多花黃精提取物體外干預(yù)3T3-L1 前脂肪細(xì)胞并緩解其脂質(zhì)積累

李婷婷，嚴(yán)曉雪，周溯，鮑星宇，蔣益虹

（浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310058）

肥胖屬于慢性疾病的范疇，由體內(nèi)脂肪過度堆積致使體質(zhì)量異常增長引起，與相關(guān)種類癌癥、心血管疾病、中風(fēng)等的發(fā)病率和死亡率上升具有密切關(guān)系[1]。迄今為止，已有許多研究對(duì)天然食品成分的抗肥胖活性進(jìn)行了評(píng)估。先前臨床試驗(yàn)表明，天然植物提取物中的黃酮類[2]、萜類[3]、多酚類[4]等化合物具有降低肥胖小鼠體重和抑制脂肪細(xì)胞增大等作用。一些研究還表明，甘油三酯、膽固醇等代謝生物標(biāo)志物水平與植物多糖水平呈負(fù)相關(guān)，且植物多糖因相對(duì)無毒、副作用少的優(yōu)勢(shì)，在天然植物通過調(diào)節(jié)腸道菌群減肥方面更受關(guān)注[5-7]。Yuan 等[8]發(fā)現(xiàn)，植物多糖還可以通過降低過氧化物酶體增殖物激活受體γ（Peroxisome Proliferators-Activated Receptors Gamma，PPARγ）、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α（CCAAT/Enhancer Binding Protein Alpha，C/EBPα）、甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c（Sterol Regulatory Element Binding Proteins-1c，SREBP-1c）、脂肪酸合酶（Fatty Acid Synthase，F(xiàn)AS）等脂代謝相關(guān)mRNA 的水平發(fā)揮作用，使3T3-L1 細(xì)胞在分化之后胞內(nèi)脂肪積累受阻。這些表明含有豐富多糖的植物提取物可能有助于防止脂肪積累。

黃精（Rhizomapolygonati）是百合科（Liliaceae）黃精屬（PolygonatumMill.）多年生草本植物，根莖可藥食兩用。黃精屬植物包括71 種，約40 種有藥用記錄[9]。黃精主要生長在北溫帶，并在中國、日本和韓國廣泛食用。藥用黃精有3 種[10]，其中多花黃精（俗稱“姜形黃精”）含有豐富的多糖、皂苷、黃酮類、生物堿、木質(zhì)素、凝集素等功能成分，尤其是多糖，具有潛在的治療作用[11-18]。已有研究證明，黃精中的多糖成分能夠控制能量和脂質(zhì)代謝，減小脂肪細(xì)胞直徑和脂滴，具有抗肥胖作用[19]。因此預(yù)計(jì)多花黃精提取物可能具有抑制3T3-L1 細(xì)胞脂肪積累的作用。然而，多花黃精提取物抑制脂肪積累這方面研究較少，仍有待探索。

因此本文中自制多花黃精生品乙醇提取物（RPE）、多花黃精九蒸九制品乙醇提取物（PPE）、多花黃精生品多糖（CPP），并購買市售九蒸九制多花黃精多糖（PP），通過體外培養(yǎng)3T3-L1 細(xì)胞，檢測(cè)了四種提取物處理后3T3-L1 細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化程度、胞內(nèi)脂質(zhì)水平以及脂代謝關(guān)鍵基因表達(dá)水平的改變，研究探討多花黃精提取物對(duì)3T3-L1細(xì)胞分化和脂質(zhì)積累的作用及機(jī)制。此外，比較了自制多花黃精乙醇提取物、多花黃精生品多糖和市售九蒸九制多花黃精多糖的預(yù)防效果和相關(guān)活性成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，為多花黃精系列食品在肥胖及相關(guān)疾病防治的效果提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

多花黃精（PolygonatumcyrtonemaHua）生品采自浙江省寧波市寧?？h；九蒸九制品購自湖南省婁底市新化縣頤樸源黃精科技有限公司；市售多花黃精九蒸九制品多糖（PP）來自上海源葉生物科技有限公司。

3T3-L1 前脂肪細(xì)胞，中科院上海細(xì)胞庫；胰島素（Insulin，INS），Solarbio 公司；3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（3-Isobutyl-1-Methylxanthine，IBMX）、地塞米松（Dexamethasone，DEX），Sigma-Aldrich 公司；TG試劑盒，南京建成生物工程研究所；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、纖維素酶（50 U/g）、木瓜蛋白酶（≥200 U/g）、MTT，上海源葉生物科技有限公司；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，上海麥克林生物科技有限公司；薯蕷皂苷元、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，杭州金百奧生物科技有限公司；胎牛血清，四季青公司；1%青霉素/鏈霉素溶液（100 U/mL）、DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶，Biosharp 公司；RNAiso Plus、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、TB Green Premix Ex TaqTMⅡ，TaKaRa 公司；引物序列，根據(jù)GenBank 提供的小鼠PPARγ、C/EBPα、LPL、SREBP-1c、FABP4、CPT-1 和β-actin 基因mRNA 的CDS 序列，于NCBI 網(wǎng)站自行設(shè)計(jì)上下游引物（表1），交由北京擎科生物有限公司合成。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2 儀器與設(shè)備

