件下難以被水解,僅少量纖維素能被降解利用[2]。纖維素酶是一組能將纖維素分子降解為纖維二糖和葡萄糖等小分子物質(zhì)的復(fù)合酶[3]。利用微生物產(chǎn)纖維素酶降解纖維素是一種較有效的纖維素處理方法,該方法溫和、產(chǎn)物產(chǎn)率高、無二次污染[4]。

    目前已從土壤[5]、堆肥[6]、反芻動物胃腸道[7]等環(huán)境中分離出多株高產(chǎn)纖維素酶的菌株,但對布氏田鼠胃腸道纖維素分解菌的研究尚未見報道。布氏田鼠是主要分布在我國內(nèi)蒙古草原上的一種植食性哺乳動物[8-9], 每只每天可食用約40 g鮮草[10], 是典型的盲腸發(fā)酵動物。Ye等[11]研究表明布氏田鼠盲腸內(nèi)微生物數(shù)量和種類復(fù)雜多樣。鑒此,本研究以布氏田鼠盲腸內(nèi)容物為材料,通過剛果紅染色初篩、酶活力測定復(fù)篩等方法篩選出高酶活性纖維素分解菌株,并對菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定,研究其酶學(xué)特性,為纖維素資源的開發(fā)利用提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    1.1.1 樣品來源

    布氏田鼠捕捉于內(nèi)蒙古錫林浩特草原,飼養(yǎng)于揚(yáng)州大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院實驗動物房,并建立繁殖系。隨機(jī)選100日齡健康布氏田鼠雌雄各2只作為研究對象。布氏田鼠饑餓12 h后行安樂死,隨后解剖取出盲腸,放入無菌EP管中,于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.1.2 主要試劑

    蛋白胨、酵母提取物(濟(jì)南金華峰輝生物科技公司); MgSO4·7H2O、NaCl、K2HPO4、瓊脂(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司); 剛果紅、3,5-二硝基水楊酸(DNS) (上海生工生物工程公司)。

    1.1.3 主要儀器及設(shè)備

    臺式高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司); 電熱恒溫干燥箱(上海市實驗儀器總廠); 酶標(biāo)儀(上海精密科學(xué)儀器公司); 高壓蒸汽滅菌鍋(日本Tomy公司); 電子天平(上海精密科學(xué)儀器公司); PCR 擴(kuò)增儀(德國Christ-Elektronik公司); 凝膠成像分析儀(BIO-RAD Laboratories-Segrate)(美國Bio-Rad公司); 恒溫培養(yǎng)搖床(上海?,攲嶒瀮x器公司)等。

    1.2 培養(yǎng)基與配方

    1) 羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)篩選培養(yǎng)基: CMC-Na 10 g, K2HPO41.5 g, 蛋白胨5 g, 酵母粉5 g, NaCl 5 g, MgSO4·7H2O 0.2 g, 瓊脂16 g, 純化水1 000 mL。

    2) LB培養(yǎng)基: 蛋白胨10 g, 酵母5 g, NaCl 10 g, 純化水1 000 mL。

    3) 發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基: 蛋白胨10 g, 酵母5 g, NaCl 10 g, CMC-Na 10 g, 純化水1 000 mL。

    1.3 試驗方法

    1.3.1 纖維素分解菌初篩

    在超凈工作臺上將盲腸內(nèi)容物擠入50 mL無菌生理鹽水中,在搖床上震蕩30 min。搖完后菌液混勻,梯度稀釋至10-5級,取各濃度稀釋腸液0.2 mL, 分別涂布于CMC-Na平板上, 于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h, 向培養(yǎng)皿中加入適量的1 mg·mL-1剛果紅溶液,染色1 h后棄去染液,再加入適量1 mol·L-1NaCl溶液洗滌[12], 并測量水解圈的大小。

    1.3.2 纖維素分解菌復(fù)篩

    將初篩菌株接種到液體發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中,培養(yǎng)24 h后離心取上清液,即為粗酶液。以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn),采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)試劑法測定纖維素酶活性, CMC-Na在纖維素酶的作用下,水解產(chǎn)生纖維二糖和葡萄糖等還原糖,還原糖能將DNS中的硝基還原成棕紅色氨基化合物,在波長540 nm處測定吸光度D值,吸光度與酶活性呈正比。纖維素酶活性定義: 以每毫升粗酶液每分鐘產(chǎn)生1 mg葡萄糖所需的酶量作為1個酶活性單位(U·mL-1)。

    1.3.3 菌株鑒定

    1) 形態(tài)學(xué)鑒定: 經(jīng)初篩、復(fù)篩出1株纖維素酶活性最高的菌株T1, 觀察菌落的形態(tài)特征,并通過革蘭染色觀察菌體的染色特征[13]。

