自制鼻咽解毒膠囊含藥血清對鼻咽癌細(xì)胞系5-8F存活、凋亡的影響及其機制

韓蜜，龍遠(yuǎn)雄

1 湖南省腫瘤醫(yī)院藥學(xué)部，長沙 410013；2 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院科研部

鼻咽癌是常見的頭頸部惡性腫瘤［1-2］，與EB 病毒感染有關(guān)，EB 病毒在人群中的感染陽性率高達(dá)90%以上［3］。目前，臨床治療鼻咽癌的方法主要為放療、化療、同步放化療等［4］，但放化療也存在弊端，如敏感性降低、放化療后的不良反應(yīng)大等。鼻咽解毒膠囊以往稱連芩解毒方，其制劑名稱為鼻咽解毒膠囊，是湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院的自制制劑，由黃連、黃芩、黃芪、甘草、白花蛇舌草五種中藥制成，具有清熱解毒、扶正培本之功效［5］?，F(xiàn)代實驗室研究表明，黃連素能夠通過mTOR、MAPK 等靶點和信號通路共同作用于鼻咽癌［6］。黃芩苷能抑制鼻咽癌CNE-2 細(xì)胞的增殖，并通過TGF-β1/ERK1/2 信號通路的抑制作用PCNA、Survivin 的表達(dá)［7］。張樹聰?shù)龋?］發(fā)現(xiàn)，黃芪中的黃芪多糖能通過抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）和Akt/ERK 信號通路抑制CNE-1 細(xì)胞的遷移和侵襲。文獻(xiàn)［9］報道，白花蛇舌草多糖對鼻咽癌裸鼠腫瘤有抑制作用。王曉暉［10］認(rèn)為，甘草中的甘草甜素可通過同源框基因D 簇反義RNA1 和微小RNA-30a-3p 對鼻咽癌細(xì)胞產(chǎn)生影響。課題組前期圍繞本方的制劑開發(fā)、質(zhì)量控制，抗菌、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、鼻咽癌防治等進(jìn)行了研究［11-13］。本研究在前期的研究基礎(chǔ)上，對鼻咽解毒膠囊方藥中的藥效成分與鼻咽癌進(jìn)行了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)其活性成分通過PI3K-Akt、MAPK 等信號通路調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞并發(fā)揮治療作用［14］。5-8F 細(xì)胞是鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系SUNE-1 亞株，為人高轉(zhuǎn)移鼻咽癌細(xì)胞系，來自鼻咽癌患者，進(jìn)行鼻咽癌研究時多選擇高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株［15］。2022 年6—12 月，我們觀察了鼻咽解毒膠囊對5-8F 細(xì)胞存活、凋亡的影響，并探討其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系及主要試劑、儀器 人鼻咽癌5-8F 細(xì)胞珠購自于賽百慷（上海），由本實驗室傳代培養(yǎng)。胎牛血清（Gibco，批號10099141），RPMI 1640 培養(yǎng)基（Sigma，批號R8758），胰酶消化液（abiowell，批號AWC0232），雙抗（青鏈霉素）（碧云天，批號SV30010），CCK-8（abiowell，批號AWC0114a），細(xì)胞凍存液（abiowell，批號AWC0229），Annexin V-APC/PI 雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基，批號KGA1030-1007），BCA 蛋白定量試劑盒（中國Abiowell，批號AWB0104），廣譜彩虹預(yù)染蛋白Marker（Abiowell，批號AWB0236），Tris-HCl 緩沖液（中國Abiowell，批號AWB0073），Western 轉(zhuǎn)膜緩沖液（中國Abiowell，批號AWB0211），蛋白酶抑制劑混合液（AWB0005，批號AWB0005），DNA 凝膠加樣緩沖液（中國Abiowell，批號AWR0103），mRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（中國北京康為世紀(jì)，批號CW2569），UltraSYBR Mixture（中國北京康為世紀(jì)，批號CW2601），DM2000 Plus DNA Marker（中國北京康為世紀(jì)，批號CW0632）。DH-160I 直熱式二氧化碳培養(yǎng)箱（上海三藤儀器），SL02 低速離心機（知信儀器），MB-530多功能酶標(biāo)分析儀（匯松），H1650R 臺式冷凍離心機（中國湖南湘儀），BioPrep-24 生物樣品均質(zhì)儀（生物樣品均質(zhì)儀），ChemiScope6100 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（中國勤翔），熒光定量RCP 儀（美國Thermo），DYY-2C 電泳儀（中國北京六一），DYCP-31DN 水平瓊脂糖電泳槽（中國北京六一）。