Eon 酶標(biāo)儀，BioTek 公司；BD FACSVerse 流式細(xì)胞儀，碧迪公司；CP-ST200A CO2培養(yǎng)箱，長沙長錦科技有限公司；SW-CJ-2F 超凈工作臺(tái)，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；CKX41GF 倒置顯微鏡，Olympus 公司；RE-52AAA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D(III)循環(huán)水式真空泵，杭州瑞佳精密科學(xué)儀器有限公司；DK-S24 恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；萬能粉碎機(jī)，溫嶺市林大機(jī)械有限公司；FE20實(shí)驗(yàn)室pH 計(jì)，METTLER TOLEDO（上海）有限公司；Centrifuge 5423 R 冷凍離心機(jī)，Eppendorf 公司；FD-1C-50 冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；Long Gene A200 梯度熱循環(huán)儀，杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；Nanodrop 2000 微量核酸蛋白分析儀，Thermo Fisher Scientific 公司；QuantStudio3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀，Life Technologies ABI 公司。

1.3 方法

1.3.1 提取物制備

預(yù)處理：新鮮根莖樣品用水沖洗后烘干（干燥前后質(zhì)量差小于0.000 3 g），用植物萬能粉碎機(jī)制粉。

RPE 的制備：多花黃精生品粉末按料液比1:5（g/mL）加入φ=70%乙醇，25 ℃浸泡3 d 后紗布過濾，濾液濃縮凍干，-18 ℃冰箱保存。

PPE 的制備：多花黃精九蒸九制品粉末同RPE 步驟。

CPP 的制備參考苑璐等[20]的方法并改進(jìn)：稱取10 g 多花黃精生品粉末，按料液比1:10（g/mL）加入石油醚100 mL，用索氏法85 ℃提取2 h，抽提后將殘留石油醚揮干。轉(zhuǎn)移濾渣，按料液比1:10（g/mL）加入φ=80%乙醇，80 ℃水浴回流2 h，紗布過濾，105 ℃烘干濾渣備用。向脫脂多花黃精粉中加入活化好的復(fù)合酶（酶活力比值為纖維素酶:木瓜蛋白酶=3:7），用磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH 值至4.5，在45 ℃恒溫振蕩器中酶解120 min。提取結(jié)束后迅速升溫，沸水浴回流2 h，趁熱過濾。濾液蒸發(fā)濃縮至10 mL，再加入40 mL 無水乙醇。攪拌均勻后4 ℃靜置24 h，離心10 min，沉淀按φ=95%乙醇-無水乙醇-丙酮-無水乙醚順序洗滌，冷凍干燥。

樣品藥物制備：將各凍干粉按生藥量50 000 μg/mL溶解于蒸餾水中，在超凈臺(tái)中過0.22 μm 濾膜，配置成母液置于4 ℃保存，工作時(shí)再完全培養(yǎng)基稀釋。

1.3.2 提取物中功能成分的測(cè)定

多糖參照2020 版《中國藥典》一部，采用硫酸蒽酮法?？傇碥諈⒖荚疯吹萚20,21]的方法測(cè)定OD560nm，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算?？傸S酮根據(jù)何蘭香等[22]的方法并稍加修改，采用鋁鹽顯色法?？偡硬捎酶Ａ?酚法，參照焦劼等[23,24]的步驟，并稍作修改。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)

將50 mL 胎牛血清和5 mL 青霉素/鏈霉素溶液（100 U/mL）加入500 mL Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium（DMEM）高糖培養(yǎng)基制備完整培養(yǎng)基。將細(xì)胞復(fù)蘇后移入25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，保持8～10 mL 體積，在37 ℃和φ=5% CO2環(huán)境培養(yǎng)。