    2) 分子生物學(xué)鑒定: 菌株T1培養(yǎng)過夜后用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取DNA, PCR反應(yīng)的引物為細(xì)菌通用引物, PCR反應(yīng)體系體積為25 μL, 反應(yīng)條件見文獻(xiàn)[14]。測序由上海生工生物工程公司完成。將測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中用BLAST比對獲得相似性高的序列。利用MEGA6.0 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,根據(jù)菌株間的親緣關(guān)系確定菌株的種屬。

    1.3.4 菌株生長曲線

    將菌株T1接種到LB培養(yǎng)基中,培養(yǎng)至D值為1.0, 得種子液。按1%種子液接入50 mL新配制的LB培養(yǎng)基中, 37 ℃搖床培養(yǎng), 每4 h用酶標(biāo)儀測1次D600 nm值, 直至60 h。

    1.3.5 產(chǎn)酶條件優(yōu)化

    將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中,依次優(yōu)化培養(yǎng)基中碳源(高粱、玉米、大豆、羧甲基纖維素鈉、水稻、小麥)、氮源(蛋白胨、硫酸銨、硝酸銨、明膠)的種類和濃度(0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%)以及接種量(1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%), 37 ℃、160 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h, 將菌液在上述確定的最佳條件下進(jìn)行纖維素酶活性測定,試驗重復(fù)3次,結(jié)果取平均值。

    1.3.6 纖維素酶的酶學(xué)特性研究

    1) 酶反應(yīng)最適pH: 將1.0% CMC-Na的底物分別溶于pH 3.0~7.0的緩沖液中, 40 ℃反應(yīng)30 min 后測定該纖維素酶活性,試驗重復(fù)3次, 結(jié)果取平均值,最終確定纖維素酶反應(yīng)的最適pH值。

    2) 酶的酸堿穩(wěn)定性: 將pH 4.0~8.0 緩沖液與粗酶液按同等量混勻, 40 ℃水浴中保溫1 h, 在最適pH反應(yīng)條件下,測定相對纖維素酶活性,試驗重復(fù)3次, 結(jié)果取平均值,并評價酶的酸堿穩(wěn)定性。

    3) 酶反應(yīng)最適溫度: 將粗酶液分別置于不同溫度(40、50、60、70和80 ℃)反應(yīng)30 min, 測定該纖維素酶活性,試驗重復(fù)3次,結(jié)果取平均值,最終確定纖維素酶反應(yīng)的最適溫度。

    4) 酶的熱穩(wěn)定性: 將粗酶液分別在30、40、50、60和70 ℃的水浴中保溫1 h, 在最適溫度和最適pH下測定相對酶活性,試驗重復(fù)3次,結(jié)果取平均值,并評價該酶的熱穩(wěn)定性。

    5) 最適反應(yīng)時間: 將粗酶液與CMC-Na底物在最適 pH及最適溫度條件下分別反應(yīng)10、20、30、40和50 min, 測定不同反應(yīng)時間纖維素酶活性,確定纖維素酶反應(yīng)的最佳時間。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 纖維素分解菌株的篩選

    在CMC-Na選擇培養(yǎng)基上挑取菌落形態(tài)不同的菌株共8株,經(jīng)純化培養(yǎng),利用剛果紅染色后菌落周圍可見清晰的透明水解圈。將獲得的菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩,篩選結(jié)果見表1。最終選取纖維素酶活性最高的菌株T1用于酶學(xué)特性及產(chǎn)酶條件的探究。

    表1 纖維素分解菌的分離篩選Tab.1 Isolation and screening of cellulose-degrading bacteria

    2.2 菌株T1的鑒定

    2.2.1 菌株T1的形態(tài)學(xué)鑒定

    經(jīng)觀察表明,菌株T1在固體培養(yǎng)基上扁平,表面褶皺,形成灰白色不透明的菌落(圖1.A)。經(jīng)革蘭染色,菌株T1為革蘭陽性桿狀菌,有芽孢(圖1.B)。

    圖1 菌株T1的菌落形態(tài)特征及革蘭染色Fig.1 Morphology characteristic and gram staining of strain T1

    2.2.2 菌株T1的分子生物學(xué)鑒定

    測序結(jié)果顯示,該纖維素分解菌T1的16SrDNA基因序列長為1 374 bp左右。序列同源性分析顯示,菌株T1與芽孢桿菌屬細(xì)菌的16SrDNA序列相似性在99%以上。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示,該菌株與Bacillussubtilisstrain親緣關(guān)系最近(圖2)。綜合該菌株的菌落形態(tài)、生化特性和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果,確定獲得的纖維素分解菌T1為枯草芽孢桿菌。

    圖2 菌株T1 16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹*Fig.2 Phylogenetic tree of strain T1 based on its 16S rDNA gene* 圖中節(jié)點處數(shù)字為重復(fù)1 000次所得到的自舉百分率。* The number at the node shows the bootstrap percentage obtained by repeating 1 000 times in the figure.

