馬泡瓜中多酚的提取工藝及抗氧化性研究

張麗，郭靖，梁靜靜，劉雨欣

（衡水學(xué)院應(yīng)用化學(xué)系，河北 衡水 053000）

馬泡瓜是葫蘆科黃瓜屬的一年生匍匐草本植物，別稱“馬包”，屬于中國(guó)的特有植物。馬泡瓜果實(shí)內(nèi)富含維生素E、維生素C、葫蘆素C 等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有極大的應(yīng)用價(jià)值。研究發(fā)現(xiàn)，馬泡瓜籽含有71.4%的多不飽和脂肪酸，含量遠(yuǎn)高于菜籽油、大豆油、花生油等日常食用油。馬泡瓜籽油可通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群來(lái)降低血漿膽固醇，研究表明，馬泡瓜籽油具有抗氧化、抗真菌和抗炎活性，具有較大的開發(fā)潛力。然而，迄今為止關(guān)于馬泡瓜的抗氧化活性的研究很少。因此，本實(shí)驗(yàn)為了實(shí)現(xiàn)馬泡瓜的開發(fā)與利用，對(duì)馬泡瓜中多酚的提取工藝及其抗氧化性能進(jìn)行研究。

目前，提取植物中多酚的方法日益更新，性能不斷提高，如溶劑提取法、生物酶提取法、超聲波提取法等，對(duì)植物多酚的提取率也日益增加。超聲波提取法具有方便、快速、簡(jiǎn)單、安全、易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化等優(yōu)點(diǎn)。薛治浦等采用超聲波輔助提取技術(shù)提取丹參葉總酚酸，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以及響應(yīng)面分析對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得出較優(yōu)工藝條件。本實(shí)驗(yàn)使用此方法研究馬泡瓜總酚提取。植物多酚是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的復(fù)雜酚類次生代謝物，在自然界儲(chǔ)量非常豐富。植物多酚的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使其具有較強(qiáng)的抗氧化以及清除自由基的能力。多酚類物質(zhì)是我們需要的天然抗氧化劑，但是人體自身不能合成，因此植物成為人類獲取多酚的重要來(lái)源。本實(shí)驗(yàn)利用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取馬泡瓜中的多酚，為馬泡瓜多酚開發(fā)提供了一條可行之徑。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

馬泡瓜采摘于河北省衡水市衡水湖附近；沒(méi)食子酸、95%乙醇、福林酚原液、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼、抗壞血酸、高錳酸鉀，均為分析純。

TD4 臺(tái)式低速離心機(jī)，湖南赫西儀器裝備有限公司；BL6-180A 超聲波清洗機(jī)，上海比朗儀器有限公司；722G 可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1.2.1 樣品預(yù)處理

將馬泡瓜粉末在干燥避光處保存?zhèn)溆?。?zhǔn)確稱取1.0 g馬泡瓜粉末置于錐形瓶中，加入10 mL 60%的乙醇溶液作為提取溶劑，設(shè)置超聲提取溫度和超聲提取時(shí)間分別為55℃和80 min。取少量提取液的上清液置于分光光度計(jì)中，760 nm處測(cè)其吸光值。

1.2.2 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品。用濃度為95%的乙醇溶液溶解沒(méi)食子酸，取0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8mL、1.0 mL 溶液分別置于5 支試管中，向每支試管中依次加入5 mL蒸餾水和0.7 mL福林酚原液，混合均勻，靜置反應(yīng)3 min，再向混合溶液中加入3 mL 7.5%碳酸鈉溶液，最后用蒸餾水定容至10 mL，混合均勻后避光反應(yīng)50 min。將溶液置于分光光度計(jì)中，760 nm 處測(cè)其吸光值。為了減小誤差，進(jìn)行三次平行試驗(yàn)。