1.3.4 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞存活率

吸走舊培養(yǎng)基，換成配制好的給藥培養(yǎng)基。每種藥物設(shè)置9 個(gè)藥物質(zhì)量濃度組，含有不同質(zhì)量濃度RPE（10、50、100、500、1 000、5 000、8 000、10 000、12 000 μg/mL），PPE（10、50、100、500、1 000、4 000、5 000、8 000、10 000 μg/mL），CPP（10、50、100、500、800、1 000、1 500、2 000、3 000 μg/mL）和PP（10、30、50、100、500、800、1 000、1 500、2 000 μg/mL），一個(gè)溶劑對(duì)照組以及一個(gè)細(xì)胞對(duì)照組，每個(gè)處理組設(shè)置6 個(gè)平行。培養(yǎng)24、48、72 h 后，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)吸棄原培養(yǎng)液，換含MTT（終質(zhì)量濃度0.5 mg/mL）的培養(yǎng)基。4 h 后將培養(yǎng)板上液體不碰底地吸走，添加150 μL 二甲基亞砜，搖床震蕩，待紫色晶體完全溶解，測(cè)定OD570nm。計(jì)算經(jīng)藥物處理24、48、72 h 的細(xì)胞相對(duì)活力和半抑制濃度（Semi-Inhibitory Concentration，IC50）。

1.3.5 細(xì)胞周期檢測(cè)

將3T3-L1前脂肪細(xì)胞以每孔2×105個(gè)密度接種到6 孔板中培養(yǎng)24 h 貼壁，換含RPE、PPE、CPP 和PP（終質(zhì)量濃度分別為50、500、1 000 μg/mL）的新培養(yǎng)基，并設(shè)置對(duì)照組。24 h 后每孔加入m=0.25%胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，輕柔吹打，轉(zhuǎn)入1.5 mL 離心管，4 ℃ 1 200 r/min 離心5 min。每個(gè)離心管棄上清后加PBS 重懸，同樣條件下離心，再加500 μL PBS，細(xì)胞輕輕吹散，調(diào)整細(xì)胞濃度每毫升1×106個(gè)，重復(fù)離心。去上清，離心管搭在渦旋器上震蕩，同時(shí)滴加-20 ℃預(yù)冷的φ=70%冰乙醇，4 ℃固定24 h。4 ℃ 3 000 r/min 離心5 min，去上清，加入1 mL 4 ℃ PBS 重懸，4 ℃3 000 r/min 離心5 min，去上清，輕彈管底使細(xì)胞散開。錫箔紙包住離心管，避光加入500 μL PI 染料，37 ℃避光水浴30 min，上機(jī)。

1.3.6 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

按1.3.4 接種細(xì)胞，24 h 后換含RPE（終質(zhì)量濃度分別為95、190、380 μg/mL）、PPE（終質(zhì)量濃度分別為95、190、380 μg/mL）、CPP（終質(zhì)量濃度分別為95、190、380 μg/mL）、PP（終質(zhì)量濃度分別為25、50、100 μg/mL）的新培養(yǎng)基，并設(shè)置對(duì)照組。24 h后每孔加入無EDTA的m=0.25%的胰蛋白酶消化收集細(xì)胞。4 ℃ PBS 重懸，1 200 r/min 離心5 min，重復(fù)2次。去上清，加入結(jié)合型緩沖液，調(diào)整細(xì)胞濃度每毫升5×106個(gè)。取100 μL 于新1.5 mL 離心管，包錫箔紙，加5 μL Annexin-V-FITC 染液混勻，避光5 min 后加5 μL PI 染液，最后加400 μL PBS?？瞻坠苋?duì)照組細(xì)胞懸液；單染管取380 μg/mL PPE 組細(xì)胞懸液分兩份單染?；靹蚝笊蠙C(jī)，計(jì)算凋亡率。

1.3.7 細(xì)胞分化和油紅O 染色

按1.3.4 接種細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞鋪滿瓶底后換液，繼續(xù)培養(yǎng)2 d 達(dá)到接觸抑制。換含10 μg/mL INS、0.5 mmol/L IBMX、1 μmol/L DEX 的分化劑I，同時(shí)加入RPE、PPE、CPP、PP，質(zhì)量濃度同1.3.6，并設(shè)置細(xì)胞對(duì)照組分別培養(yǎng)48 h。更換只含INS 的分化劑II培養(yǎng)48 h，再更換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，隔天換液一次，每次換液重新加入多花黃精提取物，至第12 天約90%以上的脂滴明顯，即為培養(yǎng)分化成熟。細(xì)胞誘導(dǎo)分化完成后小心吸盡上層液體，用預(yù)熱PBS小心漂洗3 次，每次1 mL。加入m=4%多聚甲醛，37 ℃固定0.5 h。棄去液體，PBS 漂洗3 次，控制時(shí)間加1 mLφ=60%異丙醇30 s 后除去，PBS 清洗，將孔板置于37 ℃至孔底干燥。避光加1 mL 預(yù)熱油紅O，避光靜置30 min后棄染液，PBS 清洗兩次。異丙醇漂洗、脫色15 s 棄去，重蒸水漂洗2 次，隨后加入500 μL 蘇木素染色4 min，水洗。保留最后一次液體，顯微鏡觀察，拍照。棄去液體，每孔加1 mL 異丙醇，低速搖晃至胞內(nèi)脂滴溶解，充分吹打，混勻后的異丙醇吸入到96 孔板，檢測(cè)OD510nm，計(jì)算相對(duì)脂滴體積分?jǐn)?shù)。