    2.3 菌株T1的生長特性

    圖3為菌株T1的生長規(guī)律,當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)4~16 h時,菌株 T1 進(jìn)入對數(shù)生長期; 培養(yǎng)16~48 h 時處于緩慢增長期; 40 h 后進(jìn)入衰退期。

    圖3 菌株T1的生長曲線Fig.3 Growth curve of strain T1

    2.4 菌株T1產(chǎn)纖維素酶條件的初步優(yōu)化

    2.4.1 碳源種類及濃度對菌株酶活性的影響

    由圖4.A可知,菌株T1可利用高粱、玉米、大豆、水稻、小麥及CMC-Na等碳源,但以玉米粉作為碳源時,酶活性最高(8.83 U·mL-1), 以小麥為碳源時,酶活性最低(5.34 U·mL-1)。由于玉米粉來源廣,價格低廉,因此選擇玉米粉作為最佳碳源。由圖5.B可知,當(dāng)玉米粉濃度為1.5%時, 酶活性最高(9.48 U·mL-1), 隨著濃度的上升,酶活性降低。因此選擇濃度為1.5%的玉米粉作為最佳碳源進(jìn)行后續(xù)研究。

    圖4 不同碳源和玉米粉濃度對酶活性的影響*Fig.4 Effect of carbon source and corn flour concentration on enzyme activity* C1. 高梁; C2. 玉米; C3. 大豆; C4. CMC-Na; C5. 水稻; C6. 小麥。* C1. sorghum; C2. millet; C3. bean; C4.CMC-Na ; C5. rice; C6. wheat.

    圖5 不同氮源和蛋白胨濃度對酶活性的影響*Fig.5 Effect of nitrogen source and peptone concentration on enzyme activity* N1. 蛋白胨; N2. 硫酸銨; N3. 硝酸銨; N4. 明膠。* N1. peptone; N2. (NH4)2SO4; N3. NH4NO3; N4. gelatin.

    2.4.2 氮源種類及濃度對菌株酶活性的影響

    由圖6.A可知,菌株T1可利用蛋白胨、硫酸銨、明膠、硝酸銨等氮源,其中以蛋白胨為氮源時酶活性最高,以硝酸銨為氮源時酶活性最低。由圖6.B可知,當(dāng)?shù)鞍纂藵舛葹?%時酶活性最高。因此以1%蛋白胨作為最佳氮源進(jìn)行后續(xù)研究。

    圖6 不同接種量對菌株T1酶活性的影響Fig.6 Effect of different inoculation amount on enzyme activity

    2.4.3 菌液接種量對菌株酶活性的影響

    由圖6可知,菌液接種量明顯影響酶活性,當(dāng)接種量為5%時酶活性最高(11.49 U·mL-1); 接種量超過5%后,酶活性降低,因此最佳接種量為5%。

    2.5 菌株T1分泌纖維素酶的酶學(xué)特性

    2.5.1 纖維素酶的最適pH和pH穩(wěn)定性

    以CMC-Na為底物,在緩沖溶液中測定纖維素酶的最適pH。由圖7.A可知,菌株T1分泌的纖維素酶最適pH為4.8, 在pH 3~4.8時,隨著pH的增加酶活性升高,當(dāng)pH超過4.8后酶活性降低。在37 ℃條件下,將纖維素酶在不同緩沖液中保溫1 h, 以未處理的粗酶液為100%計算殘存酶活性百分比,即相對酶活性。由圖7.B所示,在pH 4~8范圍內(nèi)酶活性均保持在60%以上,說明菌株T1分泌的纖維素酶具有良好的耐酸堿性。

    圖7 不同pH對酶活性和酶穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of different pH on activity and stability of cellulase

    2.5.2 纖維素酶的最適溫度和熱穩(wěn)定性

    由圖8.A可知,在溫度40 ℃時酶活性最高,且隨著溫度的升高,酶活性逐漸降低。由圖8.B可知,當(dāng)溫度為40~50 ℃時,酶活性保持在80%以上,穩(wěn)定性強(qiáng); 當(dāng)溫度為50~80 ℃時,酶活性迅速下降。

    圖8 不同溫度對酶活性和酶穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effect of different temperature on activity and stability of cellulose