1.2 鼻咽解毒膠囊供試品、含藥血清制備 鼻咽解毒膠囊供試品：取鼻咽解毒膠囊內(nèi)容物適量，加入蒸餾水配制成濃度為2 g/mL［5］。鼻咽解毒膠囊含藥血清：將20只SD大鼠（雌雄各半，體質(zhì)量為180～220 g）隨機分成空白組和給藥組，每組10只。給藥組給予15.309 g/kg 的鼻咽解毒膠囊灌胃，空白組按大鼠體重給予等體積的0.9%生理鹽水灌胃，大鼠每日灌胃2 次，連續(xù)給藥7 d，并于末次灌胃后1 h 給予深度麻醉，抽取下腹主動脈血5 mL，室溫靜置1～2 h，以2 000 r/min的速度離心15 min，取血清，將同組血清進(jìn)行混合，用0.22 μm 微孔濾膜濾過除菌，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 5-8F 細(xì)胞培養(yǎng) 從液氮罐中取出5-8F 細(xì)胞經(jīng)過37 ℃水浴快速解凍，10% FBS + 1%雙抗的RPMI 1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)，37 ℃環(huán)境下，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中按1∶3 比例進(jìn)行傳代，再次液氮罐中凍存，顯微鏡下計數(shù)等流程完成細(xì)胞培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實驗。

1.4 5-8F 細(xì)胞分組、鼻咽解毒膠囊含藥血清干預(yù)及細(xì)胞存活率測算 采用CCK-8 法。取經(jīng)“1.3”培養(yǎng)的對數(shù)生長期5-8F 細(xì)胞，并分為8 組，5%、10%、15%、20%、25%、30% 含藥血清組分別加入5%、10%、15%、20%、25%、30%的鼻咽解毒膠囊含藥血清，20%空白血清組加入20%不含藥物血清，對照組為細(xì)胞正常培養(yǎng)，不加血清。以每孔含5×103個5-8F 細(xì)胞的懸液，種于96 孔板內(nèi)，各組均設(shè)3 復(fù)孔。于37 ℃、5%CO2條件中培養(yǎng)，培養(yǎng)貼壁后棄原培養(yǎng)基，加入以上分組的培養(yǎng)基。于24、48 h 后，棄原培養(yǎng)液，每孔加入含有CCK-8 的培養(yǎng)基100 μL，以5%CO2繼續(xù)孵育4 h，無細(xì)胞的RPMI 1640 培養(yǎng)液空白孔調(diào)零，選擇450 nm 波長處用酶標(biāo)儀檢測吸光度（OD）值，根據(jù)酶標(biāo)儀的檢測結(jié)果計算不同組分細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率=［（實驗組OD 值—Black 組OD值）/（對照組OD值—Black組OD值）］×100%。不含細(xì)胞的RPMI 1640 培養(yǎng)基組為Black 組，用于調(diào)零；將不同濃度的含藥血清組和20%空白血清組設(shè)為實驗組。

1.5 5-8F 細(xì)胞分組、鼻咽解毒膠囊含藥血清干預(yù)及細(xì)胞凋亡率測算 采用流式細(xì)胞術(shù)。細(xì)胞培養(yǎng)同上，取對數(shù)生長期5-8F 細(xì)胞，以1×105個/皿的密度鋪板在中皿里，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行分組處理，陰性組細(xì)胞正常培養(yǎng)24 h，低劑量組加入5%含藥血清處理24 h，中劑量組加入20%含藥血清處理24 h，高劑量組加入30%含藥血清處理24 h。以上處理的細(xì)胞用胰酶消化收集，用PBS 洗滌3 次，每次以2 000 r/min速度離心5 min，收集細(xì)胞，依次加入500 μL的Binding buffer 懸浮細(xì)胞、Annexin V-APC、LPropidium Iodide，充分混勻，室溫條件下避光反應(yīng)10 min。在1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測，該實驗每個樣本重復(fù)3次，取平均值。

