冷青云 陸錦萍 黃少華 徐世松 李海燕 ??『? 尹俊梅
關(guān)鍵詞:流式細(xì)胞術(shù);蘭屬;倍性鑒定
蘭屬(CymbidiumSw.)是蘭科(Orchidaceae)重要觀賞類群之一,原生種約86種[1],主要分布于亞洲熱帶和亞熱帶地區(qū),向南到澳大利亞北部,中國是該屬的分布中心和多樣性中心,分布于秦嶺山脈以南地區(qū),約有63種[2]。種內(nèi)品種及種間雜種和品種間雜交種超過2萬種,截至2022年,在國際蘭花雜種登錄權(quán)威機(jī)構(gòu)(InternationalRegistrationAuthorityforOrchidHybrids,RHS)上登錄的蘭屬植物雜交種有超過17363個(gè)[3]。
蘭屬育種方式有選擇育種、雜交育種與誘變育種等,其中雜交育種是蘭屬植物的主要育種手段。在雜交育種工作中,了解親本及雜交后代的倍性和育性十分重要,有利于提高育種的成功率。通過染色體計(jì)數(shù)法對一些蘭屬原生種及雜交品種(雜交蘭和大花蕙蘭)進(jìn)行倍性鑒定研究,原生種及雜交蘭主要是二倍體,大花蕙蘭(Cymbidiumhybridium)的染色體倍性多樣化,有二倍體、三倍體、四倍體、六倍體和非整倍體[4-10]。然染色體計(jì)數(shù)法對細(xì)胞學(xué)操作技術(shù)要求較高,且費(fèi)時(shí)費(fèi)工,面對大規(guī)模種質(zhì)資源及雜交后代群體的倍性鑒定需要尋找一種快速便捷、高通量鑒定的方法。
流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry,F(xiàn)CM)是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一種對懸浮的單細(xì)胞進(jìn)行高速分析和分選的技術(shù)。在植物學(xué)研究中,常用于倍性分析、細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞周期分析及植物基因組大小估算等研究,具有分析速度快、靈敏度高、可靠性好等優(yōu)點(diǎn)[11-12]。近年來在紅掌[13]、香蕉[14]、橡膠[15]、火龍果[16]、茉莉花[17]、桂花[18]、三角梅[19-20]等植物倍性鑒定中應(yīng)用。在蘭科植物研究中,已有超過26屬70種的基因組大小是通過FCM評估,包括蘭屬、兜蘭屬(Paphiopedilum)、樹蘭屬(Epidnedium)等[21-25],另外,F(xiàn)CM也應(yīng)用于對化學(xué)誘變劑處理后的蝴蝶蘭(Phalaenopsis)、石斛(Dendrobium)、白芨(Bletilla)倍性鑒定[26-29]。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)對蘭屬3個(gè)雜交后代群體進(jìn)行倍性鑒定,以期為快速鑒定雜種后代倍性提供技術(shù)方法,并獲得優(yōu)良的多倍體植株,為今后的多倍體育種提供種質(zhì)材料。
1材料與方法
1.1材料
試驗(yàn)材料為親本黃金小神童(CymbidiumGoldenElf.‘Sundust)、冬風(fēng)蘭(CymbidiumdayanumRchb.f)、美花蘭(CymbidiuminsigneRolfe)以及其雜交后代群體,其中,黃金小神童為雜交種,其他為原生種,具體組合及雜交后代數(shù)量見表1。所有材料均保存于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所八隊(duì)熱帶花卉種質(zhì)資源圃。
1.2方法
1.2.1蘭屬流式細(xì)胞術(shù)倍性檢測技術(shù)體系構(gòu)建裂解液種類、試驗(yàn)材料組織部位是影響倍性檢測的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本試驗(yàn)應(yīng)用了3種裂解液Galbraithsbuffer(GLB)(30mmol/LNa3C6H5O7·2H2O、45mmol/LMgCl2、20mmol/L3-[nmorpholino]propanesulfonicacid]、0.1%TritonX-100(w/V),pH7.0)、WoodyPlantBuffer(WPB)(0.2mol/LTris-HCl,86mmol/LNaCl,10mmol/L焦亞硫酸鈉,4mmol/LMgCl2·6H2O,2mmol/LEDTANa2·2H2O,1%PVP-10,1%(V/V)TritonX-100,pH7.5[26]、CyStainUVPreciseP試劑盒,以黃金小神童幼嫩葉片、根尖組織、花梗、花萼片為材料,利用流式細(xì)胞儀測定相對熒光強(qiáng)度(relativefluorescenceintensityofPI-stainednuclei,F(xiàn)L)和G0/G1期的變異系數(shù)(coefficientofvariation,CV),篩選出最適合裂解液及組織部位,每個(gè)處理重復(fù)3次。