利用Origin 軟件對(duì)所測(cè)結(jié)果進(jìn)行繪制，結(jié)果如圖1所示。方程如式（1）所示：

圖1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

式中：x—沒(méi)食子酸當(dāng)量濃度，μg/mL；y—吸光值，L/（g·cm）。

1.2.3 馬泡瓜多酚的單因素實(shí)驗(yàn)提取

取馬泡瓜粉末1.000 0 g，液料比（mL/g）為10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1，乙醇濃度設(shè)為30%、40%、50%、60%、70%，超聲提取，超聲時(shí)間為60 min、70min、80 min、90 min、100 min，超聲溫度為35℃、45℃、55℃、65℃、75℃。超聲提取結(jié)束后，分別吸取上層清液離心，吸取離心后的上層清液，在5 支試管中分別放置0.1 mL，向每支試管中加入5 mL 蒸餾水，再加0.7 mL福林酚原液，混合均勻后靜置反應(yīng)3 min，接著把3 mL 7.5%碳酸鈉溶液加入混合溶液中，最后用蒸餾水使之定容至10 mL，混合均勻后避光反應(yīng)50 min。將溶液置于分光光度計(jì)中，760 nm 處測(cè)其吸光值。為了減小誤差，進(jìn)行三次平行試驗(yàn)，并計(jì)算多酚的提取率。探究提取時(shí)間對(duì)馬泡瓜多酚提取率的影響。

1.2.4 馬泡瓜多酚含量的測(cè)定

采用福林酚法進(jìn)行測(cè)定。依據(jù)吸光值，計(jì)算出馬泡瓜中總酚的提取率。

式中：A—吸光值，L/（g·cm）；V—液體體積，mL；w—固體質(zhì)量，g。

1.2.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1。

自變量：提取時(shí)間（min）、液料比（mL/g）、乙醇濃度（%）、提取溫度（℃）。

響應(yīng)值：馬泡瓜總酚的提取率（mg/g）。

1.2.6 馬泡瓜多酚浸膏的制備

在1.2.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)最優(yōu)條件下，超聲并取上清液進(jìn)行離心，得到馬泡瓜多酚溶液，再次離心，將溶液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上進(jìn)行旋蒸操作，從而得到馬泡瓜多酚浸膏。

1.2.7 馬泡瓜多酚的抗氧化性

根據(jù)一定比例稀釋馬泡瓜多酚浸膏，測(cè)定馬泡瓜多酚溶液對(duì)DPPH的清除能力，與VC對(duì)DPPH的清除能力進(jìn)行對(duì)比。

將馬泡瓜提取的多酚浸膏溶解，配成不同濃度的馬泡瓜多酚溶液，即濃度為10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL、120 μg/mL、150 μg/mL、200μg/mL。

（1）取0.5 mL 馬泡瓜多酚溶液，用稀釋后的DPPH溶液定容至5.0 mL，反應(yīng)30 min。

（2）取2.0 mL馬泡瓜多酚溶液，加入2.0 mL無(wú)水乙醇，反應(yīng)30 min。

（3）取2.0 mL 蒸餾水，并加入2.0 mL 的DPPH 溶液，反應(yīng)30 min。

將溶液置于分光光度計(jì)中，測(cè)量吸光度Ai、Aj、Ao，為保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確，減小誤差，進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)。

以VC做對(duì)照組，將不同濃度的VC溶液代替馬泡瓜多酚溶液，其余操作不變。

根據(jù)Ai、Aj、Ao求出多酚溶液對(duì)DPPH的清除率：

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)馬泡瓜多酚提取率的影響

由圖2 可知，在一定條件下，馬泡瓜多酚的提取率隨著提取時(shí)間的增加，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。在80 min 時(shí)，提取率出現(xiàn)峰值，此時(shí)馬泡瓜多酚的提取率最高。當(dāng)提取時(shí)間從60 min 延長(zhǎng)到80 min時(shí)，馬泡瓜多酚的提取率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；提取時(shí)間從80 min 延長(zhǎng)到100 min 時(shí)，提取率則呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，分析原因可能是提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，使馬泡瓜多酚發(fā)生分解，從而導(dǎo)致提取率降低，不能達(dá)到最好的提取效果。

