異基因嵌合抗原受體T細(xì)胞技術(shù)的研究進(jìn)展

趙 茜，李 鋒

東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院血液科，南京 210002

近十年來嵌合抗原受體T(chimeric antigen receptor T，CAR-T)細(xì)胞療法在血液系統(tǒng)腫瘤中的應(yīng)用和實(shí)踐極大證明了免疫系統(tǒng)對抗腫瘤的有效性。嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)在經(jīng)基因工程技術(shù)導(dǎo)入T細(xì)胞后，可與腫瘤相關(guān)抗原特異性結(jié)合，并通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激活T細(xì)胞，發(fā)揮抗腫瘤作用。截至2022年2月，全球已批準(zhǔn)7款CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品用于治療非霍奇金淋巴瘤、急性B淋巴細(xì)胞白血病、多發(fā)性骨髓瘤[1-2]。目前，所有注冊的治療和大多數(shù)的臨床試驗(yàn)都是基于二代的CAR，包括了一個(gè)細(xì)胞外抗原結(jié)合域(通常是抗體的單鏈可變片段)、一個(gè)T細(xì)胞受體(T cell receptor，TCR)的CD3ζ鏈和一個(gè)可與CD3ζ融合的共刺激域(CD28或CD137，也稱為4-1BB)[3]。

雖然自體CAR-T細(xì)胞治療擁有不錯(cuò)的臨床數(shù)據(jù)，但由于它存在個(gè)性化定制成本過高、制備周期過長、細(xì)胞數(shù)量和擴(kuò)增能力不足等問題，導(dǎo)致實(shí)用性下降，同時(shí)因?yàn)槟[瘤微環(huán)境的多種免疫抑制機(jī)制可引起T細(xì)胞功能障礙，且隨著腫瘤不斷復(fù)發(fā)進(jìn)展，治療線數(shù)越多，臨床治療效果越差，所以腫瘤免疫微環(huán)境和治療線數(shù)都會(huì)影響T細(xì)胞的生物學(xué)特性，從而導(dǎo)致自體T細(xì)胞在部分患者中無效[4]。目前研究人員使用健康供體的細(xì)胞制備異基因通用型CAR-T細(xì)胞，可通過優(yōu)化制備工藝、質(zhì)量控制，實(shí)現(xiàn)基因CAR-T細(xì)胞的規(guī)?；a(chǎn)，不僅降低了成本，還能讓更多患者獲得治療。

自2015年第1例異基因的CAR-T細(xì)胞應(yīng)用于1歲急性淋巴細(xì)胞白血病患兒并獲得分子生物學(xué)緩解以來，相繼有患者成功接受異基因CAR-T細(xì)胞的治療并序貫造血干細(xì)胞移植，這些成功的臨床案例標(biāo)志著異基因CAR-T細(xì)胞技術(shù)逐漸實(shí)現(xiàn)了從實(shí)驗(yàn)研究到臨床應(yīng)用的目標(biāo)[5-6]。目前異基因方式主要存在兩個(gè)問題：(1)異基因CAR-T細(xì)胞可能導(dǎo)致危及生命的移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)；(2)異基因CAR-T細(xì)胞易被宿主免疫系統(tǒng)迅速消除，限制了它的抗腫瘤活性。下面我們將異基因CAR-T細(xì)胞制備的來源、如何改進(jìn)制備流程、減少GVHD的產(chǎn)生和增加其抗腫瘤活性等研究進(jìn)展做一綜述。

異基因CAR-T細(xì)胞的來源

目前異基因CAR-T細(xì)胞制備的T細(xì)胞主要源于外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)，如果發(fā)生HLA配型困難情況，常用來自臍帶血的T細(xì)胞，也能用可再生的干細(xì)胞，如誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)。

健康供體來源選擇健康供體來源的PBMC制備異基因CAR-T細(xì)胞，優(yōu)勢在于一方面制備成功的此類異基因CAR-T細(xì)胞是由不受腫瘤免疫效應(yīng)影響或化學(xué)暴露損害的免疫細(xì)胞產(chǎn)生的，另一方面，異基因CAR-T細(xì)胞還能形成表達(dá)不同亞型的人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)復(fù)合物的細(xì)胞庫，以方便選擇與患者HLA類型相匹配，根據(jù)HLA配型選擇供體可能是降低細(xì)胞終產(chǎn)物異質(zhì)性的關(guān)鍵因素。