    2.5.3 纖維素酶的最佳反應(yīng)時間

    由圖9可知,隨著反應(yīng)時間的延長,酶活性增高,在反應(yīng)時間40 min 時酶活性最高,此后酶活性降低。

    圖9 不同反應(yīng)時間對酶活性的影響Fig.9 Effect of different reaction time on enzyme activity

    3 討論

    本研究采用以CMC-Na為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基,通過剛果紅染色初篩, DNS法測定酶活性復(fù)篩出1株纖維素分解菌,這是一種簡單、快捷、低成本的方法。最終確定T1菌株為布氏田鼠盲腸內(nèi)產(chǎn)纖維素酶的優(yōu)勢菌,并對其進(jìn)行16SrDNA分子生物學(xué)鑒定,鑒定確認(rèn)菌株T1為枯草芽孢桿菌的一種。本研究結(jié)果豐富了布氏田鼠腸道源纖維素降解菌的種類,為高效菌株T1的纖維素酶利用提供了理論基礎(chǔ)。

    目前,國內(nèi)已有較多纖維素分解菌的相關(guān)研究報道。何靜等[15]從雙峰駝糞便中篩選出多株纖維素分解菌,其中酶活性最高的一株是纖維化纖維微菌(Cellulosimicrobiumcellulans), 經(jīng)過優(yōu)化后酶活性可達(dá)0.66 U·mL-1。蘇少鋒[16]從蒙古馬腸道中獲得一株高產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌,經(jīng)鑒定該菌為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens), 優(yōu)化后酶活性可達(dá)0.92 U·mL-1。 也有研究從落葉土壤、高溫好氧堆肥中分離出能降解纖維素的細(xì)菌,如短小芽孢桿菌[17]、嗜熱脂肪芽孢桿菌[18]等。

    枯草芽孢桿菌屬于好氧、嗜溫、產(chǎn)芽孢的革蘭陽性短桿菌[19], 廣泛存在于動物腸道、土壤以及腐敗的有機(jī)物中[20]。吳麗娟等[21]研究表明,枯草芽孢桿菌可拮抗腸道中有害菌群增殖,具有維護(hù)腸道內(nèi)環(huán)境平衡和增強(qiáng)免疫力等功能。本研究經(jīng)條件優(yōu)化后酶活性可達(dá)11.49 U·mL-1, 高于陳龍等[22]從梅花鹿新鮮糞便中分離出的枯草芽孢桿菌酶活性(1.106 U·mL-1), 以及高于徐榮[23]從白蟻腸道中分離出的枯草芽孢桿菌酶活性(3.6 U·mL-1), 因而具有廣闊的應(yīng)用前景。

    諸多研究表明,菌株的發(fā)酵條件,如碳源、氮源、溫度、pH和接種量等均會影響纖維素酶活性[24]。關(guān)于產(chǎn)酶條件的優(yōu)化,高云航等[25]從白蟻腸道中分離出最強(qiáng)菌株MX5, 以0.5%秸稈為碳源、0.5%酵母粉和硫酸銨混合物為氮源、接種量1%時,產(chǎn)酶活性最高。楊偉平等[26]從藏豬腸道中分離出BacillussublitisBY-2, 其發(fā)酵所需的最佳碳源為1%玉米粉、最佳氮源為2%蛋白胨和酵母粉的復(fù)合物,在發(fā)酵起始pH值5.5、接種量4%時產(chǎn)纖維素酶量高且穩(wěn)定。本研究結(jié)果表明,在產(chǎn)酶發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中以1.5%玉米粉為碳源、1%蛋白胨為氮源、5%接種量時酶活性最高。這與高云航等[25]研究結(jié)果不同。雖然菌株均從腸道中分離得到,但由于存在不同菌株以及不同菌株來源等原因,使得最佳產(chǎn)酶條件差異很大。該酶最適溫度為40 ℃、最適pH為4.8, 具有一定的耐酸性和耐熱性,因此在食品行業(yè)或廢料處理等方面具有較廣的應(yīng)用前景。

    4 結(jié)論

    以布氏田鼠盲腸內(nèi)容物為研究對象,初篩出8株具有分解纖維素能力的菌株,發(fā)酵法復(fù)篩出分解能力最強(qiáng)的菌株T1, 經(jīng)鑒定確定為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilisstrain)。菌株T1以1.5%玉米粉作為碳源、1%蛋白胨作為氮源、接種量為5%時產(chǎn)纖維素酶量最高。該纖維素酶最適反應(yīng)pH為4.8, 最適反應(yīng)溫度為40 ℃, 最佳反應(yīng)時間為40 min, 且具有一定的酸堿耐受性和熱穩(wěn)定性。