1.2.2蘭屬雜交后代流式細(xì)胞術(shù)倍性檢測基于黃金小神童為試驗(yàn)材料構(gòu)建的蘭屬流式細(xì)胞術(shù)倍性檢測技術(shù)體系:解離液為CyStainUVPreciseP,幼嫩葉片為試材,檢測其倍性。
將樣品置于含1.0mL預(yù)冷的GLB解離液的培養(yǎng)皿中,用鋒利的刀片切碎,2min后用300目尼龍網(wǎng)過濾,濾液加入預(yù)冷的碘化丙啶(PI)和RNAase溶液,工作濃度均為50μg/mL。置于冰上避光染色0.5~1h后上機(jī)檢測,儀器為SysmexCyFlow?PloidyAnalyser,激發(fā)光為488nm,每次檢測收集5000個(gè)顆粒,儀器自帶軟件作圖分析,變異系數(shù)控制在5%以內(nèi)。每份材料重復(fù)3次。
1.2.3不同倍性氣孔形狀觀察葉片氣孔大小和密度比較:取不同倍性葉片,在葉片下表皮均勻涂上一層透明指甲油,待指甲油干后,用鑷子挑取其表皮置于有蒸餾水的載玻片上,吸取多余的水分,加蓋玻片后在LeicaDM2500生物顯微鏡40×物鏡下觀察測量。每片至少觀察10個(gè)視野,記錄每個(gè)視野內(nèi)氣孔器的個(gè)數(shù),每片選取30個(gè)氣孔,測量每個(gè)氣孔器的長度和寬度。
2結(jié)果與分析
2.1蘭屬流式細(xì)胞術(shù)倍性檢測技術(shù)體系構(gòu)建
2.1.1不同裂解液對細(xì)胞核解離的影響以黃金小神童嫩葉為供試材料,利用流式細(xì)胞儀研究3種裂解液對蘭屬植物的裂解效果(圖1,表2),發(fā)現(xiàn)3種裂解液均能較好地保證完整的細(xì)胞核從破碎細(xì)胞中裂解出來,同時(shí)可降解細(xì)胞中的次生代謝產(chǎn)物。對于FL值,3種裂解液有顯著差異,其中GLB裂解液裂解樣品得出的FL值最低,最高的FL值出現(xiàn)在CyStainUVPreciseP裂解的樣品中,且顯著高于另外2個(gè)裂解液。在用3種裂解液對蘭屬進(jìn)行流式分析中,CV值差異不顯著,最高的為WPB裂解液,CV值為5.66%,大于5%;最低為GLB裂解液,為3.93%。裂解液的選擇標(biāo)準(zhǔn)為有最高的FL值和最低的CV值,通過表2發(fā)現(xiàn),CyStainUVPreciseP在3種裂解液種中最佳。從圖1也可看出,CyStainUVPreciseP制備的樣品流式細(xì)胞圖出峰清晰、穩(wěn)定、雜峰少,并且可以清晰地觀察到G2期。因此,選定CyStainUVPreciseP試劑盒為本研究后期的裂解液。
2.1.2不同組織部位對植物倍性的影響本研究分別使用植株的嫩葉、根尖、花梗和花萼片來驗(yàn)證不同組織器官對植物倍性檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的影響。由圖2可知,4種組織器官均能裂解出細(xì)胞核,嫩葉和花梗有一個(gè)明顯峰值,其峰值清晰,細(xì)胞碎片少,根尖和花萼片流式DNA含量直方圖顯示出2C、4C、8C共3個(gè)峰值,根尖在2C、4C處峰值等高,花萼片的主峰值出現(xiàn)在4C處,是葉片主峰值的2倍,這2種組織呈現(xiàn)體內(nèi)多倍化現(xiàn)象,不適合作為蘭屬倍性檢測的組織材料,花梗能較好地出峰,也無多倍化細(xì)胞干擾,但其取材時(shí)間只能在開花期特定時(shí)間采集,而葉片可以在任何季節(jié)取材,是理想的蘭屬倍性檢測組織部位。在后續(xù)的研究中選擇以幼嫩葉片為材料開展流式細(xì)胞術(shù)檢測。
2.2蘭屬雜交后代流式細(xì)胞術(shù)倍性檢測
以CyStainUVPreciseP試劑盒為裂解液,利用流式細(xì)胞儀對3個(gè)親本及其雜交后代進(jìn)行倍性檢測。測定結(jié)果見圖3,3個(gè)親本流式細(xì)胞圖出峰清晰、穩(wěn)定、雜峰少,熒光強(qiáng)度在12251~13509之間,差異不大。因3個(gè)親本均為二倍體,將雜交后代DNA相對含量峰值在12800左右定為二倍體,三倍體峰值在19200左右和四倍體峰值在25600左右。雜交后代倍性檢測統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3,共檢測出多倍體8株,其中黃金小神童×美花蘭后代檢測出三倍體1株,占比為1.02%;(黃金小神童×冬鳳蘭)×美花蘭后代檢測出三倍體5株,占比8.92%;四倍體2株,占比3.57%。
