巴西橡膠樹ACA/ECA基因家族鑒定及分析

楊晶晶 方永軍 張鴻韜 龍翔宇 秦云霞 陽江華 肖小虎

關(guān)鍵詞：巴西橡膠樹；Ca2+-ATPase（ACA/ECA）；基因家族；生物學(xué)功能；表達(dá)分析

鈣離子（Ca2+）作為植物細(xì)胞的第二信使幾乎參與了植物生長發(fā)育的各個方面，包括對生物和非生物脅迫的反應(yīng)[1]。植物細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號的傳遞主要是通過改變細(xì)胞內(nèi)外鈣離子濃度實現(xiàn)的，而Ca2+濃度的變化則主要由膜上的跨膜轉(zhuǎn)運蛋白進行控制[2]。植物細(xì)胞的Ca2+轉(zhuǎn)運主要由鈣離子通道、鈣離子反向轉(zhuǎn)運蛋白和鈣離子泵[3]，Ca2+-ATPase屬于P-型ATP酶離子超家族的P2分支，根據(jù)其蛋白質(zhì)氨基酸序列和生化特征方面的差異分為2個亞家族（P2A和P2B），也分別稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)型Ca2+-ATPase（ER-typecalciumATPase，ECA，P2A）和自抑制的質(zhì)膜（PM）型Ca2+-ATPase（autoinhibitedcalciumATPase，ACA，P2B）[4]。在植物細(xì)胞中，定位于質(zhì)膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的P型Ca2+-ATP酶被認(rèn)為在調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)Ca2+濃度方面起重要作用[5]，同時P型Ca2+-ATP酶在植物生長發(fā)育的各個方面都是不可或缺的，包括花粉管生長、細(xì)胞程序性死亡、根部尖端生長，以及生物和非生物脅迫應(yīng)答（如低溫、高溫、鹽脅迫、干旱和滲透脅迫等）、共生等方面[3]。目前已經(jīng)在擬南芥[6]、水稻[7]、白菜[8]、茄科植物[9]、苜蓿[10]等植物中鑒定得到ACA/ECA基因家族多個成員，并對其在植物中的功能進行了研究。研究表明，在擬南芥中，ACA8基因功能的缺失能顯著提高擬南芥對零下低溫的抗凍性[11]；在低鈣環(huán)境下，ECA1表達(dá)受到干擾的轉(zhuǎn)基因株系耐受低Ca2+（0.2mmol/L）或高Mn2+（0.5mmol/L）脅迫的能力降低[12]。水稻ACA/ECA家族由15個成員組成，其中有3個屬于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜型鈣離子泵，12個屬于自抑制型鈣離子泵，鹽、干旱和ABA脅迫可以顯著激活OsACA6的表達(dá)，但熱脅迫激活作用相對較弱[13]。ACA/ECA家族在大白菜不同組織中表達(dá)模式不同，5個成員編碼蛋白定位于細(xì)胞膜上，其中Bra002762、Bra035649、Bra031701與低溫和鹽脅迫響應(yīng)有關(guān)，而Bra003276和Bra024117與自交不親和性相關(guān)[5]，大白菜缺少ECA基因會導(dǎo)致新葉生長緩慢，葉片枯萎黃化[14]。在茄科植物中，低溫和鹽脅迫處理后，SLyECA1基因表達(dá)豐度較高，且處理前后表達(dá)趨勢變化明顯，說明SLyACA1基因可能是提高植株抗性的關(guān)鍵基因[9]。野生大豆Ca2+ATPase基因GsACA1在苜蓿中超量表達(dá)，能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因苜蓿的耐鹽堿性[10]。以上研究表明，ACA/ECA基因家族成員在多種植物中均發(fā)揮了重要作用。

