sPE 患者血清miR-199a-5p、miR-142-3p 表達變化及與產婦血管內皮損傷、圍產兒結局的關系

張麗萍，李霞，謝艷

淮安市婦幼保健院產科，江蘇淮安223002

重度子癇前期（sPE）是子癇前期的嚴重表現，累及多器官損害病變，可引起胎盤—胎兒并發(fā)癥［1］。研究［2］表明，母體外周血管內皮損傷和功能障礙可引起高血壓和多器官損傷，與sPE 病情進展有關。微小核糖核酸（miRNA）被證實可通過靶向信號通路相關基因調控免疫系統(tǒng)、血管生成和滋養(yǎng)層增殖和侵襲，參與PE 的發(fā)病進展［3］。微小核糖核酸-199a-5p（miR-199a-5p）是一種可靶向缺氧誘導因子-1，在妊娠期高血壓和子癇前期患者血清中表達下調［4-5］。miR-142-3p 在sPE 中表達異常，被鑒定為子癇前期相關基因，并被證實可抑制蛋白激酶B（Akt）/內皮型一氧化氮合酶（eNOS）信號通路，促使血管內皮細胞凋亡和損傷［6-7］。上述研究標明，miR-199a-5p、miR-142-3p 表達異?？赡芘csPE 發(fā)病有關，但其與產婦血管內皮損傷和圍產兒結局的關系尚不清楚。2020 年1 月—2022 年12 月，我們觀察了sPE 患者血清miR-199a-5p、miR-142-3p 表達變化，并分析其與產婦血管內皮損傷、圍產兒結局的關系，旨在為圍產兒結局的改善提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2020年1月—2022年12月淮安市婦幼保健院收治的sPE 患者200 例（觀察組），年齡25～40（34.41 ± 5.21）歲，孕次1～4（2.96 ±0.65）次，產次0～2（1.04 ± 0.21）次，孕周22～36（31.21 ± 3.41）周。納入標準：①患者符合《妊娠期高血壓疾病診治指南（2015）》中sPE 的診斷標準［8］，初次確診；②年齡≥18 周歲；③患者或家屬書面知情同意本研究；④單胎妊娠。排除標準：①輕度、中度子癇前期；②胎兒染色體異常；③合并惡性腫瘤、嚴重肝腎疾病、心血管疾病、免疫疾?。虎芗韧邮苓^妊娠期高血壓相關治療或口服可能影響本研究檢測指標的藥物；⑤患有妊娠期肝內膽汁淤積癥、妊娠期糖尿病等并發(fā)癥。另選擇同期健康產檢的孕婦200例（對照組），年齡22～38（34.12 ± 5.62）歲，孕次1～3（2.91 ± 0.58）次，產次0～2（1.02 ± 0.23）次，孕周21～36（31.21 ± 3.41）周。排除妊娠期高血壓、妊娠期糖尿病、胎盤早剝、子癇前期等妊娠期疾病。兩組一般資料無統(tǒng)計學差異，具有可比性（P>0.05）。本研究已經獲得淮安市婦幼保健院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 血清miR-199a-5p、miR-142-3p 檢測 所有入選對象（觀察組患者入組24 h 內，對照組孕婦產檢當日）采集靜脈血3 mL，注入干燥試管，室溫下放置60 min，待血液凝固后取上層液離心（離心參數：3 000 r/min，離心半徑10 cm，離心時間5 min），取上清液，分為三份，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)錂z。采用血清RNA 提取試劑盒（美國賽默飛公司）分離總RNA，Nano Drop One 超微量分光光度計（美國賽默飛公司）測定總RNA 純度，選取A260/280 吸光度值1.8～2.0 的RNA，采用Prime Script?II1st Strand cDNA Synthesis Kit（日本TaKaRa公司）將總RNA 轉錄為cDNA。Step One Plus實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT-PCR）系統(tǒng)（美國賽默飛公司）和TB Green?Advantage?qPCR Premix試劑盒（日本TaKaRa公司）進行實時定量熒光聚合酶連反應（RT-PCR）。引物序列：miR-199a-5p：5'-CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC-3'，5'-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGT-3'；miR-142-3p：5'-GGGTGTAGTGTTTCCTACTT-3'，5'-TTTGGCACTAGCACATT-3'；U6：5′-CGCTTCGGCA GCACATATACTA-3′，5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTC3'。反應體系：TB Green?Advantage?qPCR Premix 2.5 μL，2 μL cDNA 特異引物，RNase-Free ddH2O 21 μL。反應條件：95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，循環(huán)40次。以U6作為內源對照，2-ΔΔCt法計算miR-199a-5p、miR-142-3p。