1.3.8 細(xì)胞甘油三酯含量測(cè)定

各藥物干預(yù)細(xì)胞分化成熟后，取出放冰袋上操作。吸去培養(yǎng)液，用預(yù)冷PBS 溫和洗三次，每孔加200 μL放射免疫沉淀法緩沖液（Radioimmunoprecipitation Assay Buffer，RIPA 裂解液），含1 mmol/L 苯甲基磺酰氟（Phenylmethanesulfonyl Fluoride，PMSF），室溫裂解10 min，刮下細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到離心管，振蕩，插入碎冰裂解30 min。4 ℃ 12 000 r/min 離心5 min 得到上清液，按TG 試劑盒操作。

1.3.9 熒光定量PCR

用RNAiso Plus 提取細(xì)胞總RNA。用Nanodrop 2000 儀器分析RNA 純度及濃度，A260/280 在1.8～2.1可用。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說明書，先去除基因組DNA，再進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。按TaKaRa TB Green Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒操作qRT-PCR 反應(yīng)。各引物序列詳見表1，β-Actin 為內(nèi)參基因。

1.3.10 數(shù)據(jù)分析

采用IBM SPSS 20.0 軟件（IBM Corp.Armonk，NY，USA）統(tǒng)計(jì)分析，用Graphpad Prism 7.0 軟件（Graphpad Software，San Diego，USA）作圖。所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示。根據(jù)單因素方差（ANOVA）檢驗(yàn)，分析實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組之間的顯著性差異，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 多花黃精提取物的得率及功能性成分含量的比較

用70%乙醇提取RPE、PPE 和用復(fù)合酶提取CPP得到提取物占原料的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為53.35%、53.30%和14.02%。表2 四種提取物主要功能成分在含量上各不相同。其中多糖在原料中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在CPP 中73.33%是最高的，皂苷在PPE 中13.63%最高，黃酮在PPE 中5.37 mg/g 最高，總酚在PP 中47.65 mg/g最高。兩種多花黃精生品提取物RPE、CPP 中的多糖組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)要明顯高于兩種九蒸九制品提取物PPE和PP，但總皂苷更低。另外，PPE、PP 中的總黃酮、總酚酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)也高于RPE 和CPP。

表2 多花黃精各提取物中總多糖、總皂苷、總黃酮、總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的比較(，n=3)Table 2 Comparison of Polygonatum cyrtonema Hua extract yield,total polysaccharides,total saponins,total flavonoids,and total phenols

表2 多花黃精各提取物中總多糖、總皂苷、總黃酮、總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的比較(，n=3)Table 2 Comparison of Polygonatum cyrtonema Hua extract yield,total polysaccharides,total saponins,total flavonoids,and total phenols

注：數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示（n=3）。根據(jù)Duncan 檢驗(yàn)，同列右肩不同的小寫字母表示具有顯著差異（P＜0.05）；RPE 為多花黃精生品乙醇提取物，PPE 為九蒸九制品乙醇提取物，CPP 為多花黃精多糖，PP 為市售多花黃精九蒸九制品多糖。

多花黃精的藥理作用與其主要的多糖、皂苷、黃酮、多酚等活性成分密切相關(guān)[25-28]。生黃精在炮制過程中，多糖減少可能是由于黏液質(zhì)消失水解，出現(xiàn)糖異構(gòu)化，單糖成分變化，半乳糖含量升高，葡萄糖、甘露糖降低，β-1,4-Galp 出現(xiàn)，β-1,4-Manp 增加[29,30]。黏液質(zhì)水解可顯著減少引起黃精刺激性的物質(zhì)，從而降低毒性，而多糖分解成小分子糖類，易被機(jī)體吸收，薯蕷皂苷元、黃酮等有效功能性成分增加，可達(dá)增效目的[31]。Wang 等[32]發(fā)現(xiàn)黃精的九制品比生品具有更顯著的“益氣活血，補(bǔ)脾、腎、肝”的作用。因此，多花黃精九蒸九制品乙醇提取物和九蒸九制品多糖中的多糖低但可能得到了更多的有效成分，作用更佳。