巴西橡膠樹是大戟科橡膠樹屬喬木，其產(chǎn)生的膠乳是天然橡膠生成的主要原料。天然橡膠（naturalrubber）是一種以聚異戊二烯為主要成分的天然高分子化合物，與合成橡膠相比天然橡膠性能更加優(yōu)良，在很多方面具有不可替代性，可用于生產(chǎn)飛機輪胎、手套等數(shù)萬種橡膠制品，在軍事、醫(yī)療、運輸?shù)刃袠I(yè)起著非常重要的作用[15]，中國是目前為止世界上最大的天然橡膠消費國，年消費量占全世界總消費量的40%以上，但自給率不足為15%[16]。理論預(yù)測，以及生產(chǎn)上出現(xiàn)的高產(chǎn)橡膠樹單株都顯示出巴西橡膠樹還具有巨大的產(chǎn)膠潛能[17-18]。目前已知的2500余種產(chǎn)膠植物中橡膠樹表現(xiàn)出優(yōu)異的產(chǎn)膠能力，推測與橡膠樹中高豐度表達(dá)的橡膠延伸因子/小橡膠粒子蛋白（REF/SRPP）基因家族發(fā)生擴增有關(guān)[19]。已有研究表明，REF/SRPP基因[20]、HbNN2基因[21]、蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白HbSUT3[22]對橡膠樹產(chǎn)膠具有重要作用。生產(chǎn)上，割膠和乙烯刺激都能顯著提高膠乳產(chǎn)量，表明激素和傷害信號的傳遞與橡膠生物合成關(guān)系密切。鈣離子是植物細(xì)胞內(nèi)重要的信號傳遞因子，在植物應(yīng)對生物和非生物脅迫方面具有重要功能，而目前關(guān)于鈣離子泵ACA/ECA家族在橡膠樹中的研究卻未見報道。本研究以已發(fā)表植物ACA/ECA蛋白序列為探針從橡膠樹轉(zhuǎn)錄組和基因組中鑒定出橡膠樹ACA/ECA家族的全體成員，并從理化性質(zhì)、系統(tǒng)進化和表達(dá)模式等方面進行了全面系統(tǒng)的分析。研究結(jié)果將為進一步研究ACA/ECA基因在橡膠樹乳管鈣離子信號的傳遞，以及橡膠樹生長發(fā)育和逆境脅迫應(yīng)答等方面的功能奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

供試材料均來自于海南省儋州市中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗基地。用于表達(dá)分析的不同組織材料（葉片、樹皮、膠乳、種子、雄花、雌花等6種組織）均來自于正常開割2年的熱研7-33-97橡膠樹。由于生產(chǎn)上開割樹多為嫁接苗，根部并非熱研7-33-97品種，因而本研究選用熱研7-33-97組培苗的根作為根材料。為了分析乙烯刺激對基因表達(dá)的影響，對正常開割2年的熱研7-33-97橡膠樹（未涂抹過乙烯利，割膠頻率為3d1刀）進行乙烯利刺激試驗，提前0、3、12、24h將1.5%的乙烯利涂抹在橡膠樹割面，然后在同一時間點采集膠乳樣品。為了進一步研究割膠對ACA/ECA基因表達(dá)的影響，選取相鄰2個林段，PR107品系和熱研8-79的未開割橡膠樹，同時進行3d1刀割膠，分別在第1、3、5、7、9刀采集膠乳樣品。利用試劑盒提取以上樣品的RNA，送往北京百邁克公司進行二代illumina轉(zhuǎn)錄組測序。

1.2方法

1.2.1橡膠樹ACA/ECA家族成員鑒定及理化性質(zhì)分析根據(jù)文獻[6]的方法，從NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）數(shù)據(jù)庫中下載模式植物擬南芥的ACA/ECA蛋白序列，以擬南芥蛋白序列作為探針，通過本地服務(wù)器進行blastp比對（參數(shù)e值為1e-4），得到候選橡膠樹ACA/ECA家族成員。利用在線軟件CD-Search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）對候選ACA/ECA家族成員所包含的結(jié)構(gòu)域進行進一步鑒定分析，得到橡膠樹ACA/ECA家族成員。利用在線軟件Expasy（https：//web.expasy.org/protparam/）和Plant-mPLoc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）對橡膠樹ACA/ECA基因家族成員的氨基酸分子量、蛋白長度、理論等電點以及亞細(xì)胞定位進行分析。

1.2.2構(gòu)建系統(tǒng)進化樹以及基因結(jié)構(gòu)圖在NCBI網(wǎng)站通過blastp比對檢索并下載水稻、楊樹和木薯的ACA/ECA蛋白序列，使用多序列比對軟件在線mafft（https：//mafft.cbrc.jp/alignment/software/）對擬南芥、水稻、楊樹、橡膠樹和木薯5種植物的蛋白序列進行比對，使用MEGA6.0[23]軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，參數(shù)bootstrap設(shè)置為1000，利用在線軟件Figtree（http：//tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/）對進化樹進行調(diào)整；利用基因組序列和基因組注釋GFF3文件對橡膠樹ACA/ECA基因家族進行基因結(jié)構(gòu)分析，通過GSDS（http：//gsds.gao-lab.org/）[24]在線軟件結(jié)合系統(tǒng)進化樹繪制出橡膠樹ACA/ECA基因結(jié)構(gòu)圖。

