蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在不同物種乳摻假檢測(cè)中的應(yīng)用

潘俊宇，王斌，范榮波，王義堅(jiān)，楊永新，韓榮偉，于忠娜

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海都學(xué)院，山東煙臺(tái) 265200）（2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266109）（3.萊西市畜牧獸醫(yī)服務(wù)中心，山東青島 266600）（4.青島荷斯坦奶牛養(yǎng)殖有限公司，山東青島 266600）

據(jù)統(tǒng)計(jì)，乳品摻假在食品摻假中排名第二[1]，僅次于食用油脂摻假。常見的摻假方式是向生乳或乳制品中摻入尿素、三聚氰胺、水、脂肪、蛋白質(zhì)等物質(zhì)（見表1），以達(dá)到掩蔽乳品質(zhì)量問題或謀取暴利的目的。近年來，隨著國(guó)家相關(guān)部門監(jiān)管力度的加強(qiáng)，乳品摻假現(xiàn)象已經(jīng)得到了極大的遏制，但仍存在向乳及乳制品中摻入動(dòng)、植物蛋白，或向量少價(jià)高的特種奶畜乳中摻假廉價(jià)牛乳的現(xiàn)象。乳品摻假不僅會(huì)給消費(fèi)者造成經(jīng)濟(jì)損失，甚至?xí)鹣M(fèi)者的不良反應(yīng)[2]。

表1 常見乳品摻假及相應(yīng)檢測(cè)方法Table 1 Common dairy adulteration and corresponding detection methods

目前有關(guān)乳品真實(shí)性鑒定的研究方法主要有傅里葉變換紅外光譜、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）、聚丙烯酰胺凝膠電泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis，PAGE）和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）等。Sevval 等[3]建立了傅里葉變換紅外光譜檢測(cè)水牛乳和山羊乳中摻假牛乳的檢測(cè)方法，檢測(cè)限為5%；Rodrigues 等[4]運(yùn)用PCR 技術(shù)成功檢測(cè)出了散裝羊乳中摻假牛乳。Pesic 等[5]運(yùn)用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（Native-PAGE）方法檢測(cè)出羊乳中存在牛乳成分；Song 等[6]以β-酪蛋白為標(biāo)記物開發(fā)了ELISA 試劑盒，成功檢測(cè)了薩能奶山羊乳和關(guān)中奶山羊乳中摻假的牛乳；Francesca 等[7]運(yùn)用毛細(xì)管電泳法，以α-乳白蛋白為標(biāo)記物檢測(cè)出了水牛乳中的牛乳；PCR/ELISA 方法雖有快速、靈敏的特點(diǎn)，但多數(shù)用于定性或半定量分析，且容易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，凝膠電泳和毛細(xì)管電泳方法也存在著步驟復(fù)雜、上樣量低、重現(xiàn)性差等缺點(diǎn)[8]。

蛋白質(zhì)組學(xué)已廣泛用于特色畜乳摻假鑒定及標(biāo)記物的挖掘[9]。蛋白組學(xué)技術(shù)由Marc Wikinszai 于上世紀(jì)九十年代初期提出，該技術(shù)可對(duì)同一來源（如來源于一個(gè)細(xì)胞、一種分泌物或一個(gè)細(xì)胞器）的蛋白質(zhì)進(jìn)行的系統(tǒng)分離、鑒定和表征[10]。在質(zhì)譜等高通量技術(shù)的支持下，收集了大量的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)以建立生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)。通過結(jié)合生物信息學(xué)工具，可實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)來源的鑒定，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的功能、分布等。

蛋白質(zhì)組學(xué)在摻假中的應(yīng)用常與質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合以達(dá)到檢測(cè)的目的，樣品在離子源的作用下形成氣態(tài)肽段離子進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)?；|(zhì)輔助激光解吸（Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization，MALDI）與飛行時(shí)間（Time of Flight，TOF）質(zhì)量分析器聯(lián)用或是電噴霧電離（Electro Spray Ionization，ESI）與液相色譜聯(lián)用是兩種常用的蛋白質(zhì)鑒定方法。前者要求基質(zhì)和樣品點(diǎn)在樣品靶位上形成共結(jié)晶后再進(jìn)行激光解吸，不能直接銜接質(zhì)譜，而選擇ESI 時(shí)，樣品經(jīng)過液相色譜分離后通過離子源處理直接銜接質(zhì)譜進(jìn)行分析。離子源ESI 提供了高度的儀器靈活性，不僅可以很容易地與液相色譜系統(tǒng)結(jié)合，而且還可以與各種質(zhì)量分析儀結(jié)合，但是易受到電解質(zhì)鹽的抑制作用，對(duì)除鹽的要求較高[11,12]。而MALDI 具有產(chǎn)生肽和蛋白質(zhì)的單電荷離子的優(yōu)勢(shì)，但時(shí)間效率較低[13]。