2.2 多花黃精提取物對(duì)3T3-L1 前脂肪細(xì)胞增殖的影響

如圖1、2 所示，RPE、PPE、CPP 和PP 能夠以劑量關(guān)系和時(shí)間關(guān)系的方式抑制3T3-L1 前脂肪細(xì)胞的活力。如表3 所示，處理24、48 和72 h 后，各提取物對(duì)3T3-L1 前脂肪細(xì)胞增殖的半抑制質(zhì)量濃度（IC50）均呈下降趨勢(shì)，RPE、PPE、CPP、PP 分別從8 334.00、7 450.00、866.80、1 406.00 μg/mL 降到7 829.00、2 617.00、798.40、1 062.00 μg/mL。且IC50順序?yàn)镽PE＞PPE＞PP＞CPP。幾項(xiàng)研究表明，多花黃精提取物抑制各種代謝疾病細(xì)胞增殖，包括HepG2 細(xì)胞、3T3-L1 細(xì)胞、C2C12 肌管細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞[33-37]。RPE、PPE 對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞的細(xì)胞毒性較小，且500 μg/mL 以內(nèi)的醇提取物和100 μg/mL 以內(nèi)的黃精多糖對(duì)3T3-L1 脂肪細(xì)胞的存活率基本沒有影響，這對(duì)于后續(xù)的體外抗肥胖實(shí)驗(yàn)是安全質(zhì)量濃度。

圖1 多花黃精提取物對(duì)3T3-L1 前脂肪細(xì)胞的増殖抑制作用（劑量效應(yīng)）Fig.1 Inhibitory effect of Polygonatum cyrtonema Hua extract on proliferation of 3T3-L1 preadipocytes (Dose effect)

圖2 多花黃精提取物對(duì)3T3-L1 前脂肪細(xì)胞的増殖抑制作用（時(shí)間效應(yīng)）Fig.2 Inhibitory effect of Polygonatum cyrtonema Hua extract on proliferation of 3T3-L1 preadipocytes (Time effect)

表3 多花黃精各提取物作用下3T3-L1 細(xì)胞的IC50Table 3 IC50 of 3T3-L1 cells under the action of Polygonatum cyrtonema Hua extract

2.3 多花黃精提取物對(duì)3T3-L1 前脂肪細(xì)胞周期的影響

3T3-L1 細(xì)胞經(jīng)四種多花黃精提取物處理24 h 后，細(xì)胞周期變化結(jié)果如圖3 所示，與對(duì)照組相比，隨著RPE和PP 處理質(zhì)量濃度的增加（50、500、1 000 μg/mL），3T3-L1前脂肪細(xì)胞進(jìn)入S期的比例逐漸減少，進(jìn)入G2/M期的比例無明顯變化，G0/G1 期有所上升。當(dāng)PPE 和CPP組質(zhì)量濃度為50 μg/mL 時(shí)，部分細(xì)胞被阻滯在G0/G1期，阻礙向S 期進(jìn)程。PPE 組和CPP 組未看出明顯的劑量關(guān)系，這可能是由于當(dāng)質(zhì)量濃度大于PPE 應(yīng)選用的最大劑量380 μg/mL 和CPP 應(yīng)選用的100 μg/mL 后，細(xì)胞本身活力明顯下降，狀態(tài)變差，導(dǎo)致G0/G1 期比例大幅下降而G2/M 期比例大幅上升。由上推測(cè)多花黃精提取物抑制前脂肪細(xì)胞增殖可能與G0/G1 期阻滯有關(guān)。

圖3 多花黃精提取物對(duì)3T3-L1 前脂肪細(xì)胞周期的影響Fig.3 Effect of Polygonatum cyrtonema Hua extract on 3T3-L1 preadipocyte cycle

2.4 多花黃精提取物誘導(dǎo)3T3-L1 前脂肪細(xì)胞的凋亡

如圖4 所示，四種多花黃精提取物均能有效促進(jìn)前脂肪細(xì)胞凋亡。當(dāng)以RPE 處理3T3-L1 前脂肪細(xì)胞后，早期凋亡率、晚期凋亡率及總體凋亡率均隨質(zhì)量濃度上升而顯著升高（P＜0.05），促早期凋亡作用呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。當(dāng)以PPE 處理后，早期凋亡率、晚期凋亡率以及總體凋亡率先上升后降低，在95 μg/mL 凋亡最明顯（早期凋亡率9.12%，晚期凋亡率19.00%，總體凋亡率28.12%）。當(dāng)以CPP 處理后，早期凋亡率以及總體凋亡率總體上升，晚期凋亡率呈先上升后平穩(wěn)趨勢(shì)。當(dāng)以PP 處理后，早期凋亡率、晚期凋亡率及總體凋亡率先上升后降低，在50 μg/mL凋亡最明顯（早期凋亡率15.50%，晚期凋亡率13.40%，總體凋亡率28.90%）。其他研究表明，400 μg/mL 劑量黃精多糖可誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞凋亡，阻滯G1 期細(xì)胞周期[35]，可反映本文多花黃精提取物將部分細(xì)胞阻滯在G0/G1 期延緩3T3-L1 前脂肪細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)早期凋亡。