臍帶血來源使用臍帶血來源的T細(xì)胞，具有獨(dú)特抗原幼稚狀態(tài)，對HLA相合位點(diǎn)的數(shù)量限制沒有那么嚴(yán)格，且臍帶血T細(xì)胞還可通過抑制活化T細(xì)胞核因子信號(hào)傳導(dǎo)，減弱臍帶血T細(xì)胞對受體抗原的同種反應(yīng)性，從而降低GVHD的發(fā)生率和嚴(yán)重程度[7-8]。有報(bào)道胎盤干細(xì)胞可產(chǎn)生T細(xì)胞或自然殺傷(natural killer，NK)細(xì)胞，細(xì)胞同質(zhì)性更好[9]。

干細(xì)胞來源iPSC具有無限的自我更新能力，可生成具有共同HLA單倍型的iPSC庫，減少CAR-iPSC T細(xì)胞的異體排斥風(fēng)險(xiǎn)，且在HLA錯(cuò)配的情況下，還可利用基因編輯技術(shù)改造TCR，有效避免GVHD。使用iPSC來源的優(yōu)勢在于由多能細(xì)胞系產(chǎn)生的CAR-T細(xì)胞是同質(zhì)的，但該方法的安全性和有效性尚需進(jìn)一步臨床驗(yàn)證。

降低GVHD的方法

因?yàn)棣力耇細(xì)胞上的TCR可識(shí)別主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)分子所呈遞的多肽，從而引發(fā)GVHD，而GVHD又是引起異基因干細(xì)胞移植(allogeneic stem cell transplantation，Allo-SCT)患者死亡的主要原因，已有研究表明αβT細(xì)胞是急慢性GVHD發(fā)生發(fā)展的重要因素[10]。下面介紹幾種異體CAR-T細(xì)胞降低GVHD的方法，包括使用供者來源的異體干細(xì)胞移植T細(xì)胞，使用病毒特異性記憶T細(xì)胞，使用非-αβT細(xì)胞和基于基因編輯構(gòu)建TCR缺失的αβT細(xì)胞。

使用來自干細(xì)胞移植供體的異體CAR-T細(xì)胞此方式僅限于那些接受過Allo-SCT后復(fù)發(fā)的患者，CAR-T細(xì)胞可來自原始供體。供體來源的CAR-T細(xì)胞可納入Allo-SCT的策略，以增強(qiáng)移植物抗腫瘤效應(yīng)，而不增加GVHD的風(fēng)險(xiǎn)。Brudno等[11]研究表明20例復(fù)發(fā)的B細(xì)胞惡性腫瘤患者未化療直接接受來自原始供體的CD19 CAR-T細(xì)胞，6例患者獲得完全緩解，2例患者獲得部分緩解，無一例發(fā)生GVHD。更多臨床研究發(fā)現(xiàn)患者血液中CAR-T細(xì)胞的峰值早期可保持高水平，但CAR-T細(xì)胞在3周后無法維持在較高水平，長期效果尚需觀察，這與之前報(bào)道是一致的[12-13]。

使用病毒特異性的記憶T細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)在Allo-SCT中純化的病毒特異性記憶T細(xì)胞可以在不誘發(fā)GVHD的情況下預(yù)防病毒性疾病[14]。純化的病毒特異性記憶T細(xì)胞有效降低了T細(xì)胞數(shù)量，減少了TCR的多樣性，所以病毒特異性記憶T細(xì)胞中的TCR功能受限減低了GVHD的發(fā)生率。2022年12月美國血液學(xué)年會(huì)上公布了一項(xiàng)CD30 CAR修飾的Epstein-Barr病毒特異性T細(xì)胞療法的臨床I期數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示：14例晚期的淋巴瘤在3個(gè)不同劑量給藥治療后的總體緩解率為69.2%，完全緩解率為43%，安全性和耐受性良好[15]。