作者查閱了近年來蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在乳品摻假鑒定中的相關(guān)研究報(bào)道，按照其在不同物種乳摻假檢測(cè)中的應(yīng)用展開綜述，以期對(duì)乳品摻假檢測(cè)方法的選擇提供更多的思路，見表1。

1 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在牛乳摻假檢測(cè)中的應(yīng)用

1.1 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在奶牛乳摻假檢測(cè)中的應(yīng)用

牛乳是人們生活中十分重要的營(yíng)養(yǎng)來源，其摻假外源蛋白類型包括向牛乳中摻入乳粉、水解植物蛋白等。Yang 等[24]運(yùn)用納米液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（nano-High-Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectroscopy，nano HPLC-MS/MS）對(duì)液態(tài)乳中摻假的大豆、豌豆、水解小麥、水解水稻蛋白進(jìn)行了檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)采用高速離心方式能夠去除牛奶的高豐度蛋白，以便放大分析摻入的水解植物蛋白，并從UniProt 網(wǎng)站獲得鑒定信息，通過主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）確定標(biāo)記物分別為β-伴大豆球蛋白的α亞基、伴豌豆球蛋白、α-淀粉酶抑制劑CM3，最終得出檢出限分別為0.5%、2%、0.5%和4%。Lu 等[25]成功通過超高效液相色譜四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（Ultra-Performance Liquid Chromatography -Quadrupole Time-of-flight -Mass Spectrometry，UPLC-QTOF-MS）檢測(cè)出生乳中摻假的大豆蛋白和豌豆蛋白，檢出限為1%，標(biāo)記物分別是β-伴大豆球蛋白和豌豆球蛋白。Hao 等[26]使用超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜（Ultra-Performance Liquid Chromatography Tandem Triple Quadrupole-Mass Spectrometry，UPLC-TQMS）分析了46 種經(jīng)胰蛋白酶消化而得的肽，從UniProt 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的鑒定信息可知，αS1-酪蛋白肽段FFVAPFPEVFGK、κ-酪蛋白肽段 YIPIQYVLSR、αS2-酪蛋白肽段FALPQYLK、β-乳球蛋白肽段IDALNENK 和β-酪蛋白肽段VLPVPQK 能夠作為物種特異肽段來定量蛋白質(zhì)。通過同位素稀釋UPLC-TQMS 來分析上述物種特異性肽，可定量牛乳中的主要蛋白質(zhì)，經(jīng)驗(yàn)證每100 g 牛乳蛋白中含有70.26 g 上述種類蛋白，根據(jù)這個(gè)閾值，可檢測(cè)生乳中摻雜的大豆蛋白，檢出限為10%。Hao 等[26]的方法檢出限顯著高于Yang 等[24]和Lu 等[25]的方法，這是由于在他的方法中只對(duì)幾種主要蛋白質(zhì)進(jìn)行了定量。

Du 等[27]對(duì)牛全脂液態(tài)乳中加入乳粉進(jìn)行了檢測(cè)，利用超高效液相色譜四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（Ultra-Performance Liquid Chromatography-Quadrupole Time-of-Flight-Mass Spectrometry，UPLC-QTOF-MS）分析完整蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)，利用MathWorks 軟件獲得肽信息，最終確定檢出限為0.5%，α-乳白蛋白糖基化多肽肽段FLDDDLTDDIMCVK為標(biāo)記物。同樣是對(duì)牛乳中摻假乳粉的檢測(cè)，Calvano 等[28]使用基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOFMS）分析方法，確定檢出限為1%，標(biāo)記物為αS1-酪蛋白的去磷酸化肽段YKVPQLEIVPNSAEER、αS1-酪蛋白的糖基化肽段TKVIPYVR、β-酪蛋白的乳糖基化肽段VLPVPQKAVPYPQR、β-乳球蛋白的乳糖基化肽段LIVTQTMKGLDIQK、β-乳球蛋白的乳糖基化肽段ALKALPMHIR和β-乳球蛋白的乳糖基化肽段TPEVDDEALEKFDK。這是由于乳粉在加工過程中的熱處理造成美拉德反應(yīng)，使得酪蛋白和乳清蛋白發(fā)生修飾[29,30]，故可使用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法對(duì)奶粉中蛋白質(zhì)進(jìn)行表征。Calvano 等[28]還對(duì)樣品二維凝膠電泳的差異斑點(diǎn)進(jìn)行了質(zhì)譜分析，這是常用的差異蛋白驗(yàn)證方法。