1.2.3橡膠樹ACA/ECA家族成員染色體定位分析利用Tbtools[25]軟件，根據(jù)橡膠樹GFF3文件相關(guān)信息繪制出橡膠樹ACA/ECA基因家族的染色體定位圖；利用MCscanX軟件對橡膠樹基因組進行共線性分析，繪制染色體之間的共線性連線[26]。

1.2.4橡膠樹ACA/ECA家族成員表達(dá)模式分析利用本實驗室轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對ACA/ECA家族成員在不同組織中、乙烯利處理不同時間點以及割膠處理條件下的表達(dá)進行分析[27]。將測序得到的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)上傳到本地服務(wù)器，利用RSEM[28]軟件包進行表達(dá)分析得到每個基因的FPKM值，利用Tbtools軟件中的HeatMap小程序繪制熱圖。

2結(jié)果與分析

2.1橡膠樹ACA/ECA家族成員鑒定及理化性質(zhì)分析

利用已發(fā)表模式植物擬南芥的ACA/ECA蛋白序列[6]，通過BLAST比對篩選橡膠樹ACA/ECA基因家族候選成員，并利用在線軟件CD-Search對候選成員的蛋白結(jié)構(gòu)域進行進一步鑒定，最終鑒定得到45個ACA/ECA基因家族成員，其中包含38個ACA和7個ECA亞家族成員，分別命名為HbACA1～HbACA38和HbECA1～HbECA7。橡膠樹ACA/ECA基因編碼的蛋白分子量在10048.04Da（HbACA26）～125412.75Da（HbACA36）之間，理論等電點在5.18（HbACA18）～9.21（HbACA26）之間，45個成員中30個成員等電點均小于7，說明大多屬于酸性蛋白。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，橡膠樹ACA/ECA基因家族成員大多定位于細(xì)胞膜（表1）。

2.2系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建及基因結(jié)構(gòu)分析

為了比較擬南芥（Arabidopsisthaliana，At）、木薯（Manihotesculenta，Me）、楊樹（Populustrichocarpa，Pt）、水稻（Oryzasativa，Os）4種植物和橡膠樹（Heveabrasiliensis，Hb）ACA/ECA蛋白在進化上的相互關(guān)系，利用mafft軟件對5種植物蛋白序列進行多序列比對，并用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，然后用Figtree軟件對進化樹進行修飾。從進化樹可以看出（圖1），ACA/ECA基因家族成員分別聚于ACA和ECA兩個不同分支，橡膠樹與木薯的ACA/ECA成員聚在一起，這與系統(tǒng)進化上木薯與橡膠樹的親緣關(guān)系較近是一致的；其中HbACA13、HbACA12、HbACA11、HbACA10、HbACA9、HbACA8和HbACA35聚集在同一個小分支，并且這7個成員均位于LGO2號染色體上，推測這7個成員是通過串聯(lián)復(fù)制進化而來。

利用基因組GFF3注釋文件對橡膠樹ACA/ECA基因家族成員進行基因結(jié)構(gòu)分析，并通過GSDS軟件結(jié)合進化樹繪制內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)圖（圖2）。在橡膠樹45個ACA/ECA基因家族成員中，35個成員含有內(nèi)含子，包括26個ACA和7個ECA成員，橡膠樹ACA/ECA家族成員內(nèi)含子數(shù)量在0～33之間，存在明顯差異。同一分支上的成員在內(nèi)含子數(shù)目和位置方面相對一致，除HbACA12、HbACA24、HbACA20、HbACA22、ACA25、HbACA15和HbACA16等12個成員無內(nèi)含子外，其他成員均存在1～33個內(nèi)含子；部分成員出現(xiàn)了較大數(shù)目的內(nèi)含子，如HbACA31、HbACA34、HbACA38和HbECA1的內(nèi)含子數(shù)目在30～33之間。