    猜你喜歡
    布氏田鼠氮源
    田鼠尋親記
    小田鼠過冬
    和田鼠小弟一樣
    布氏菌病患者抗體測定與細(xì)菌學(xué)檢驗結(jié)果的比較觀察
    滴鼻免疫布氏菌活疫苗保護(hù)效果的研究
    無機(jī)氮源對紅曲霉調(diào)控初探
    中國釀造(2016年12期)2016-03-01 03:08:11
    羊種布氏菌043強(qiáng)毒株BRA0434基因缺失突變株的構(gòu)建與毒力的初步評價
    布氏菌與巨噬細(xì)胞的相互作用機(jī)制
    中藥渣生產(chǎn)蛋白飼料的氮源優(yōu)化研究
    中國釀造(2014年9期)2014-03-11 20:21:03
    響應(yīng)面分析法和氮源改進(jìn)優(yōu)化L-賴氨酸發(fā)酵工藝
    国产精品无大码| 大片免费播放器 马上看| 成人漫画全彩无遮挡| 啦啦啦在线观看免费高清www| 日韩精品有码人妻一区| 婷婷色麻豆天堂久久| a级毛片在线看网站| av网站免费在线观看视频| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 亚洲精品乱久久久久久| av免费在线看不卡| 亚洲综合色惰| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| av免费在线看不卡| 亚洲精品国产一区二区精华液| 欧美另类一区| 啦啦啦在线免费观看视频4| 亚洲成人手机| 在线 av 中文字幕| 日本91视频免费播放| 性高湖久久久久久久久免费观看| 中文欧美无线码| 一级片'在线观看视频| 一边亲一边摸免费视频| 中文字幕av电影在线播放| 日韩 亚洲 欧美在线| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 亚洲成av片中文字幕在线观看 | av免费观看日本| 成人手机av| 国产 一区精品| 一区在线观看完整版| 亚洲av成人精品一二三区| av在线观看视频网站免费| 中文天堂在线官网| 亚洲av国产av综合av卡| 老鸭窝网址在线观看| 欧美日韩成人在线一区二区| 街头女战士在线观看网站| 日韩中字成人| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 七月丁香在线播放| 啦啦啦在线观看免费高清www| 国产人伦9x9x在线观看 | 久久婷婷青草| 岛国毛片在线播放| 国产熟女欧美一区二区| av网站免费在线观看视频| 91精品三级在线观看| 国产av码专区亚洲av| 永久网站在线| 国产一区二区三区综合在线观看| 久久精品国产亚洲av涩爱| a级片在线免费高清观看视频| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 国产精品成人在线| 中文字幕最新亚洲高清| 亚洲三区欧美一区| av视频免费观看在线观看| 成人亚洲精品一区在线观看| 成人毛片60女人毛片免费| 亚洲美女视频黄频| 久久久精品94久久精品| 中文字幕av电影在线播放| 三级国产精品片| 亚洲国产看品久久| 欧美+日韩+精品| 老鸭窝网址在线观看| 精品久久蜜臀av无| av国产精品久久久久影院| 嫩草影院入口| 国产日韩欧美视频二区| 日本欧美视频一区| 久久国产精品大桥未久av| 香蕉国产在线看| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 国产极品粉嫩免费观看在线| 国产亚洲欧美精品永久| 国产成人免费无遮挡视频| 欧美国产精品va在线观看不卡| 精品国产超薄肉色丝袜足j| av在线app专区| 亚洲第一青青草原| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 交换朋友夫妻互换小说| 日韩人妻精品一区2区三区| 国产精品无大码| 亚洲av成人精品一二三区| 伦理电影免费视频| 免费日韩欧美在线观看| 美女中出高潮动态图| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 日韩中文字幕视频在线看片| 久久久久网色| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 国产成人午夜福利电影在线观看| 男女啪啪激烈高潮av片| 欧美少妇被猛烈插入视频| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| h视频一区二区三区| 又大又黄又爽视频免费| 在线观看三级黄色| 观看美女的网站| 久久精品国产综合久久久| 下体分泌物呈黄色| 亚洲精品国产av蜜桃| 日本欧美视频一区| 看免费成人av毛片| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 成人黄色视频免费在线看| 一级毛片 在线播放| av一本久久久久| 热re99久久国产66热| 国产精品久久久久久精品电影小说| 超碰成人久久| 久久午夜福利片| 看免费av毛片| a级毛片黄视频| 久久久精品区二区三区| 丝袜喷水一区| 亚洲,欧美精品.