從上述試驗(yàn)結(jié)果來看，不同的研究生物標(biāo)記物和檢測(cè)限存在差異，這可能是因?yàn)樗康牡鞍追秶煌瑢?dǎo)致確定了不同生物標(biāo)記物，或是依據(jù)不同的生物標(biāo)記物進(jìn)行真實(shí)性鑒定，但是都可以獲得較低的檢出限和明確的生物標(biāo)記物，足以說明蛋白組學(xué)在牛乳真實(shí)性鑒定方面的可行性。

1.2 蛋白質(zhì)組學(xué)在牦牛乳摻假檢測(cè)中的應(yīng)用

牦牛乳中脂肪、蛋白質(zhì)、乳糖、維生素和必需氨基酸含量高，脂肪酸種類多，膽固醇含量較低，具有一定的抗氧化能力[31]。Yang 等[32]分析了包含牦牛在內(nèi)的多個(gè)物種的乳脂肪球膜（Milk Fat Globule Membrane，MFGM）組成，通過iTRAQ 技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定和定量，揭示了MFGM 蛋白的物種差異，可用于蛋白質(zhì)印跡法或ELISA 法檢測(cè)物種乳摻假。此外，Yang 等[33]基于iTRAQ 技術(shù)分析了包括牦牛乳在內(nèi)的五種乳的乳清蛋白質(zhì)組，五種乳的乳清蛋白的組學(xué)模型存在顯著差異，其中牦牛的物種特異蛋白為一種未命名蛋白。陳雨湉等[34]基于靶向蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，采用超高效液相色譜串聯(lián)高分辨質(zhì)譜/串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜（UPLC-OrbitrapMS，UPLC-TQMS），得出了包括牦牛乳在內(nèi)的八種物種乳的特征肽段，其中牦牛的特征肽段為β-乳球蛋白的LSFNPTQLEGQCHI。將牦牛乳β-乳球蛋白的肽序列與牛乳比較，發(fā)現(xiàn)只存在一處差異，存在于特征肽段內(nèi)部（圖1）。特征多肽分析不僅能用于多物種乳蛋白的鑒別，還可滿足高溫滅菌乳或乳粉等加工奶制品的檢測(cè)。

圖1 牦牛乳與牛乳的αS1-酪蛋白肽序列對(duì)比Fig.1 Alignment of αS1-casein in yak and bovine milk

1.3 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在水牛乳摻假檢測(cè)中的應(yīng)用

水牛乳的蛋白質(zhì)、脂肪、乳糖、總固形物、維生素和礦物質(zhì)含量較高，這改善了水牛乳的口感，可用于制造奶酪[35]。等電聚焦（Isoelectric Focusing，IEF）是常用的檢測(cè)水牛乳真實(shí)性的方法，但容易出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果，通過蛋白質(zhì)組學(xué)程序替代/結(jié)合這一方法可以有效避免[36]。Russo 等[37]運(yùn)用MALDI-TOF MS 檢測(cè)水牛乳清干酪中摻入的牛乳清干酪。以β-乳球蛋白的149-162 肽段為分子標(biāo)記物，最終得到的檢出限為5%。Sassi 等[38]也運(yùn)用相同的技術(shù)對(duì)水牛、綿羊、山羊和牛的液態(tài)乳進(jìn)行了分析，并確定了各自的物種特異性肽段，同時(shí)還對(duì)超高溫滅菌乳、巴氏殺菌乳、生乳和奶粉進(jìn)行生物標(biāo)記物的表征。Bernardi 等[39]使用高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜（High-Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，HPLC-MS/MS）對(duì)水牛乳酪中摻入的羊奶和牛奶進(jìn)行檢測(cè)。從MASCOT 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的鑒定信息可知山羊乳和牛乳的特征肽段分別為αS1-酪蛋白的肽段YLGYLEQLLK和αS2-酪蛋白的肽段AMKPWIQPK。這些特定肽段已成功應(yīng)用于不同成分的奶酪的鑒定，在物種乳摻假的檢測(cè)中表現(xiàn)出高度的特異性。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)奶酪的老化和生產(chǎn)方式并不會(huì)影響物種特異性肽的鑒定。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在羊乳摻假檢測(cè)中的應(yīng)用