1.6 5-8F 細(xì)胞分組、鼻咽解毒膠囊含藥血清干預(yù)及細(xì)胞K-RAS、RAF mRNA 相對表達(dá)量測算 采用RT-qPCR 法。細(xì)胞培養(yǎng)同上，取對數(shù)生長期5-8F 細(xì)胞，以1×105個/皿的密度鋪板在中皿里，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行分組處理，對照組細(xì)胞正常培養(yǎng)24 h，低劑量組加入5%含藥血清處理24 h，中劑量組加入20%含藥血清處理24 h，高劑量組加入30%含藥血清處理24 h；向保存在培養(yǎng)皿中的5-8F細(xì)胞加入TRIzol，吹打混勻后移至離心管，室溫條件下裂解，加入三氯甲烷，振蕩，離心。取上層液相，轉(zhuǎn)移到新的RNase-Free離心管中，加入異丙醇溶液，離心，棄上清，加入乙醇用以洗滌及沉淀，離心，棄上清。加入無酶水溶解沉淀，于260 nm 與280 nm 波長處用紫外分光光度計測定OD260、OD280，根據(jù)兩個值的比值計算其濃度跟純度，按試劑盒說明書將 RNA 反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。PCR反應(yīng)條件：95 ℃條件下10 min→95 ℃條件下15 s→60 ℃條件下30 s為一次循環(huán)，共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，引物由北京擎科生物科技股份有限公司提供，引物分別為K-RAS（5'-ACAGCCTCAAGATCATCAGC-3'，5'-GGTCATGAGTCCTTCCACGAT-3'，149 bp）、RAF（5'-TCACGCTGGAGTGGTTCT-3'，5'-CAATACGATGCCATAGGAGT-3'，135 bp）、GAPDH（5'-ACA GCCTCAAGATCATCAGC-3'，5'-GGTCATGAGTCCT TCCACGAT-3'，104 bp）。通過2-ΔΔCt反映各樣品相對于對照組樣品目的基因表達(dá)水平的比值。

1.7 5-8F 細(xì)胞分組、鼻咽解毒膠囊含藥血清干預(yù)及細(xì)胞K-RAS、RAF、MEK、p-ERK1/2 蛋白相對表達(dá)量測算 采用Western blot 法。細(xì)胞培養(yǎng)同上，取對數(shù)生長期5-8F 細(xì)胞，以1×105個/皿的密度鋪板在中皿里，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行分組處理，對照組細(xì)胞正常培養(yǎng)24 h，低劑量組加入5%含藥血清處理24 h，中劑量組加入20%含藥血清處理24 h，高劑量組加入30%含藥血清處理24 h；5-8F 細(xì)胞經(jīng)不同組藥物處理24 h 后，用預(yù)冷PBS 洗滌細(xì)胞，加入RIPA 裂解液裂解細(xì)胞，超聲破碎，離心，配置BCA 工作液測定蛋白濃度，設(shè)定75 V 電泳觀察溴酚藍(lán)電泳至膠底部時，轉(zhuǎn)膜，用脫脂奶粉配制5%封閉液，封閉，育一抗二抗，凝膠成像系統(tǒng)成像，并分析各蛋白條帶的相對灰度值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS26.0 統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以xˉ±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較方差齊性用LSD法檢驗，若方差不齊采用Dunnet T3 法檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組不同時點細(xì)胞存活率比較 不同時點細(xì)胞存活率比較見表1。

表1 各組不同時點細(xì)胞存活率比較（%，± s）

表1 各組不同時點細(xì)胞存活率比較（%，± s）

注：與對照組比較，*P<0.05；與20%空白血清組比較，#P<0.05；與同組24 h比較，△P<0.05。

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2.2 各組細(xì)胞凋亡率比較 低劑量組、中劑量組、高劑量組、陰性組細(xì)胞凋亡率分別為5.63% ± 0.26%、8.83% ± 0.14%、15.08% ± 0.33%、0.60% ± 0.11%，低劑量組、中劑量組、高劑量組分別與陰性組比較，低、中、高劑量組兩兩比較，P均<0.05。

2.3 各組細(xì)胞K-RAS、RAF mRNA 相對表達(dá)量比較 細(xì)胞K-RAS、RAF mRNA相對表達(dá)量比較見表2。

表2 各組細(xì)胞K-RAS、RAF mRNA相對表達(dá)量比較（± s）

表2 各組細(xì)胞K-RAS、RAF mRNA相對表達(dá)量比較（± s）

注：與陰性組比較，*P<0.05；與低劑量組比較，#P<0.05；與中劑量組比較，△P<0.05。

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2.4 各組細(xì)胞K-RAS、RAF、MEK、p-ERK1/2 蛋白相對表達(dá)量比較 細(xì)胞K-RAS、RAF、MEK、p-ERK1/2蛋白相對表達(dá)量比較見表3。