| 久久女婷五月综合色啪小说| 亚洲av欧美aⅴ国产| 亚洲美女黄色视频免费看| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 老熟女久久久| 午夜免费男女啪啪视频观看| 两性夫妻黄色片| 日本av手机在线免费观看| 亚洲国产欧美日韩在线播放| av有码第一页| av片东京热男人的天堂| 亚洲av免费高清在线观看| 精品一区二区三卡| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 国产综合精华液| 久久久久久人人人人人| 亚洲av电影在线进入| 久久久久视频综合| 狂野欧美激情性bbbbbb| 高清视频免费观看一区二区| 亚洲美女视频黄频| 欧美人与性动交α欧美软件| h视频一区二区三区| 大香蕉久久成人网| 91精品伊人久久大香线蕉| av在线app专区| 高清黄色对白视频在线免费看| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产精品二区激情视频| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 99久国产av精品国产电影| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 18在线观看网站| 一区二区三区四区激情视频| 涩涩av久久男人的天堂| a级毛片在线看网站| 我的亚洲天堂| 亚洲av在线观看美女高潮| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 国产视频首页在线观看| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 香蕉丝袜av| 亚洲精品国产一区二区精华液| 国产乱来视频区| 久久鲁丝午夜福利片| 精品一区二区免费观看| 亚洲国产色片| 国产成人一区二区在线| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 亚洲av免费高清在线观看| 亚洲视频免费观看视频| 欧美日韩一级在线毛片| 午夜福利影视在线免费观看| 午夜福利一区二区在线看| 中文欧美无线码| 9191精品国产免费久久| 一区福利在线观看| 两性夫妻黄色片| videossex国产| 精品国产一区二区三区四区第35| 只有这里有精品99| 久久午夜福利片| 秋霞伦理黄片| 日本色播在线视频| 我要看黄色一级片免费的| 精品人妻在线不人妻| 欧美精品一区二区免费开放| 亚洲精品国产av成人精品| 午夜免费男女啪啪视频观看| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 美女国产高潮福利片在线看| 中文字幕人妻丝袜一区二区 | 人妻人人澡人人爽人人| 欧美变态另类bdsm刘玥| 久久精品国产自在天天线| 高清欧美精品videossex| 亚洲视频免费观看视频| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 9热在线视频观看99| 亚洲男人天堂网一区| av片东京热男人的天堂| 三级国产精品片| 大香蕉久久网| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 丰满饥渴人妻一区二区三| videosex国产| 国产成人91sexporn| 亚洲情色 制服丝袜| 丝袜美足系列| 999久久久国产精品视频| 宅男免费午夜| 日韩人妻精品一区2区三区| 爱豆传媒免费全集在线观看| 日韩欧美精品免费久久| 久久久久久人妻| 免费在线观看完整版高清| 边亲边吃奶的免费视频| 欧美日韩一级在线毛片| 色婷婷av一区二区三区视频| 在线观看三级黄色| 欧美国产精品一级二级三级| 国产一区二区 视频在线| √禁漫天堂资源中文www| 日韩三级伦理在线观看| 色哟哟·www| 久久国产亚洲av麻豆专区| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 精品第一国产精品| 国产日韩欧美视频二区| 国产伦理片在线播放av一区| 黄片无遮挡物在线观看| 日本av手机在线免费观看| 香蕉精品网在线| 深夜精品福利| 交换朋友夫妻互换小说| 丝袜美足系列| 国产成人一区二区在线| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 中文字幕人妻丝袜制服| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 国产精品久久久av美女十八| 成人黄色视频免费在线看| 亚洲一区中文字幕在线| 午夜福利在线免费观看网站| 国产人伦9x9x在线观看 | 亚洲精品国产色婷婷电影| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 毛片一级片免费看久久久久| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 日韩三级伦理在线观看| 18禁观看日本| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 亚洲国产欧美网| 亚洲国产精品999| 成人国语在线视频| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 视频在线观看一区二区三区| 国产精品熟女久久久久浪| av有码第一页| 丰满迷人的少妇在线观看| 日本欧美视频一区| 日本wwww免费看| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 香蕉丝袜av| 日日爽夜夜爽网站| 1024香蕉在线观看| 国产精品人妻久久久影院| 如何舔出高潮| 亚洲人成电影观看| av女优亚洲男人天堂| 免费高清在线观看日韩| 亚洲情色 制服丝袜| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | av免费观看日本| 国产精品99久久99久久久不卡 | 成人国语在线视频| 男人舔女人的私密视频| 一区二区三区精品91| 人妻人人澡人人爽人人| 性高湖久久久久久久久免费观看| 天堂8中文在线网| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 女人精品久久久久毛片| 成年av动漫网址| 一区二区三区精品91| 亚洲av免费高清在线观看| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 9色porny在线观看| 在线观看免费视频网站a站| 99久久中文字幕三级久久日本| 国产一级毛片在线| 国产黄色免费在线视频| av女优亚洲男人天堂| 国产精品av久久久久免费| 日本爱情动作片www.