圖2 提取時(shí)間與馬泡瓜多酚提取率的關(guān)系圖

2.1.2 料液比對(duì)馬泡瓜多酚提取率的影響

由圖3 可知，在一定條件下，隨著液料比的增加，馬泡瓜多酚的提取率呈現(xiàn)先上升后緩慢下降的趨勢(shì)。當(dāng)液料比為30∶1（mL/g）時(shí)，提取率出現(xiàn)峰值，這時(shí)，馬泡瓜多酚的提取率最高。當(dāng)液料比從10∶1（mL/g）增大到30∶1（mL/g）時(shí)，馬泡瓜多酚的提取率呈上升趨勢(shì)；液料比從30∶1（mL/g）增大到50∶1（mL/g）時(shí)，提取率呈緩慢下降趨勢(shì)，分析原因可能由于溶劑增多，使馬泡瓜多酚被稀釋，從而含量降低，提取率也隨之降低。

圖3 液料比與馬泡瓜多酚提取率的關(guān)系圖

2.1.3 乙醇濃度對(duì)馬泡瓜多酚提取率的影響

由圖4 可知，在一定條件下，可以明顯看到隨著乙醇濃度的增加，馬泡瓜多酚的提取率呈現(xiàn)先上升后急劇下降的趨勢(shì)。當(dāng)乙醇濃度為50%時(shí)，提取率出現(xiàn)峰值，此時(shí)馬泡瓜多酚的提取率最高。當(dāng)乙醇濃度從30%提高至50%時(shí)，馬泡瓜多酚的提取率呈上升趨勢(shì)；乙醇濃度從50%提高至70%時(shí)，提取率呈急劇下降趨勢(shì)，分析原因由于乙醇濃度的提高破壞了馬泡瓜多酚的結(jié)構(gòu)，從而使馬泡瓜多酚的提取率急劇下降。

圖4 乙醇濃度與馬泡瓜多酚提取率的關(guān)系圖

2.1.4 提取溫度對(duì)馬泡瓜多酚提取率的影響

由圖5可知，在一定條件下，隨著提取溫度的升高，馬泡瓜多酚提取率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)提取溫度從35℃提高到55℃時(shí)，馬泡瓜多酚提取率呈上升趨勢(shì)，繼續(xù)升高提取溫度至75℃時(shí)，馬泡瓜多酚的提取率呈下降趨勢(shì)?？紤]到溫度過(guò)高會(huì)破壞多酚結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致馬泡瓜多酚變質(zhì)，因此選用55℃為最佳提取條件。

圖5 提取溫度與馬泡瓜多酚提取率的關(guān)系圖

2.1.5 單因素小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)探究了馬泡瓜多酚的提取條件。實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)提取時(shí)間、液料比、乙醇濃度和提取溫度分別為80min、30∶1（mL/g）、50%、55℃時(shí)，馬泡瓜總酚提取率最高。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)及統(tǒng)計(jì)分析

2.2.1 響應(yīng)面Box-Behnken優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素最佳提取條件，采用響應(yīng)面軟件，設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2。

表2 響應(yīng)面Box-Behnken優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將數(shù)據(jù)擬合，獲得多酚提取率（Y）與提取時(shí)間（A）、液料比（B）、乙醇濃度（C）、提取溫度（D）之間關(guān)系的二元多項(xiàng)回歸方程：