使用非αβ T細(xì)胞這種方法是完全避免使用αβT細(xì)胞，并設(shè)計(jì)另一種細(xì)胞類型來攜帶CAR。NK細(xì)胞是生物體天然腫瘤免疫監(jiān)視的一部分，具有殺死腫瘤細(xì)胞的能力，不需要通過MHC途徑激活，可降低同種反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)，且CAR-NK細(xì)胞的制備可以使用現(xiàn)有的NK92細(xì)胞系，無需自體NK細(xì)胞，更加方便[16]。CAR-NK細(xì)胞療法的另一個(gè)優(yōu)勢在于較少發(fā)生免疫介導(dǎo)毒性，如細(xì)胞因子釋放綜合征和神經(jīng)毒性并發(fā)癥等。一項(xiàng)11例患者接受來自臍帶血的HLA不匹配抗CD19CAR-NK細(xì)胞治療淋巴瘤的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，無一例出現(xiàn)GVHD、細(xì)胞因子釋放綜合征或神經(jīng)毒性并發(fā)癥[17]。另有研究表明若在CAR-NK細(xì)胞擴(kuò)增后同時(shí)表達(dá)白細(xì)胞介素(IL)-15，與CD19 CAR-NK細(xì)胞對照組相比，使用CD19 CAR-IL-15轉(zhuǎn)導(dǎo)的NK細(xì)胞的淋巴瘤移植小鼠模型存活時(shí)間更長[18]。目前已有20多項(xiàng)關(guān)于CAR-NK細(xì)胞的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行，不過NK細(xì)胞的平均壽命有限，一般約為2周，這意味著可能需要反復(fù)輸注CAR-NK細(xì)胞才能取得長期效果。

自然殺傷T(natural killer T，NKT)細(xì)胞屬于T淋巴細(xì)胞，細(xì)胞表面表達(dá)NK標(biāo)志物，恒定NKT細(xì)胞(invariant NKT，iNKT)是其主要亞型，表達(dá)一種高度限制性TCR，可通過識(shí)別CD1d所呈遞的糖脂抗原轉(zhuǎn)化為成熟的iNKT。與T細(xì)胞相比，iNKT表達(dá)更多的趨化因子受體(chemokine receptor，CCR)，比如CCR1、CCR2、CCR3、CCR4等，可促進(jìn)iNKT細(xì)胞浸潤到腫瘤中去招募更多的免疫細(xì)胞進(jìn)行殺傷，更重要的是iNKT細(xì)胞可以通過CD1d依賴的方式殺傷腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞，并消除髓源性抑制細(xì)胞的免疫抑制活性[19]。目前認(rèn)為供體iNKT細(xì)胞在Allo-SCT中可保護(hù)機(jī)體免受急性GVHD。臨床研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤中浸潤的iNKT細(xì)胞的數(shù)量和比例與患者的總生存率呈正相關(guān)[20]，但其實(shí)iNKT細(xì)胞數(shù)量較少，且在腫瘤中的浸潤是不足的，同時(shí)多數(shù)腫瘤細(xì)胞為CD1d陰性或CD1d表達(dá)在腫瘤發(fā)展過程中下調(diào)，這使iNKT細(xì)胞無法直接識(shí)別，需要增加額外的共刺激信號(hào)。二代CAR構(gòu)建的共刺激結(jié)構(gòu)域中CD28或4-1BB與CD3ζ串聯(lián)使用最廣泛，研究表明4-1BB可提供有效的協(xié)同刺激以增強(qiáng)iNKT細(xì)胞的擴(kuò)增能力和抗腫瘤效應(yīng)，但同時(shí)會(huì)激活誘導(dǎo)CAR-iNKT細(xì)胞的細(xì)胞死亡，而包含CD28共刺激域的CAR-iNKT細(xì)胞卻顯示出抗凋亡的優(yōu)勢[21-22]。