1.3 血清血管內皮功能相關指標檢測 所有入選對象（觀察組患者入組24 h 內，對照組孕婦產檢當日）采集靜脈血3 mL，注入干燥試管，室溫下放置60 min，待血液凝固后取上層液離心（離心參數：3 000 r/min，離心半徑10 cm，離心時間5 min），取上清液。采用酶聯免疫吸附試驗檢測觀察組和對照組可溶性細胞內皮因子（sEng）、可溶性血管內皮生長因子受體-1（sFlt-1）、內皮素-1（ET-1）、血管內皮生長因子（VEGF），所有操作按試劑盒說明書進行。

1.4 圍產兒不良結局危險因素及保護因素分析 根據圍產兒結局將觀察組分為結局不良組（29例，其中宮內生長受限10 例、胎兒宮內窘迫5 例、早產8例、新生兒窒息4例、新生兒死亡2例）和結局良好組（171 例）。利用本院的病歷系統(tǒng)收集兩組患者的臨床資料，包括年齡、孕次、產次、孕周、sPE 類型（早發(fā)型、晚發(fā)型［8］）、并發(fā)癥（視物模糊、水腫、子癇、心衰、肺水腫、腹水、胸腔積液、胎盤早剝、產后出血）、收縮壓、舒張壓等。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS25.0 統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，采用獨立樣本t檢驗或校正t檢驗；計數資料采用χ2檢驗或校正χ2檢驗；Pearson 相關分析法分析觀察組血清miR-199a-5p、miR-142-3p 表達與血管內皮功能相關指標水平的相關性；多因素Logistic 回歸分析法分析sPE 患者圍產兒結局不良的危險因素及保護因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 觀察組及對照組血清miR-199a-5p、miR-142-3p 表達和血管內皮功能相關指標水平比較 血清miR-199a-5p、miR-142-3p 表達和血管內皮功能相關指標水平比較見表1。

表1 觀察組及對照組血清miR-199a-5p、miR-142-3p表達及血管內皮功能相關指標水平比較（± s）

表1 觀察組及對照組血清miR-199a-5p、miR-142-3p表達及血管內皮功能相關指標水平比較（± s）

注：與對照組比較，*P<0.05。

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2.2 觀察組血清miR-199a-5p、miR-142-3p 表達與血管內皮功能相關指標的關系 觀察組血清miR-199a-5p表達與sEng、sFlt-1、ET-1水平呈負相關（r分別為-0.356、-0.427、-0.396，P均<0.05），與VEGF水平呈正相關（r為0.512，P<0.05）；血清miR-142-3p表達與sEng、sFlt-1、ET-1 水平呈正相關（r分別為0.327、0.411、0.377，P均<0.05），與VEGF 水平呈負相關（r為-0.498，P<0.05）。