圖4 多花黃精提取物誘導(dǎo)3T3-L1 前脂肪細(xì)胞凋亡的作用Fig.4 Effect of Polygonatum cyrtonema Hua extract on 3T3-L1 preadipocyte apoptosis

2.5 多花黃精提取物對(duì)3T3-L1 前脂肪細(xì)胞分化的影響

IBMX、地塞米松和胰島素聯(lián)用的情況下可誘導(dǎo)3T3-L1 前脂肪細(xì)胞分化[38]。如圖5 所示，誘導(dǎo)分化后，對(duì)照組細(xì)胞出現(xiàn)較大的紅色斑點(diǎn)，說明細(xì)胞內(nèi)存在較大的脂質(zhì)沉積。加入多花黃精提取物后，3T3-L1 前脂肪細(xì)胞分化受到不同程度的抑制，細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積減少，脂滴變小，油紅O 染色較空白組弱。抑制程度隨質(zhì)量濃度升高而加重。對(duì)細(xì)胞中總脂質(zhì)的體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行了分析，如表4 所示。在四種多花黃精提取物的干預(yù)下，成熟脂肪細(xì)胞內(nèi)的脂滴體積分?jǐn)?shù)均減少，脂滴沉積情況均得到顯著改善，且高劑量組的PP（100 μg/mL）和PPE（380 μg/mL）脂滴體積分?jǐn)?shù)降低的程度最大（28.39%、37.97%），效果最好。體內(nèi)研究表明黃精乙醇提取物改善了肥胖小鼠的代謝特征[33,34]。在本研究中可以發(fā)現(xiàn)，多花黃精提取物能通過促進(jìn)成熟脂肪細(xì)胞脂解降低脂滴的體積分?jǐn)?shù)，抑制3T3-L1 細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞的分化，其中多花黃精九蒸九制品提取物PPE 的干預(yù)效果比生品提取物RPE、CPP 的效果更好。

圖5 多花黃精提取物對(duì)3T3-L1 前脂肪細(xì)胞分化的影響(×400)Fig.5 Effect of Polygonatum cyrtonema Hua extract on 3T3-L1 preadipocyte differentiation (×400)

表4 多花黃精提取物對(duì)3T3-L1 前脂肪細(xì)胞分化的影響Table 4 Effect of Polygonatum cyrtonema Hua extract on TG content in mature adipocytes

2.6 多花黃精提取物對(duì)成熟脂肪細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量的影響

如表5 所示，與對(duì)照組相比，四種多花黃精提取物能促進(jìn)成熟脂肪細(xì)胞的脂解，RPE、CPP 組體現(xiàn)出了明顯的劑量關(guān)系，但PPE、PP 組沒有明顯的劑量關(guān)系。此外，多花黃精九蒸九制品提取物高劑量組的甘油三酯下降程度比生品提取物組更大，計(jì)算得380 μg/mL PPE 組細(xì)胞TG 含量下降了89.07%，是同樣質(zhì)量濃度RPE 組（79.19%）的1.12 倍，是100 μg/mL CPP 組（85.28%）的1.04 倍。本實(shí)驗(yàn)證明了多花黃精提取物能通過促進(jìn)成熟脂肪細(xì)胞脂解降低甘油三酯的含量，從而達(dá)到減小脂肪細(xì)胞體積的效果，有效阻止3T3-L1細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞的分化。相似地，其他研究在添加50 μg/mL 黃精提取物的分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)前脂肪細(xì)胞14 d，發(fā)現(xiàn)顯著減少了細(xì)胞內(nèi)脂肪的積累，降低脂肪含量至對(duì)照組的80%以下[34]。

表5 多花黃精提取物對(duì)成熟脂肪細(xì)胞內(nèi)TG 含量的影響Table 5 Effect of Polygonatum cyrtonema Hua extract on TG content in mature adipocytes

