2種豬繁殖與呼吸綜合征抗體ELISA檢測(cè)試劑盒的比較分析

王傳鋒 米青婕 皮志媛

摘要選取2種豬繁殖與呼吸綜合征抗體ELISA檢測(cè)試劑盒進(jìn)行符合率、敏感性（Dse）、特異性（Dsp）、批內(nèi)重復(fù)性（Re）比較分析，以期了解國產(chǎn)試劑盒與進(jìn)口試劑盒在試驗(yàn)結(jié)果上的差異性。結(jié)果顯示：通過對(duì)45份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)金諾試劑盒檢測(cè)敏感性（Dse）為84%，檢測(cè)特異性（Dsp）為100%，2種試劑盒總符合率為91.11%。該研究結(jié)果為實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征抗體提供了試劑盒選用參考。

關(guān)鍵詞豬繁殖與呼吸綜合征；抗體檢測(cè)；ELISA；Kappa檢驗(yàn)；比較

中圖分類號(hào)S 85文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611（2023）24-0078-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.24.017

Comparative Analysis of Two Kinds of Antibody ELISA Kit for Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome

WANG Chuanfeng，MI Qingjie，PI Zhiyuan

（Yili Vocational and Technical College，Yining，Xinjiang 835000）

AbstractTwo kinds of ELISA Kit for porcine reproductive and respiratory syndrome antibody were selected to compare the coincidence rate，sensitivity （Dse），specificity （Dsp） and inbatch repeatability （Re），in order to understand the differences of experimental results between domestic and imported kits. The results showed that the detection sensitivity （Dse） and detection specificity （Dsp） of Jinnuo kit to 45 clinical samples were 84% and 100%，respectively. The total coincidence rate of the two kinds of kits was 91.11%. The study results provided references for the selection of laboratory kits for the detection of antibodies to porcine reproductive and respiratory syndrome.

Key wordsPorcine reproductive and respiratory syndrome;Antibody detection;ELISA;Kappa test;Comparison

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種接觸性傳染病。臨床表現(xiàn)主要以母豬出現(xiàn)流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎等現(xiàn)象，仔豬出現(xiàn)呼吸極度困難、咳嗽等癥狀［1］。豬繁殖與呼吸綜合征的傳播速度極快，特別是在發(fā)達(dá)國家豬群密集，更容易被傳染［2］。

近年來，隨著我國生豬存欄量的日益增加，加上交通運(yùn)輸業(yè)的蓬勃發(fā)展，生豬的流通日趨快捷，這都為豬繁殖與呼吸綜合征的傳播與流行提供了便利條件，同時(shí)也給動(dòng)物疫病防控工作提出了新的挑戰(zhàn)。豬繁殖與呼吸綜合征的流行不僅會(huì)給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且會(huì)對(duì)人類健康和生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生潛在威脅［3］。

借助科學(xué)的動(dòng)物疫病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)，定期監(jiān)測(cè)疫病是防控 PRRS的最有效措施。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA） 是目前應(yīng)用最普遍的一種血清學(xué)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于疫病抗體水平的檢測(cè)［4］，具有靈敏性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)。目前，市場(chǎng)上已開發(fā)多種檢測(cè)PRRSV的商品化 ELSIA 試劑盒，但大部分都缺乏科學(xué)、規(guī)范的評(píng)價(jià)［5］。為篩選適用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的試劑盒，該研究根據(jù)《傳染病診斷方法的驗(yàn)證原則》［6］ 以及《出入境動(dòng)物檢疫診斷試劑盒質(zhì)量評(píng)價(jià)規(guī)程》［7］ 的要求，對(duì)國產(chǎn)和進(jìn)口PRRS抗體 ELISA 試劑盒進(jìn)行符合率、敏感性、特異性、批內(nèi)重復(fù)性比較分析，以期為ELISA試劑盒的選用提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑。

1.1.1.1金標(biāo)試劑盒。進(jìn)口豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體檢測(cè)試劑盒（IDEXX Q161）。

1.1.1.2參比試劑盒。國產(chǎn)豬繁殖與呼吸綜合征抗體ELISA試劑盒（金諾試劑盒 20210510）。

1.1.2樣品。

1.1.2.1病原血清。PRRSV血清：強(qiáng)陽性血清12份，弱陽性血清13份，陰性血清20份。

1.1.2.2特異性驗(yàn)證用血清。PRRSV病原抗體陰性且其他病原抗體陽性血清10份：PCV2 2份，PEDV 2份，PRV gE 2份，Mhp 2份，CSFV 2份。