2.3 觀察組患者血清miR-199a-5p、miR-142-3p 表達與圍產兒結局的關系 根據圍產兒結局將觀察組分為結局不良組（29例，其中宮內生長受限10例、胎兒宮內窘迫5例、早產8例、新生兒窒息4例、新生兒死亡2例）和結局良好組（171例）。結局不良組年齡（36.12 ± 2.02）歲，孕次（3.02 ± 0.67）次，產次（1.12 ± 0.32）次，孕周（31.92 ± 3.21）周，早發(fā)型sPE 19 例（65.52%）、晚發(fā)型sPE 10 例（34.48%），并發(fā)癥為視物模糊6 例（20.69%）、水腫12 例（41.38%）、子癇7例（24.14%）、心衰4例（13.79%）、肺水腫3 例（1.034%）、腹水5 例（17.24%）、胸腔積液2 例（6.90%）、胎盤早剝9 例（31.03%）、產后出血5 例（17.24%），收縮壓（169.35 ± 5.12）mmHg，舒張壓（116.35 ± 3.24）mmHg，血清miR-199a-5p 相對表達量1.69 ± 0.11，血清miR-142-3p 相對表達量5.02 ± 0.21；結局不良組年齡（34.12 ± 4.92）歲，孕次（2.95 ± 0.68）次，產次（1.03 ± 0.26）次，孕周（31.32 ± 2.94）周，早發(fā)型sPE 46例（26.90%）、晚發(fā)型sPE 125 例（73.10%），并發(fā)癥為視物模糊30（17.54）、水腫31（18.13）、子癇12（7.02）、心衰25（14.62）、肺水腫20（11.70）、腹水32（18.71）、胸腔積液16（9.36）、胎盤早剝17（9.94）、產后出血10（5.85），收縮壓（168.72 ± 4.09）mmHg，舒張壓（115.56 ± 2.95）mmHg，血清miR-199a-5p 相對表達量2.06 ± 0.12，血清miR-142-3p 相對表達量4.24 ±0.53；兩組年齡、早發(fā)型sPE 比例、并發(fā)水腫比例、并發(fā)子癇比例、并發(fā)胎盤早剝比例、并發(fā)產后出血比例、血清miR-142-3p 相對表達量、血清miR-199a-5p相對表達量比較，P均<0.05。以sPE 圍產兒結局為因變量（賦值：0=結局良好，1=結局不良），以年齡、sPE 類型（賦值：0=晚發(fā)型，1=早發(fā)型）、并發(fā)水腫（賦值：0=否，1=是）、并發(fā)子癇（賦值：0=否，1=是）、并發(fā)胎盤早剝（賦值：0=否，1=是）、并發(fā)產后出血（賦值：0=否，1=是）、miR-199a-5p（連續(xù)性變量原值輸入）、miR-142-3p（連續(xù)性變量原值輸入）為自變量，納入多因素Logistic 回歸模型進行分析。結果顯示，早發(fā)型sPE、胎盤早剝、miR-142-3p 高表達是sPE 圍產兒結局不良的危險因素（P均<0.05），miR-199a-5p 高表達是sPE 圍產兒結局不良的保護因素（P<0.05），詳見表2。

表2 sPE患者圍產兒結局不良的Logistic回歸分析結果

3 討論

sPE 是孕產婦圍產期發(fā)病和死亡的主要原因之一，以不同程度的胎盤灌注不良為主要特征［1］。妊娠早期滋養(yǎng)細胞侵襲受損和螺旋動脈重構失敗導致子宮胎盤血流量減少和胎盤應激，觸發(fā)母體外周內皮細胞功能障礙，引起全身性炎癥反應和以母體高血壓為特征的sPE［2］。胎盤早期植入不良或發(fā)育不良促使滋養(yǎng)細胞釋放抗血管生成分子，如sFlt-1、sEng，抗血管生成分子作用于母體血管內皮，刺激局部內皮釋放血栓素、促炎細胞因子和氧化應激代謝物，加重全身內皮損傷。隨著病情進展，導致胎盤早剝、胎兒宮內生長受限等圍產兒不良結局。miRNA是長度約20 nt的非編碼RNA，能特異性靶向并結合mRNA 的3′-UTR 區(qū)抑制mRNA 的翻譯和表達，參與細胞代謝、免疫應答、細胞分化、疾病發(fā)展等多種病理生物學過程。研究［9］顯示，多種miRNA 參與子癇前期的發(fā)病過程。