羊乳可以改善輕微的消化疾病和預(yù)防嬰兒過敏性疾病[40]，對(duì)于患有牛乳引起的胃腸道過敏和慢性腸病的嬰兒，可選擇羊乳作為替代，目前常見的羊乳摻假是向羊乳及乳粉中摻入液態(tài)牛乳或乳粉。Girolamo 等[41]使用MALDI-TOFMS 對(duì)山羊乳中摻假的牛乳進(jìn)行分析，利用FlexControl 軟件分析質(zhì)譜，通過層次聚類分析（Hierarchical Cluster Analysis，HCA）和主成分分析，在0.5%的水平上能夠直觀的區(qū)分出山羊乳中是否摻入液態(tài)生牛乳。Jamnik 等[42]采用二維凝膠電泳結(jié)合MALDI-TOFMS 的鑒定方法，發(fā)現(xiàn)以κ-酪蛋白為標(biāo)記物，能夠鑒定山羊乳中摻入的牛乳，檢出限為2%。這項(xiàng)研究中山羊和奶牛乳的κ-酪蛋白在二維凝膠上位置不同，利用MALDI-TOFMS 對(duì)不同位置條帶進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定。Jamnik 等[42]和Girolamo 等[41]運(yùn)用了相同的分析方法，但是前者的研究中檢測(cè)限略高，這可能是由于后者并未進(jìn)行生物標(biāo)記物的確定而直接分析差異性。

Nardiello 等[43]通過納米液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（Nano-Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，nanoLC-MS/MS）方法，以來自β-乳球蛋白的肽段LSFNPTQLEEQCHI和αS1-酪蛋白的肽段HQGLPQEVLNENLLR為生物標(biāo)記物，能夠檢測(cè)出羊乳中摻入的牛乳，該方法檢出限為1%，通過羊乳與牛乳的αS1-酪蛋白肽序列對(duì)比和羊乳與牛乳的β-乳球蛋白肽序列對(duì)比，可以發(fā)現(xiàn)在肽段序列上有明顯差異，但只有肽段 LSFNPTQLEEQCHI 和肽段HQGLPQEVLNENLLR被測(cè)定為信號(hào)肽段（圖2、圖3）。

圖3 羊乳與牛乳的αS1-酪蛋白肽序列對(duì)比Fig.3 Alignment of αS1-casein in bovine and goat milk

Chen 等[44]分別使用（Ultra-Performance Liquid Chromatography-Time-of-Flight-Mass Spectrometry，UPLC-TOF-MS）和UPLC-TQMS 對(duì)山羊乳粉中摻假的牛乳進(jìn)行定性和定量，確定了生物標(biāo)記物β-乳球蛋白的肽段LSFNPTQLEEQCHI可作為山羊乳中摻假牛乳的生物標(biāo)記物，這可能是因?yàn)椴捎玫姆治黾夹g(shù)不同。Camerini 等[45]基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，LC-MS/MS）的分析方法可得出和Chen 的研究中相同的特異性肽段LSFNPTQLEEQCHI，檢出限更低，為0.5%，這可能是因?yàn)镃amerini 選擇的二級(jí)質(zhì)譜精確度更高。