2.3橡膠樹ACA/ECA基因家族成員染色體定位分析

從45個ACA/ECA基因家族染色體定位圖可看出（圖3），45個成員分布在14條染色體上，LG02和LG09號染色體上分布有最多的成員，均為11個，LG16染色體上有4個成員，LG08染色體分布有3個成員，LG07、LG03、LG12、LG05、LG14染色體上均有2個成員，LG06、LG01、LG10、LG13、LG11染色體上分布最少，均為1個成員，另外，contig上也有1個成員。進一步分析發(fā)現(xiàn)，LG02和LG09號染色體上的成員大部分成簇分布，LG08、LG12、LG14和LG16四條染色體上有成員成對分布，這些成員可能是通過串聯(lián)重復(fù)復(fù)制而來，表明這些ACA/ECA家族成員蛋白序列具有較高的相似性，可能具有類似的生物學(xué)功能。藍(lán)色線連接表明成員之間具有共線性，在進化過程中通過染色體加倍或大片段復(fù)制形成。

2.4橡膠樹ACA/ECA基因家族表達(dá)分析

利用本實驗室轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對45個橡膠樹ACA/ECA基因家族成員在不同組織（膠乳、樹皮、葉片、種子、根、雌花和雄花）、乙烯利和割膠處理下的膠乳的表達(dá)情況進行分析并繪制熱圖。從橡膠樹ACA/ECA基因家族成員在不同組織中的表達(dá)可以看出（圖4），HbACA1、HbACA3、HbACA36、HbECA1、HbECA6和HbECA7功能較為保守，在各組織中均有表達(dá)；HbACA2在膠乳中特異高表達(dá)，而在其他組織中低表達(dá)或不表達(dá)，表現(xiàn)出組織特異性。另外，除HbACA2外，HbACA36、HbACA38和HbECA7四個成員在膠乳中的表達(dá)豐度也比較高，其中HbACA36在膠乳表達(dá)豐度最高；在葉片中，HbECA6、HbECA7、HbACA1、HbACA31和HbACA36表達(dá)豐度相對較高，其中HbACA31表達(dá)豐度最高；在樹皮中，HbECA6、HbECA7、HbACA1、HbACA31、HbACA36、HbACA26和HbACA3表達(dá)豐度較高。HbECA7在葉片、樹皮和根等多種組織中都有相對較高的表達(dá)，說明該成員可能在橡膠樹鈣離子運輸方面具有重要功能。

乙烯利刺激是橡膠生產(chǎn)中常用的一種增產(chǎn)手段，為了進一步研究橡膠樹ACA/ECA基因在乙烯利刺激后膠乳中的表達(dá)，本課題組在乙烯利處理后的4個不同時間點（0、3、12、24h）對ACA/ECA基因家族成員在膠乳中的表達(dá)進行了分析（圖5）。經(jīng)乙烯利處理后HbACA2、HbACA36、HbACA38、HbECA7四個成員表達(dá)呈上升趨勢，其中HbACA36在乙烯利處理24h后呈現(xiàn)高豐度表達(dá)，并且在處理前后相對于其他成員都處于較高表達(dá)水平，這和之前不同組織表達(dá)分析的結(jié)果一致。HbACA3在乙烯利處理后上調(diào)表達(dá)，HbECA5在膠乳中低表達(dá)或不表達(dá)但經(jīng)乙烯利刺激24h后上調(diào)表達(dá)。結(jié)合染色體定位圖來看，HbACA36和HbACA38有較高同源性，但在表達(dá)上卻存在差異，HbACA36表達(dá)豐度更高，并且乙烯利刺激后表達(dá)變化也更明顯，推測HbACA36在乳管鈣離子運輸方面起主要作用。研究結(jié)果表明，部分成員乙烯利刺激后在膠乳中的表達(dá)呈明顯的上升趨勢，推測這些成員可能在乳管膠乳再生方面發(fā)揮重要作用。