2.7 多花黃精提取物對(duì)3T3-L1 細(xì)胞分化相關(guān)基因mRNA 的影響

脂肪生成是指成纖維細(xì)胞由前脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化為脂肪細(xì)胞，脂肪細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)和脂質(zhì)的聚集是在3T3-L1 成纖維細(xì)胞系中被化學(xué)誘導(dǎo)的。前脂肪細(xì)胞的分化受一系列因素調(diào)控，其中C/EBPα和PPARγ作為核心轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞分化和增殖，在分化過程中協(xié)同促進(jìn)脂肪生成。C/EBPβ在分化早期表達(dá)，并刺激C/EBPα和PPARγ的轉(zhuǎn)錄。脂代謝酶如FABP4、LPL 和FAS 的表達(dá)在脂肪形成過程中受到PPARγ和C/EBPα的調(diào)控。分化抗原簇 36（Cluster of Differentiation，CD36）與PPARγ正相關(guān)，CD36 基因沉默導(dǎo)致PPARγ表達(dá)降低可能導(dǎo)致脂肪細(xì)胞分化受損，這與PPARγ下調(diào)損害前脂肪細(xì)胞分化的發(fā)現(xiàn)一致[39,40]。甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c（SREBP-1c）是一種輔助脂肪形成的調(diào)節(jié)因子，參與脂質(zhì)代謝并調(diào)節(jié)FAS[41]。從總體趨勢(shì)看，雖然各質(zhì)量濃度RPE 組（95、190、380 μg/mL）PPARγmRNA 表達(dá)水平與對(duì)照組無顯著差異，但RPE、PPE、CPP、PP 均不同程度下調(diào)了3T3-L1 脂肪細(xì)胞PPARγ和C/EBPαmRNA 表達(dá)。但是，在完全分化的脂肪細(xì)胞中，RPE、PPE、CPP和PP 對(duì)SREBP-1c mRNA 表達(dá)無影響。之前的研究發(fā)現(xiàn)，黃精中多糖成分的12 周干預(yù)顯著抑制了PPARγ和C/EBPα的mRNA 水平[42]，與實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合。LPL是脂肪分化過程中的關(guān)鍵因素之一，也在脂肪生成的早期階段表達(dá)，并且在成熟脂肪細(xì)胞中達(dá)到穩(wěn)定水平。LPL 在脂質(zhì)代謝中也起著重要作用，LPL 催化脂蛋白衍生的三?；视偷乃?，并允許脂肪酸在脂肪組織中積累，脂肪酸在脂肪細(xì)胞中重新酯化以形成儲(chǔ)存的三酰基甘油[43,44]。如圖6d 所示，經(jīng)RPE、PPE、PP處理后，3T3-L1 小鼠前脂肪細(xì)胞LPL mRNA 表達(dá)水平下降，隨劑量增加而降低，而經(jīng)CPP 處理后LPL mRNA 表達(dá)水平未見下降趨勢(shì)。這些控制脂肪細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄物是關(guān)鍵的早期脂肪形成調(diào)節(jié)因子，表明RPE、PPE、CPP、PP 均能有效的抑制PPARγ，C/EBPα這兩種轉(zhuǎn)錄因子，RPE、PPE、PP 抑制LPL mRNA 水平，從而阻滯早期脂肪細(xì)胞分化。

圖6 多花黃精提取物對(duì)分化后細(xì)胞相關(guān)基因mRNA 表達(dá)水平的影響Fig.6 Effect of Polygonatum cyrtonema Hua extract on mRNA expression of related genes in differentiated adipocytes

脂肪形成遵循一個(gè)多階段的過程，根據(jù)脂肪形成水平的不同來組織轉(zhuǎn)錄物和蛋白質(zhì)的表達(dá)模式，在不同階段相互協(xié)調(diào)。脂肪酸結(jié)合蛋白4（Fatty Acid Binding Protein 4，F(xiàn)ABP4），也稱aP2，是脂質(zhì)結(jié)合蛋白超家族一員，多在脂肪細(xì)胞中表達(dá)，可調(diào)節(jié)脂肪酸的氧化，并在生命體內(nèi)脂肪酸攝取、運(yùn)輸及氧化還原過程具有關(guān)鍵的調(diào)控作用。FABP4 決定了脂肪細(xì)胞后期的分化階段，相關(guān)脂肪酸和甘油三酯的生物合成受到SREBP、PPARγ和C/EBPα的調(diào)控。研究顯示，F(xiàn)ABP4能夠與長鏈脂肪酸緊密結(jié)合，促進(jìn)脂肪酸的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，影響脂質(zhì)在脂肪細(xì)胞中的蓄積及脂質(zhì)代謝[45]。FABP4表達(dá)降低可顯著阻斷甘油三酯的從頭合成和脂肪細(xì)胞分化[46,47]。FABP4 mRNA 表達(dá)水平的結(jié)果如圖6e 所示。隨著成熟脂肪細(xì)胞處理劑量的增加，RPE、PPE、CPP 和PP 組FABP4 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量均隨劑量增大而逐漸降低，由此抑制分化后期脂肪細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)產(chǎn)生與累積。