3 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在駝乳摻假檢測(cè)中的應(yīng)用

駝乳具有很高的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值，產(chǎn)量低、價(jià)格高，經(jīng)常發(fā)生駝乳中摻入羊乳、牛乳的情況[46,47]。Katharina 等[48]利用二維凝膠電泳結(jié)合MALDI-TOFMS 對(duì)生乳樣品進(jìn)行分析，并運(yùn)用蛋白組學(xué)鑒定軟件MASCOT 進(jìn)行搜索。結(jié)果顯示駝乳與牛、山羊、水牛、馬乳的蛋白質(zhì)組成存在顯著差異。駱駝乳中不含β-乳球蛋白，而牛、水牛、山羊和馬乳中β-乳球蛋白是主要的乳清蛋白，α-乳清蛋白是駱駝乳中含量最豐富的乳清蛋白，具有123 個(gè)殘基，分子量為14.6 ku，與其他動(dòng)物乳相比差異較大，因此，牛和山羊奶中的α-乳清蛋白和β-乳球蛋白在凝膠上的分布差異可作為檢測(cè)駱駝奶摻入?；蛏窖蚰痰囊罁?jù)。Yang等[49]運(yùn)用同樣的方法，得到了相似的結(jié)果。在摻入2%（V/V）牛乳或羊乳的駝乳中，通過比較二維凝膠電泳的圖像差異并利用MALDI-TOFMS 進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)羊乳或牛乳的α-乳清蛋白、β-乳球蛋白和αS1-酪蛋白的電泳斑點(diǎn)能夠作為標(biāo)記物來鑒定駝乳真實(shí)性。在摻入0.5%（V/V）牛乳或羊乳的駝乳中，羊乳或牛乳的β-乳球蛋白可作為鑒定駝乳真實(shí)性的依據(jù)。Yang 和Katharina 的研究均是采用二維凝膠電泳圖像直觀的區(qū)分不同乳，將特定蛋白斑點(diǎn)膠內(nèi)消化后進(jìn)行質(zhì)譜分析，雖然這種方法會(huì)高度依賴電泳結(jié)果，根據(jù)實(shí)驗(yàn)人員操作熟練程度的差異會(huì)出現(xiàn)誤差。但兩項(xiàng)研究所確定的標(biāo)記物相同，證明了這種鑒定方法的可行性。此外，Yang 等[33]還利用相對(duì)和絕對(duì)定量同位素標(biāo)記（Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation，iTRAQ）技術(shù)定量分析了駝乳、牛乳、牦牛乳、水牛乳和山羊乳的乳清蛋白。駱駝乳的乳清酸性蛋白和醌氧化還原酶，山羊奶的雙糖鏈蛋白聚糖以及牛奶的伯胺氧化酶可作為表征蛋白，這為鑒定駝乳真實(shí)性提供了支持。駝乳不含β-乳球蛋白，因此，以β-乳球蛋白為摻假標(biāo)記物可通過電泳條帶鑒定方法便捷的鑒定駝乳中是否摻入?；蜓虻绕渌锓N乳。

4 蛋白質(zhì)組學(xué)在驢乳摻假檢測(cè)中的應(yīng)用

驢乳口感良好，溶菌酶含量高，對(duì)病原微生物具有選擇性作用。驢乳產(chǎn)量低，售價(jià)較高，但目前利用蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定驢乳真實(shí)性的研究較少[50,51]。Girolamo 等[41]利用MALDI-TOFMS 分析了摻假了牛乳的驢乳樣品，并通過PCA 和HCA 直觀的區(qū)分了摻假樣品和未摻假樣品，得到0.5%的檢出限。Zhang等[52]比較了牛乳和驢乳的乳清蛋白質(zhì)組，結(jié)果顯示牛乳和驢乳種異表達(dá)的乳清蛋白數(shù)量多達(dá)365 個(gè)，這一結(jié)果可作為潛在的摻假標(biāo)記物。

5 結(jié)語(yǔ)

蛋白質(zhì)組學(xué)通過物種蛋白差異性可成功確定物種乳的真實(shí)性。本文依據(jù)乳的種類分類，對(duì)蛋白組學(xué)在乳品摻假檢測(cè)和乳中特異性生物標(biāo)記物方面的的研究進(jìn)行了綜述，包括分析手段、檢出限、生物標(biāo)記物等，可以看出蛋白質(zhì)組學(xué)可以在較低水平上鑒定外源性蛋白，不同物種乳生物標(biāo)記物的確定可以作為乳品真實(shí)性鑒定的依據(jù)。但不管是真實(shí)性鑒定還是結(jié)果驗(yàn)證，蛋白質(zhì)組學(xué)在這方面的應(yīng)用高度依賴質(zhì)譜分析，但乳品中蛋白質(zhì)的復(fù)雜性和分析技術(shù)的局限性不利于蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)乳品中低豐度蛋白的檢測(cè)。近年來質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)展飛快，有利于更快、更詳盡地對(duì)蛋白質(zhì)組進(jìn)行表征，也預(yù)示著蛋白質(zhì)組學(xué)在乳品摻假檢測(cè)方面的廣闊前景。高通量、精確、快速和便攜將成為蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)應(yīng)用的主要發(fā)展方向，以圖像來展示差異的方法將會(huì)受到更多的青睞。