在橡膠生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)，割膠能夠促進橡膠樹產(chǎn)膠。為了進一步分析割膠對橡膠樹ACA/ECA基因家族成員表達(dá)的影響，選用2種不同產(chǎn)量水平的未開割橡膠樹品種進行割膠試驗，包括相對低產(chǎn)的PR107和高產(chǎn)品種熱研8-79；同時對2個品種的已開割橡膠樹進行割膠試驗，通過轉(zhuǎn)錄組測序?qū)虻谋磉_(dá)進行分析。由圖6可以看出，在割膠過程中ACA/ECA基因家族成員在PR107和熱研8-79中的表達(dá)趨勢整體一致，如HbECA6、HbECA7、HbACA1、HbACA2、HbACA3、HbACA36、HbACA37和HbACA38在2個品種的割膠過程中均有表達(dá)。其中HbACA36在PR107和熱研8-79割膠過程中均處于較高的表達(dá)水平，這與前面不同組織以及乙烯利處理的試驗結(jié)果一致。但是HbACA36在熱研8-79割膠過程的表達(dá)表現(xiàn)出明顯的上升趨勢（第1、3、5、7、9刀的FPKM值分別為206.19、221.96、281.45、353.36、355.59），而HbACA36在PR107中的表達(dá)則表現(xiàn)出先下降后上升再下降的表達(dá)趨勢（第1、3、5、7、9刀的FPKM值分別為212.89、160.28、209.92、205.15、159.48），HbACA36在熱研8-79中的整體表達(dá)水平高于PR107，這可能與熱研8-79的高產(chǎn)具有一定的相關(guān)性。此外，HbACA18和HbACA19經(jīng)割膠處理后僅在熱研8-79中表達(dá)，再次說明橡膠樹ACA/ECA基因家族成員在2個品種中的表達(dá)存在一定差異。

3討論

Ca2+-ATPase（ACA/ECA）在植物逆境脅迫應(yīng)答和生長發(fā)育等方面起重要作用[28]，目前，在擬南芥[6]、大白菜[8]、茄科植物[9]等多種植物中鑒定得到ACA/ECA家族成員，并對部分家族成員的功能進行了系統(tǒng)分析，而關(guān)于ACA/ECA基因在橡膠樹中的功能的研究還未見報道。天然橡膠是重要的戰(zhàn)略物質(zhì)，在工業(yè)和國防等方面發(fā)揮著重要作用，橡膠樹作為生產(chǎn)天然橡膠的唯一來源，其種植和生產(chǎn)一直備受關(guān)注[29]，隨著經(jīng)濟的發(fā)展，天然橡膠的消耗也不斷增長，出現(xiàn)供不應(yīng)求[30]，因而提高橡膠產(chǎn)量顯得尤為重要，鈣離子信號在乙烯刺激和割膠過程中的傳遞對增加膠乳產(chǎn)量促使乳管膠乳再生至關(guān)重要，因此探明ACA/ECA基因家族在橡膠樹中的功能有重要研究意義。本研究鑒定得到橡膠樹中45個ACA/ECA基因家族成員，包括38個ACA成員，7個ECA成員，其中ACA成員明顯多于ECA成員，這與其他植物的研究結(jié)果一致。從系統(tǒng)進化樹來看有2個明顯分支，在2個分支中橡膠樹與木薯ACA/ECA聚在一起，這與橡膠樹和木薯在系統(tǒng)進化上有較近的親緣關(guān)系是一致的。從染色體定位圖看，有成員成對或者成簇存在，其中2號和9號染色體上的部分成員聚在一起，結(jié)合進化樹可以看出，相對于楊樹和木薯等其他植物，橡膠樹ACA/ECA成員在部分分支上出現(xiàn)了擴張，并且擴張主要由串聯(lián)復(fù)制產(chǎn)生的。在表達(dá)方面，部分ACA/ECA成員在不同組織中的表達(dá)表現(xiàn)出組織特異性，如：HbACA2在膠乳中表達(dá)豐度較高，HbACA12在種子中表達(dá)豐度較高，而在其他組織中表達(dá)豐度很低或不表達(dá)；在膠乳中，HbACA2、HbACA36、HbACA38和HbECA7四個成員表達(dá)豐度相對較高，其中HbACA36在膠乳中表達(dá)豐度最高，并且明顯高于其他3個成員，推測HbACA36在乳管鈣離子轉(zhuǎn)運方面具有重要作用。乙烯利刺激和割膠是橡膠樹生產(chǎn)中最主要的2種增產(chǎn)手段，乙烯利處理后，HbACA36在膠乳中表達(dá)呈現(xiàn)明顯的上升趨勢，在高產(chǎn)品種熱研8-79割膠過程中HbACA36的表達(dá)也表現(xiàn)出明顯的上升趨勢，表明HbACA36在橡膠樹乳管中可能具有重要功能并且和橡膠樹的產(chǎn)量具有一定的相關(guān)性。綜上表明，HbACA36在橡膠樹乳管的信號傳遞方面起重要作用，進而影響橡膠樹乳管中的橡膠生物合成。本研究相關(guān)結(jié)果為進一步研究ACA/ECA基因的生物學(xué)功能，及其在乙烯刺激橡膠樹增產(chǎn)過程中的重要作用奠定了基礎(chǔ)。