脂肪形成不僅影響脂質(zhì)代謝，而且影響葡萄糖和蛋白質(zhì)代謝。研究表明，脂肪形成的機(jī)制與多種信號(hào)通路有關(guān)，包括一磷酸腺苷活化蛋白激酶（Adenosine Monophosphate-Activated Protein Kinase，AMPK）通路、胰島素信號(hào)通路、PPAR 調(diào)控、葡萄糖通路等，這些信號(hào)通路可作治療肥胖和代謝性疾病的藥物靶點(diǎn)的主要來源[48]。例如AMPK 的激活還通過改變參與脂肪酸代謝的酶，如肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-1（CPT-1）的表達(dá)來調(diào)節(jié)脂肪酸的生物合成和氧化，CPT-1 是調(diào)節(jié)?；o酶A 向β氧化的主要限速酶，增加CPT-1 的活性或表達(dá)將促進(jìn)3T3-L1 分化后細(xì)胞中積累的脂肪酸的氧化，這有利于減輕脂肪的積累[49]。肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-1（CPT-1）mRNA 表達(dá)結(jié)果見圖6f。經(jīng)多花黃精提取物處理后，3T3-L1 前脂肪細(xì)胞中CPT-1 mRNA表達(dá)增加，表明多花黃精提取物促進(jìn)CPT-1 的活性，可能是通過激活A(yù)MPK介導(dǎo)減少脂質(zhì)積累。Yang等[50]研究也表明，黃精灌胃NAFLD 大鼠14 周后，CPT-1的mRNA 表達(dá)顯著上調(diào)。

糖苷、類黃酮、生物堿和萜類是增強(qiáng)抗脂肪活性的植物化學(xué)物質(zhì)的主要組成部分，含有這些活性成分的藥食兩用植物可通過各種代謝和細(xì)胞靶點(diǎn)對(duì)肥胖起有益作用。已有研究證明一些天然產(chǎn)物可以在3T3-L1模型中通過調(diào)節(jié)脂代謝相關(guān)因子產(chǎn)生抗肥胖活性。例如，Lamichhane 等[51]研究證實(shí)枸杞子乙醇提取物、正己烷餾分、乙酸乙酯餾分和三種分離的化合物均顯示出抗脂肪形成活性，下調(diào)了關(guān)鍵的脂肪形成標(biāo)志物PPARγ、SREBP-1、FABP4、aP2、LPL 和瘦素。Nallamuthu 等[52]比較評(píng)價(jià)了甘藍(lán)、羅勒和辣木葉醇提取物對(duì)3T3-L1 前脂肪細(xì)胞的抗脂肪形成作用及其脂肪酶抑制特性，發(fā)現(xiàn)羅勒在抑制胞內(nèi)甘油三酯的積累作用最強(qiáng)，下調(diào)了脂肪生成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子（PPARγ、C/EPBα和FAS 酶），并調(diào)節(jié)了瘦素和脂聯(lián)素的釋放曲線，具有顯著抗脂肪生成活性以及脂肪酶抑制特性。目前多花黃精提取物體外干預(yù)3T3-L1 前脂肪細(xì)胞和分化后脂肪細(xì)胞的研究未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)研究表明，多花黃精提取物可通過抑制促脂肪生成基因PPARγ、C/EBPα、FABP4 和LPL 的表達(dá)和促進(jìn)脂肪酸氧化相關(guān)基因CPT-1 的mRNA 表達(dá)來抑制3T3-L1 細(xì)胞的分化，減少脂質(zhì)積聚。

3 結(jié)論

綜上，多花黃精提取物富含多糖、皂苷、黃酮、多酚等關(guān)鍵活性成分，九蒸九制品提取物中的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低，但其他活性成分增多。多花黃精提取物能夠以劑量和時(shí)間依賴性方式抑制3T3-L1 前體脂肪細(xì)胞的增殖，將部分3T3-L1 前脂肪細(xì)胞阻滯在G0/G1期，延緩3T3-L1 前脂肪細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程，并具有促進(jìn)該細(xì)胞凋亡的作用。多花黃精提取物可通過減少胞內(nèi)甘油三酯的含量、抑制促脂肪生成蛋白（PPARγ、C/EBPα、FABP4 和LPL）的表達(dá)來抑制3T3-L1 細(xì)胞的分化，并且它還能夠通過促進(jìn)脂肪酸氧化相關(guān)基因CPT-1的mRNA表達(dá)來減少分化的3T3-L1細(xì)胞中的脂質(zhì)積聚。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果上看，RPE 主要是抑制C/EBPα、LPL 和FABP4 的mRNA 基因的表達(dá)，PPE主要是抑制C/EBPα、LPL 和FABP4 的mRNA 的表達(dá)量并促進(jìn)CPT-1 的mRNA 基因表達(dá)，CPP 主要抑制了PPARγ的mRNA 基因的表達(dá)。本研究為黃精向食品的進(jìn)一步研發(fā)提供理論依據(jù)，推動(dòng)黃精產(chǎn)業(yè)向高新技術(shù)、新領(lǐng)域、深加工方向發(fā)展，對(duì)中國黃精食品的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義和作用。未來黃精提取物在體內(nèi)的抗肥胖作用，如對(duì)肥胖相關(guān)腸道菌群的調(diào)節(jié)以及產(chǎn)熱相關(guān)基因和蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)，還需進(jìn)一步驗(yàn)證。