候選細(xì)胞是γδ T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞有天然的細(xì)胞毒性反應(yīng)。γδ T細(xì)胞僅占循環(huán)淋巴細(xì)胞的1%～5%，但在一些上皮部位占主導(dǎo)地位，如腸道、生殖器官、舌頭和皮膚。γδ T細(xì)胞相比于αβ T細(xì)胞有如下優(yōu)勢：(1)在識(shí)別方式上，γδ T細(xì)胞以獨(dú)立于MHC的方式識(shí)別其靶細(xì)胞，從而減少同種異體反應(yīng)和GVHD的風(fēng)險(xiǎn)，是優(yōu)質(zhì)的異體細(xì)胞產(chǎn)品的來源。(2)γδ T細(xì)胞浸潤在各種各樣的組織中，可以快速響應(yīng)靶標(biāo)并釋放效應(yīng)細(xì)胞因子，特別是vδ1亞型，具有優(yōu)于αβ T細(xì)胞的歸巢優(yōu)勢，能更好地在腫瘤低氧環(huán)境中浸潤和發(fā)揮功能。(3)γδ T細(xì)胞對于腫瘤的識(shí)別和殺傷不依賴于單一抗原的表達(dá)，相反，它們通過在細(xì)胞膜上表達(dá)的各種先天細(xì)胞毒性受體來識(shí)別各種腫瘤細(xì)胞上的多種抗原，擴(kuò)大了可用于殺死腫瘤細(xì)胞的靶點(diǎn)范圍，減少了單抗原丟失導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸的機(jī)會(huì)。

目前γδCAR-T細(xì)胞已在白血病、肝癌的臨床前模型中顯示出不錯(cuò)的抗腫瘤效應(yīng)[23-24]，但體外擴(kuò)增培養(yǎng)工藝和細(xì)胞的工程化改造仍面臨挑戰(zhàn)，且其療效與普通CAR-T細(xì)胞相比也是有限的。

使用基因編輯技術(shù)目前主要依賴鋅指核酸酶、轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶和規(guī)律性間隔的短回文序列重復(fù)簇(clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR)/CRISPR相關(guān)基因9(CRISPR-associated genes 9，Cas9)等平臺(tái)來進(jìn)行基因編輯[25]。在基因組的TCR和HLA的位點(diǎn)進(jìn)行特異性雙鏈斷裂，通過非同源末端連接或同源定向重組方式進(jìn)行修復(fù)，從而實(shí)現(xiàn)敲除TCR和HLA來減弱或消除GVHD并提高CAR-T的存活能力；或者同時(shí)敲除T細(xì)胞抑制性受體的基因，如程序性死亡受體-1、細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4、T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白-3等，減少T細(xì)胞耗竭，增強(qiáng)CAR-T的殺傷功能?？偟膩碚f鋅指核酸酶特異性高，脫靶率低，但細(xì)胞毒性大，成本高，而CRISPR/Cas9由于其設(shè)計(jì)簡單，操作方便，成本較低，編輯高效，可實(shí)現(xiàn)多靶點(diǎn)編輯，目前在進(jìn)行廣泛開發(fā)，但是它的脫靶率較高。以上技術(shù)目前已在多個(gè)臨床試驗(yàn)中使用(表1)，包括靶向CD19的UCART019(NCT03166878)、靶向CD70的CTX130(NCT04502446、NCT04438083)、靶向B細(xì)胞成熟抗原的CTX120(NCT04244656)和靶向CD5的CT125A(NCT04767308)等。

表1 基于基因編輯的異基因CAR-T臨床試驗(yàn)