表3 各組細(xì)胞K-RAS、RAF、MEK、p-ERK1/2蛋白相對表達(dá)量比較（± s）

表3 各組細(xì)胞K-RAS、RAF、MEK、p-ERK1/2蛋白相對表達(dá)量比較（± s）

注：與陰性組比較，*P<0.05；與低劑量組比較，#P<0.05；與中劑量組比較，△P<0.05。

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3 討論

鼻咽癌是起源于黏膜上皮的惡性腫瘤，解剖部位特殊［16］，呈浸潤生長，早期病灶小，癥狀不典型，易發(fā)生頸部淋巴結(jié)甚至遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［17-18］。臨床上針對鼻咽癌的治療主要采用放射療法，而對于中晚期、復(fù)發(fā)性及轉(zhuǎn)移性鼻咽癌，則采用誘導(dǎo)化療加同期放化療［19］。鼻咽癌患者治療后易復(fù)發(fā)，如何減輕放化療的不良反應(yīng)及降低復(fù)發(fā)率是目前臨床上亟需解決的問題。中醫(yī)藥是在辯證論治原則的指導(dǎo)之下，對疾病進(jìn)行多角度、多層次、多方面的分析，最終達(dá)到祛病的目的。中醫(yī)在臨床中多采用復(fù)方的形式存在，根據(jù)疾病的證候與藥物的特性，以“君臣佐使”的方式讓藥物發(fā)揮最大的協(xié)同療效，傳統(tǒng)中藥治療鼻咽癌的同時，可減輕放化療的不良反應(yīng)，調(diào)節(jié)患者氣虛體質(zhì)，起到增效減毒的作用。中藥相對于西藥來說成分復(fù)雜［20］，而腫瘤的生長也是一個多階段復(fù)雜的過程，研究鼻咽癌的分子機制，為鼻咽癌的治療擴展領(lǐng)域成了鼻咽癌防治的關(guān)鍵所在。許多中藥和單體化合物，如黃酮類、生物堿和苯丙烷類等都具有顯著的抗腫瘤作用［21-22］。中藥具有多組分、多靶點的特點，不僅可以抗腫瘤，還可以減少放化療的毒副作用。此外，在腫瘤防治方面，特別是在增強宿主免疫功能和延長患者生存期方面也顯示出獨特的優(yōu)勢［23］。鼻咽解毒膠囊具有清熱解毒、扶正培本之功效，主要用于鼻炎、咽炎和EB 病毒陽性的鼻咽癌高危人群抗病毒治療，在湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床應(yīng)用30 余年，治療鼻咽、咽炎療效顯著，在治療鼻咽癌方面，課題組前期已完成鼻咽解毒膠囊治療鼻咽癌的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接研究，初步證實鼻咽解毒膠囊能抑制鼻咽癌細(xì)胞的生長或促進(jìn)其凋亡的生物有效性。

MAPK 信號通路是一個級聯(lián)磷酸化的過程，核心成員包括MAPKKK、MAPKK、MAPK［24］。RAS 蛋白是廣泛表達(dá)的膜結(jié)合小GTP 酶，其活性形式將與RAF 原癌基因絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)合［25］，RAS是RAS-MAPK 信號通路中的第一個細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)子，是將信號從細(xì)胞表面受體蛋白傳遞到細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)器所介導(dǎo)的物質(zhì)，調(diào)節(jié)包括細(xì)胞生長、分化等許多細(xì)胞過程［26-27］。K-RAS 是RAS 家族中最常見的亞型，通常與疾病侵襲性、預(yù)后不良和對治療反應(yīng)差有關(guān)［28-29］。RAF 蛋白容易被RAS 激活，具有更高的基礎(chǔ)激酶活性。MAPK 家族中研究最為廣泛的是ERK1/ERK2 激酶，在正常細(xì)胞中，酪氨酸激酶受體通過其特異性配體激活，通過MAP 激酶途徑誘導(dǎo)ERK 的磷酸化和核易位，ERK 則是誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和存活基因的轉(zhuǎn)錄因子［30］。MEK1/2 作為易突變蛋白RAS、RAF 的下游蛋白，也可以作為一個靶點［31-32］。MAPK/ERK1/2 信號通路在鼻咽癌細(xì)胞中被高度激活，抑制該通路可誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞凋亡。

本文通過體外實驗研究鼻咽解毒膠囊干預(yù)鼻咽癌5-8F 細(xì)胞的作用，能不同程度地影響細(xì)胞的存活率。CCK-8檢測提示一定濃度的鼻咽解毒膠囊能降低癌細(xì)胞存活率，抑制其生長。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與陰性組比較，鼻咽解毒膠囊含藥血清組的細(xì)胞凋亡率顯著升高。RT-qPCR 法結(jié)果顯示，與陰性組比較，鼻咽解毒膠囊低、中、高劑量組鼻咽癌細(xì)胞中K-RAS、RAF mRNA 相對表達(dá)量均顯著低于陰性組。Western blot 檢測經(jīng)過不同濃度鼻咽解毒膠囊處理24 h 后，MAPK/ERK 信號通路相關(guān)蛋白RAF，KRAS、p-ERK1/2 表達(dá)下調(diào)。說明鼻咽解毒膠囊可以通過抑制MAPK/ERK 信號通路的傳導(dǎo)，從而促進(jìn)5-8F細(xì)胞凋亡。

總之，鼻咽解毒膠囊含藥血清能抑制5-8F 細(xì)胞存活，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且呈劑量依賴性，尤以30%鼻咽解毒膠囊含藥血清劑量為最佳，機制可能與其可抑制MAPK/ERK信號通路有關(guān)。