Y=88.20+1.33B+2.5C+D-1.50AB-2.00AC-2.00AD-2.75BC -1.25BD -1.25CD -24.47A2-23.97B2-25.47C2-25.73D2

由表3可知，F(xiàn)=88.85，說(shuō)明該模型顯著，只有0.01%的概率使F 值出現(xiàn)這么大。P<0.05 說(shuō)明該模型項(xiàng)顯著。根據(jù)表3可知，C2、A2、B2、C2、D2是重要的模型項(xiàng)，多酚得率極其顯著（p<0.05）。根據(jù)表3，馬泡瓜總酚提取受四個(gè)因素影響程度：提取時(shí)間<提取溫度<液料比<乙醇濃度。

表3 回歸模型各項(xiàng)方差分析

2.2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

由圖6～圖11 可知，通過(guò)模型的擬合分析，預(yù)測(cè)的最佳提取條件：提取時(shí)間、液料比、乙醇濃度、提取溫度分別為81 min、31∶1（mL/g）、44%和59℃。進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表4 最佳工藝條件及其驗(yàn)證所示，得到平均提取率為79.042 mg/g，與預(yù)測(cè)值73.996 mg/g 相當(dāng)，說(shuō)明馬泡瓜總酚提取條件可行、合理。

表4 最佳工藝條件及其驗(yàn)證

圖6 提取時(shí)間和液料比對(duì)提取率影響關(guān)系圖

圖7 提取時(shí)間和乙醇濃度對(duì)提取率影響關(guān)系圖

圖8 提取時(shí)間和提取溫度對(duì)提取率影響關(guān)系圖

圖9 液料比和乙醇濃度對(duì)提取率影響關(guān)系圖

圖10 液料比和提取溫度對(duì)提取率影響關(guān)系圖

圖11 乙醇濃度和提取溫度對(duì)提取率影響關(guān)系圖

2.3 馬泡瓜多酚的抗氧化性研究

由圖12 可知，VC 對(duì)DPPH 的清除能力隨溶液濃度的升高而增強(qiáng)，即溶液濃度從10 μg/mL 升高到200 μg/mL 時(shí)，清除率從46.59%上升至93.41%，上升了46.82%。馬泡瓜多酚對(duì)DPPH 的清除能力隨溶液濃度的升高先增強(qiáng)后減弱，即溶液濃度從10 μg/mL 升高到80 μg/mL 時(shí)，清除能力逐漸增強(qiáng)，抗氧化性增強(qiáng)，清除率從4.20%上升至27.87%，上升了23.67%。在80 μg/mL處達(dá)到峰值，清除率峰值為27.87%。當(dāng)溶液濃度從80 μg/mL 升高到200 μg/mL 時(shí)，馬泡瓜多酚對(duì)DPPH 的清除能力逐漸減弱，抗氧化性逐漸減弱，清除率從27.87%下降至14.53%，降低了13.34%。綜上所述，VC對(duì)DPPH 的清除能力較高，而馬泡瓜多酚對(duì)DPPH 的清除能力雖然弱于VC，但對(duì)其仍具有清除效果。

圖12 總酚、VC對(duì)DPPH清除效果的測(cè)定

3 結(jié)論

本次研究通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，確定提取時(shí)間、液料比、乙醇濃度和提取溫度分別為80 min、30∶1（mL/g）、50%和55℃，此時(shí)，馬泡瓜總酚提取率最大。

運(yùn)用響應(yīng)面模型的預(yù)測(cè)能力發(fā)現(xiàn)，馬泡瓜總酚提取受四個(gè)因素影響程度為提取時(shí)間<提取溫度<液料比<乙醇濃度，得到最佳提取條件：提取時(shí)間、液料比、乙醇濃度和提取溫度分別為81 min、31∶1（mL/g）、44%和59℃，提取率為73.996 mg/g。

本文對(duì)比了馬泡瓜多酚及VC 的抗氧化性，結(jié)果表明，馬泡瓜多酚具有良好的抗氧化活性，活性隨著濃度的增加先增大后降低；馬泡瓜多酚對(duì)于DPPH的清除能力雖然弱于VC，但對(duì)其仍具有一定的清除能力。