基于目前越來越多的臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)輸注前先進(jìn)行去除T淋巴細(xì)胞的預(yù)處理化療方案，會(huì)更有利于體內(nèi)CAR-T細(xì)胞的擴(kuò)增，常用的去除T淋巴細(xì)胞的預(yù)處理化療方案為氟達(dá)拉濱與環(huán)磷酰胺。在異基因CAR-T治療中為了更徹底的淋巴細(xì)胞耗竭，T細(xì)胞被設(shè)計(jì)成敲除編碼T細(xì)胞受體ɑ恒定鏈(T-cell receptor alpha constant chain，TRAC)和CD52基因的結(jié)構(gòu)，從而獲得了TCR缺失和對抗CD52單克隆抗體阿侖單抗產(chǎn)生抗藥性，該單抗可用于消除宿主T細(xì)胞(表達(dá)CD52)并避免異體排斥。在預(yù)處理中添加阿侖單抗可以進(jìn)一步抑制宿主的同種異體免疫排斥反應(yīng)，并通過擴(kuò)增異基因CAR-T細(xì)胞來延長其治療窗口期。在2項(xiàng)復(fù)發(fā)兒童和成人急性B淋巴細(xì)胞白血病的I期臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)異基因CD19CAR-T細(xì)胞治療后所有獲得完全緩解的患者的預(yù)處理方案為氟達(dá)拉濱與環(huán)磷酰胺+阿倫單抗(14/21，67%)，4例沒用阿倫單抗的患者未見CD19CAR-T擴(kuò)增或抗白血病效應(yīng)[26]。一項(xiàng)針對多發(fā)性骨髓瘤的敲除TRAC和CD52的異基因B細(xì)胞成熟抗原CAR-T臨床試驗(yàn)顯示治療后總體緩解率為60%，非常好的部分緩解率為40%，45%的患者出現(xiàn)細(xì)胞因子釋放綜合征，無患者出現(xiàn)神經(jīng)毒性；擴(kuò)增高峰在7 d左右，并可持續(xù)120 d，未觀察到GVHD的發(fā)生[27]。

CD7也是其敲除靶點(diǎn)，有研究表明敲除TRAC和CD7的異基因CAR-T在體外和免疫缺陷小鼠的細(xì)胞系和原發(fā)性急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞中保持了強(qiáng)大的抗白血病作用，未發(fā)現(xiàn)GVHD[28]；而且近期一項(xiàng)由CRISPR編輯的TCR和CD7的異基因CAR-T(GC027)的臨床試驗(yàn)顯示2例強(qiáng)化療后難治性/復(fù)發(fā)性T-ALL患者在單次輸注GC027后獲得完全緩解，所檢測到的微小殘留病灶都是陰性[29]。

CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)同種免疫排斥反應(yīng)，表達(dá)可被調(diào)節(jié)因子X錨蛋白重復(fù)序列調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)和Ⅱ類MHC反式激活子調(diào)節(jié)[30]。研究發(fā)現(xiàn)與異基因PBMC共培養(yǎng)的三重敲除β2微球蛋白、MHC反式激活子和TRAC的異體抗CD19 CAR-T細(xì)胞比雙重敲除TRAC和β2微球蛋白表現(xiàn)出更好的持久性[31]。iPSC中也有類似的基因編輯，比如敲除β2微球蛋白、MHC反式激活子和CD155(編碼NK細(xì)胞的活化配體)以及轉(zhuǎn)導(dǎo)HLA-E，這些低免疫原性細(xì)胞將大大減少來自CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和NK細(xì)胞帶來的免疫反應(yīng)并維持其抗腫瘤毒性[32]。

總 結(jié)

總而言之，自體CAR-T細(xì)胞療法極大地改善了血液系統(tǒng)腫瘤患者的預(yù)后，逐漸成為抗腫瘤治療中的明星產(chǎn)品，但價(jià)格昂貴、制備周期和質(zhì)控問題限制了自體CAR-T細(xì)胞療法廣泛應(yīng)用。異基因CAR-T細(xì)胞選擇不同來源的T細(xì)胞制備，并可利用多種基因編輯技術(shù)來減少GVHD和增強(qiáng)殺傷力，極大提高了異基因CAR-T細(xì)胞療法的可及性和適用性。但異基因CAR-T細(xì)胞技術(shù)才剛剛起步，仍然面對諸多挑戰(zhàn)，如異基因CAR-T細(xì)胞療法中細(xì)胞的擴(kuò)增、持久性問題，脫靶效應(yīng)等，隨著對免疫系統(tǒng)作用機(jī)制研究的深入、基因編輯技術(shù)的進(jìn)步和CAR-T結(jié)構(gòu)的不斷優(yōu)化，相信異基因CAR-T會(huì)像血制品一樣成為一種常規(guī)的活性藥物，給血液系統(tǒng)腫瘤患者提供安全高效和更高性價(jià)比的方案，帶來更光明的治療前景。