2.3不同倍性氣孔形狀比較
蘭屬二倍體、三倍體和四倍體的氣孔性狀分析結(jié)果表明(表4,圖4),不同倍性間的氣孔長度、寬度和密度均差異顯著(P<0.05);氣孔長度和寬度的排序?yàn)樗谋扼w>三倍體>二倍體,而氣孔密度的排序則相反。
3討論
目前,流式細(xì)胞術(shù)是大規(guī)模檢測植物倍性的有效手段,具有快速、準(zhǔn)確、操作簡便和可重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。其中裂解液種類和試驗(yàn)材料組織部位是影響其準(zhǔn)確性的關(guān)鍵因素。前人研究發(fā)現(xiàn)GLB對蘭屬裂解效果最好[24-25]。本研究在對蘭屬植物裂解試驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)CyStainUVPreciseP試劑盒裂解液是所用3種裂解液中效果最佳的,CyStainUVPreciseP為專利產(chǎn)品,配方成分未公開,且售價(jià)偏高,GLB含有檸檬酸鈉和TritonX-100,能清除蘭屬植物葉肉細(xì)胞中含有大量的糖類、酚類等黏性物質(zhì),其裂解的細(xì)胞懸浮液也能出較好的峰值,因此在對蘭屬物種進(jìn)行流式細(xì)胞技術(shù)測定時(shí),無法獲得CyStainUVPreciseP試劑盒裂解液的情況下,也可選擇GLB進(jìn)行試驗(yàn)。蘭科普遍存在核內(nèi)再復(fù)制現(xiàn)象[12],蘭屬組織器官中也均存在多倍體化[30]。本研究所選的4種植物組織中,根尖和花萼片均存在不同程度的內(nèi)源多倍體化現(xiàn)象,內(nèi)源多倍體化在植物倍性鑒定中會造成倍性改變的假象,對結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響;嫩葉和花梗出峰穩(wěn)定,因嫩葉不受開花等影響,在幼苗期及成苗期均可以采樣,是蘭屬倍性檢測的最佳組織材料。
多倍體育種是觀賞植物育種的重要方向之一。目前商業(yè)化的大花蕙蘭品種多數(shù)為多倍體。不同倍性品種間雜交是蘭屬多倍體的主要選育途徑,三倍體可由四倍體為親本與二倍體雜交產(chǎn)生,四倍體由四倍體和四倍體雜交產(chǎn)生,二倍體品種間雜交也能產(chǎn)生四倍體的子代[8,10]。本研究在2個(gè)二倍體為親本的雜交組合后代中檢測到三倍體和四倍體,四倍體可能是由二倍體合子經(jīng)體細(xì)胞加倍后發(fā)育成植株,三倍體是由未減數(shù)分裂的2n配子和經(jīng)減數(shù)分裂n配子受精融合發(fā)育而成,其中2n配子來源于母本的概率大于父本,因?yàn)樵讷@得多倍體雜交組合的母本均為雜交種,黃金小神童是建蘭(C.ensifolium)和大花蕙蘭(C.EnidHaupt)的雜交種,經(jīng)多次雜交選育而成,具有50%建蘭、12.5%美花蘭和6.25%獨(dú)占春的血統(tǒng)[英國皇家園藝學(xué)會(RHS)的蘭科植物品種國際登錄網(wǎng)]。有研究表明遠(yuǎn)緣雜交是獲得高效發(fā)生2n配子資源的有效手段,雜交種在配子形成過程中減數(shù)分裂異常,出現(xiàn)2n配子概率顯著高于原生種[31-32]。從本研究中雜交組合3比組合2出現(xiàn)多倍體比例高的現(xiàn)象,也可發(fā)現(xiàn)雜交代數(shù)越高,遺傳背景越復(fù)雜,獲得可育配子比例低,產(chǎn)生后代數(shù)量也相對少,但更容易出現(xiàn)多倍體。在蘭屬雜交育種中,親本選擇可以親緣關(guān)系較遠(yuǎn),親本至少有一方是經(jīng)過多代雜交后的雜交種,這樣子代植株倍性會相對豐富。
染色體組的加倍會導(dǎo)致基因表達(dá)和調(diào)控的改變,從而造成植物形態(tài)和生理上的相應(yīng)變化,如葉片變寬、變厚,花瓣變厚、顏色變深,氣孔長度和寬度增大、密度降低、育性和抗性改變等。本研究發(fā)現(xiàn),隨著倍性的提高氣孔的長度和寬度均增大,氣孔密度變小。這與張?jiān)丛吹萚33]在橡膠多倍體研究中的結(jié)果相似。而株型、花朵數(shù)量、大小和顏色、花期長短、抗性及育性等特性有待進(jìn)一步觀察。