在线观看| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 午夜av观看不卡| 黄色视频在线播放观看不卡| 寂寞人妻少妇视频99o| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 另类亚洲欧美激情| 有码 亚洲区| 国产亚洲精品第一综合不卡| 26uuu在线亚洲综合色| 99热全是精品| 精品福利永久在线观看| 又黄又粗又硬又大视频| 国产高清不卡午夜福利| 国产av国产精品国产| 欧美黄色片欧美黄色片| 中文字幕最新亚洲高清| 精品视频人人做人人爽| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| av线在线观看网站| 又大又黄又爽视频免费| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产 一区精品| 人妻系列 视频| 边亲边吃奶的免费视频| 免费日韩欧美在线观看| 亚洲第一区二区三区不卡| 国产精品久久久久久av不卡| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 欧美精品av麻豆av| 少妇的逼水好多| 日韩av免费高清视频| 久久久国产欧美日韩av| av免费在线看不卡| 新久久久久国产一级毛片| 成人国产麻豆网| 人妻系列 视频| 91午夜精品亚洲一区二区三区| a级毛片黄视频| 欧美xxⅹ黑人| 2021少妇久久久久久久久久久| 国产av精品麻豆| 中文字幕av电影在线播放| 99re6热这里在线精品视频| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 欧美变态另类bdsm刘玥| 男女国产视频网站| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 国产精品秋霞免费鲁丝片| 亚洲精品中文字幕在线视频| 欧美日韩视频精品一区| 啦啦啦啦在线视频资源| 久久99精品国语久久久| 少妇熟女欧美另类| 超色免费av| 欧美成人午夜精品| 久久99精品国语久久久| 亚洲欧美精品综合一区二区三区 | 精品国产国语对白av| 大香蕉久久网| 午夜福利视频精品| 亚洲av电影在线进入| 美女福利国产在线| 黄色配什么色好看| 国产综合精华液| 人妻一区二区av| 黑人欧美特级aaaaaa片| 人妻一区二区av| www.熟女人妻精品国产| 午夜福利视频在线观看免费| 伊人亚洲综合成人网| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产淫语在线视频| 两性夫妻黄色片| av不卡在线播放| 十八禁网站网址无遮挡| 丰满乱子伦码专区| 丝瓜视频免费看黄片| 国产精品偷伦视频观看了| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 亚洲视频免费观看视频| 国产精品人妻久久久影院| 国产乱人偷精品视频| 欧美日韩视频精品一区| 亚洲欧美一区二区三区国产| 国产成人精品久久二区二区91 | av免费在线看不卡| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 一级毛片我不卡| 国产1区2区3区精品| 一区二区日韩欧美中文字幕| 国产成人免费观看mmmm| 久久精品久久久久久久性| 久久久久久久久久久久大奶| 一级毛片我不卡| 女性生殖器流出的白浆| 青青草视频在线视频观看| 少妇被粗大的猛进出69影院| 桃花免费在线播放| 亚洲国产成人一精品久久久| 香蕉国产在线看| 亚洲精品第二区| 一级,二级,三级黄色视频| 日韩欧美精品免费久久| 性高湖久久久久久久久免费观看| 看免费av毛片| 18禁国产床啪视频网站| 大片电影免费在线观看免费| 丝袜喷水一区| 国产97色在线日韩免费| 欧美成人午夜免费资源| 日韩伦理黄色片| 欧美成人午夜精品| 满18在线观看网站| 丝袜美足系列| 在线天堂中文资源库| 伦理电影免费视频| 日韩电影二区| 日本vs欧美在线观看视频| 九九爱精品视频在线观看| 欧美日韩视频精品一区| 超碰97精品在线观看| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 在线 av 中文字幕| 亚洲成人av在线免费| 国产成人av激情在线播放| av视频免费观看在线观看| 久久久国产一区二区| 在线观看人妻少妇| 亚洲伊人久久精品综合| 天堂俺去俺来也www色官网| 色网站视频免费| 青青草视频在线视频观看| 美女中出高潮动态图| 日韩三级伦理在线观看| 久久精品久久久久久久性| 交换朋友夫妻互换小说| 日韩欧美精品免费久久| 色94色欧美一区二区| 久久久久久久精品精品| 精品一区二区三卡| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 国产爽快片一区二区三区| 久久精品亚洲av国产电影网| 欧美精品亚洲一区二区| 国产免费福利视频在线观看| 卡戴珊不雅视频在线播放| 久久这里有精品视频免费| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 久久久久久久久久人人人人人人| 热re99久久国产66热| 欧美黄色片欧美黄色片| 午夜激情久久久久久久| 国产精品久久久久久精品古装| 熟女电影av网| 