miR-199a-5p 是血管損傷相關miRNA，在妊娠期高血壓患者中表達異常［10］。本研究顯示，miR-199a-5p 在sPE 患者中表達降低，miR-199a-5p高表達是sPE 患者圍產兒結局不良的保護因素。分析原因：首先，胎盤基底細胞粘附分子（BCAM）在滋養(yǎng)細胞膜上高度表達，激活磷脂酰肌醇-3 激酶調節(jié)亞基6（PIK3R6）/磷酸化轉錄信號轉導子及激活子3（p-STAT3）信號通路，促使滋養(yǎng)細胞增殖、遷移和侵襲，引起胎盤不良和子癇前期樣表型，包括收縮壓升高、蛋白尿、多器官（胎盤、肝臟和腎臟）結構和功能受損以及胎兒生長受限［11-12］。miR-199a-5p可介導BCAM 降解，抑制PIK3R6/p-STAT3 信號通路，抑制滋養(yǎng)細胞增殖、遷移和侵襲，在sPE 中發(fā)揮保護作用機制［13］。其次，miR-199a-5p過表達可下調小窩蛋白1 的表達，降低人腎小球內皮細胞的通透性，緩解蛋白尿含量升高等子癇前期樣表型［14］，進而降低不良圍產兒結局的風險。本研究還顯示，血清miR-199a-5p表達與血清sEng、sFlt-1、ET-1水平呈負相關，與VEGF 水平呈正相關，表明miR-199a-5p 可能參與sPE 血管損傷調控過程，miR-199a-5p 表達升高可能抑制抗血管生成分子合成，促使促血管生長因子表達，保護血管內皮功能，抑制sPE 的發(fā)展，從而降低圍產兒結局不良的發(fā)生率。

miR-142-3p 可調控滋養(yǎng)層細胞增殖、遷移和侵襲，在妊娠期高血壓患者中高表達，并且與子癇前期進展有關［15］。研究［16］發(fā)現，miR-142-3p 在子癇前期組織中表達上調，通過靶向抑制調控叉頭框蛋白M1表達，抑制滋養(yǎng)細胞增殖，參與子癇前期發(fā)病過程。本研究顯示，miR-142-3p 在sPE 患者中表達升高，miR-142-3p 高表達是sPE 患者圍產兒結局不良的危險因素，提示miR-142-3p 過表達可能促使子癇前期病情進展和不良圍產結局發(fā)生。分析可能的機制為：滋養(yǎng)細胞侵襲不足與子癇前期的發(fā)展有關，miR-142-3p 過表達抑制轉化生長因子-β1/Smad3 信號通路，降低基質金屬蛋白酶（MMP）-2 和MMP-9 的活性，繼而抑制滋養(yǎng)細胞的侵襲和遷移，促使子癇前期病情進展［15］。本研究還顯示，血清miR-142-3p 表達與血清sEng、sFlt-1、ET-1 水平呈正相關，與VEGF 水平呈負相關，表明miR-142-3p 可能通過調控血管損傷參與sPE 發(fā)病和進展過程。文獻［17-18］報道，miR-142-3p 可通過微體進入內皮細胞，靶向上調BCLAF1，抑制內皮細胞增殖，促使內皮細胞凋亡，miR-142-3p 作為bcl-2 相關轉錄因子1 的下游基因，在其刺激下表達上調并誘導內皮細胞異常增殖，導致內皮細胞功能障礙。推測miR-142-3p 過表達可能抑制內皮細胞增殖，促使內皮細胞凋亡，導致血管內皮功能障礙和損傷，進而促使sPE 的發(fā)展，導致圍產兒結局不良的發(fā)生。

本研究多因素Logistic 回歸分析還顯示，早發(fā)型sPE、胎盤早剝與sPE圍產兒結局不良有關。分析原因為sPE 早期發(fā)病可能癥狀并不顯著，導致就醫(yī)延遲，由于病情進展迅速，易引起不良結局，胎盤早剝屬于妊娠晚期嚴重并發(fā)癥，可引起子宮持續(xù)收縮和胎兒心率改變，缺血缺氧，導致不良圍產兒結局。劉穎等［19］也指出，早發(fā)型sPE 新生兒Apgar 評分≤7 分的發(fā)生率高于晚發(fā)型sPE，圍產兒存活率低于晚發(fā)型sPE。廖琪等［20］認為，sPE 胎盤早剝易引起嚴重的孕產婦及圍產兒結局不良。

總之，sPE 患者血清miR-199a-5p 表達降低、miR-142-3p 表達升高，與血管內皮損傷有關，miR-142-3p 高表達是sPE 圍產兒結局不良的危險因素，miR-199a-5p 高表達是sPE 圍產兒結局不良的保護因素。