国产av国产精品国产| 欧美变态另类bdsm刘玥| 少妇的丰满在线观看| 熟妇人妻不卡中文字幕| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 欧美人与性动交α欧美软件| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 久久综合国产亚洲精品| 秋霞伦理黄片| av又黄又爽大尺度在线免费看| 在线观看www视频免费| 满18在线观看网站| av在线app专区| 两性夫妻黄色片| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 午夜激情av网站| 夫妻性生交免费视频一级片| 久久精品久久精品一区二区三区| 人妻一区二区av| 欧美另类一区| 男女无遮挡免费网站观看| 亚洲内射少妇av| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 美女国产视频在线观看| 国产深夜福利视频在线观看| 观看av在线不卡| 黄色 视频免费看| 最新中文字幕久久久久| 18禁动态无遮挡网站| 男人操女人黄网站| 一二三四在线观看免费中文在| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 国产男女内射视频| 国产淫语在线视频| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 久久久久久久国产电影| 丝袜美腿诱惑在线| 一级毛片我不卡| 在线精品无人区一区二区三| 两个人看的免费小视频| 天天影视国产精品| 午夜久久久在线观看| 久久狼人影院| 最近最新中文字幕免费大全7| 亚洲少妇的诱惑av| 亚洲国产欧美在线一区| 人妻 亚洲 视频| 欧美另类一区| 另类亚洲欧美激情| 在线观看国产h片| 亚洲精品美女久久av网站| 卡戴珊不雅视频在线播放| 久久久久久久久久久免费av| 青青草视频在线视频观看| kizo精华| 久久ye,这里只有精品| 日韩在线高清观看一区二区三区| 国产人伦9x9x在线观看 | 精品人妻偷拍中文字幕| 成年人午夜在线观看视频| 国产成人精品无人区| 不卡av一区二区三区| 色网站视频免费| 亚洲国产最新在线播放| 国产男女超爽视频在线观看| 99九九在线精品视频| 黑丝袜美女国产一区| 人妻人人澡人人爽人人| 欧美激情高清一区二区三区 | 亚洲欧美精品综合一区二区三区 | 亚洲,一卡二卡三卡| 久久精品国产亚洲av高清一级| 亚洲av综合色区一区| 国产成人免费观看mmmm| 国产伦理片在线播放av一区| 亚洲欧美清纯卡通| 国产精品无大码| 欧美精品高潮呻吟av久久| 黄片播放在线免费| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 性色av一级| 久久久久视频综合| 99国产精品免费福利视频| 日韩免费高清中文字幕av| 91国产中文字幕| 欧美av亚洲av综合av国产av | 如何舔出高潮| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 99国产综合亚洲精品| 春色校园在线视频观看| 一区二区三区精品91| 日本91视频免费播放| 国产综合精华液| 免费观看在线日韩| 丝袜在线中文字幕| 高清av免费在线| 美女高潮到喷水免费观看| 国产 精品1| 亚洲美女视频黄频| 蜜桃在线观看..| 9191精品国产免费久久| 久久99精品国语久久久| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 日韩成人av中文字幕在线观看| 在线看a的网站| 久久久久久久大尺度免费视频| 有码 亚洲区| 波野结衣二区三区在线| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 美国免费a级毛片| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 国产又爽黄色视频| av在线播放精品| 久久久亚洲精品成人影院| 伊人久久国产一区二区| 亚洲情色 制服丝袜| 亚洲av日韩在线播放| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产精品欧美亚洲77777| 国产男女超爽视频在线观看| 久久精品久久久久久久性| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 五月开心婷婷网| 99热全是精品| 国产一区亚洲一区在线观看| 久久久久精品人妻al黑| 水蜜桃什么品种好| 99热网站在线观看| 亚洲国产精品999| 99久久精品国产国产毛片| 中文字幕人妻熟女乱码| 国产午夜精品一二区理论片| 国产在视频线精品| 99香蕉大伊视频| 日韩一区二区视频免费看| 99九九在线精品视频| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 久久99热这里只频精品6学生| 久久99一区二区三区| 久久精品国产亚洲av天美| 久久午夜综合久久蜜桃| 在线看a的网站| 亚洲图色成人| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 寂寞人妻少妇视频99o| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 两个人看的免费小视频| 天天操日日干夜夜撸| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 久久久久久久久免费视频了| 男女免费视频国产| 亚洲av在线观看美女高潮| 黄色怎么调成土黄色| 母亲3免费完整高清在线观看 | 日韩伦理黄色片| 18禁国产床啪视频网站|