1.1.3儀器與設(shè)備。酶標(biāo)儀（深圳雷杜RT-6000）、96孔自動(dòng)洗板機(jī)（山東博科BK-9622）、微量移液器（德國Eppendorf）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（天津泰斯特DH124D）。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1符合率的測(cè)定。按照 ELISA 試劑盒的操作說明書對(duì)45份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，以IDEXX試劑盒檢測(cè)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，按照《傳染病診斷方法的驗(yàn)證原則》［6］中規(guī)定的方法對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分別計(jì)算金諾試劑盒的檢測(cè)敏感性（Dse）和檢測(cè)特異性（Dsp）。采用Kappa統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，計(jì)算金諾試劑盒檢測(cè)結(jié)果的Kappa值，從而評(píng)價(jià)檢測(cè)結(jié)果的符合率。當(dāng)Kappa值為0.81～1，說明2種試劑盒完全符合；當(dāng)Kappa值為0.61～0.80，說明2種試劑盒檢測(cè)結(jié)果高度符合；當(dāng)Kappa值為0.41～0.60，說明2種試劑盒檢測(cè)結(jié)果中度符合；當(dāng)Kappa值為0.21～0.40，說明2種試劑盒檢測(cè)結(jié)果比較符合；當(dāng)0

檢測(cè)敏感性（Dse）=a/（a+c）×100%

檢測(cè)特異性（Dsp）=d/（b+d）×100%

Po=（a+d）/（a+b+c+d）

Pe=［（a+c）/（a+b+c+d）］×［（a+b）/（a+b+c+d）］+［（b+d）/ （a+b+c+d）］×［（c+d）/（a+b+c+d）］

Kappa=（Po-Pe）/（1-Pe）

Kappa值應(yīng)大于等于0.6，Kappa值越接近1.0，符合率越高。

1.2.2敏感性檢測(cè)。

將不同來源的強(qiáng)陽性血清2份，弱陽性血清1份，進(jìn)行1×、2×、4×、8×、16×、32×、64×、128×倍比稀釋后，再用不同試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。每個(gè)血清、每個(gè)稀釋度進(jìn)行單孔檢測(cè)。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，比較2種試劑盒檢測(cè)抗體的最低檢測(cè)限，比較2種試劑盒的檢測(cè)敏感性。

1.2.3特異性檢測(cè)。

選取常見豬病各病原（PEDV、CSFV、PCV2、PRV gE、Mhp）抗體陽性血清10份，每份血清樣品做單孔檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，判定試劑盒是否與其他病原標(biāo)準(zhǔn)陽性血清有交叉反應(yīng)。

1.2.4批內(nèi)重復(fù)性的測(cè)定。選取豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體陽性血清6份、陰性血清2份，共8份樣品進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)試劑盒每個(gè)樣品做單孔檢測(cè)，重復(fù)同一批次的3次檢測(cè)。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果的S/P值，分別計(jì)算2種試劑盒S/P值的變異系數(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1檢測(cè)敏感性、特異性及符合率選擇采集不同時(shí)期的血清，通過對(duì)45份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，2種試劑盒PRRSV抗體檢測(cè)結(jié)果見表2，金諾試劑盒與IDEXX試劑盒的比較見表3。由表2～3可知，與IDEXX試劑盒相比，金諾試劑盒檢測(cè)敏感性（Dse）為84%，檢測(cè)特異性（Dsp）為100%；2種試劑盒總符合率為91.11%，Po=0.911 1，Pe=0.496，Kappa =0.824，說明2種試劑盒檢測(cè)完全符合。

2.2敏感性分析

根據(jù)表2檢測(cè)結(jié)果，選取不同S/P值的3份陽性血清進(jìn)行1×、2×、4×、8×、16×、32×、64×、128×倍比稀釋。選擇2種試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，比較2種試劑盒的檢測(cè)敏感性。結(jié)果顯示：2種試劑盒的抗體檢測(cè)結(jié)果與稀釋度成正比，詳見表4。

強(qiáng)陽性血清樣品（血清編號(hào)532）IDEXX和金諾試劑盒的最高稀釋倍數(shù)分別為64×和32×；陽性血清樣品（血清編號(hào)518）IDEXX和金諾試劑盒的最高稀釋倍數(shù)分別為4×和1×；弱陽性血清樣品（血清編號(hào)576）IDEXX和金諾試劑盒的最高稀釋倍數(shù)分別為2×和未檢出；IDEXX試劑盒的檢測(cè)敏感性高于金諾試劑盒（表5）。

2.3特異性分析

用2種試劑盒對(duì)PEDV、CSFV、PCV2、PRV gE、Mhp病原共10份陽性血清進(jìn)行檢測(cè)，每種病原各2份血清。結(jié)果顯示：PRRSV抗體全部呈陰性，均無交叉反應(yīng)，說明金諾試劑盒和IDEXX試劑盒特異性良好，具體見表6。

2.4批內(nèi)重復(fù)性分析

用相同批次的IDEXX試劑盒和金諾試劑盒對(duì)6份豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體陽性血清和2份陰性血清（血清編號(hào)分別為811和111）進(jìn)行3次重復(fù)檢測(cè)。結(jié)果顯示：2種試劑盒重復(fù)性較好，陰性血液樣本S/P值均小于0.4。每種試劑盒進(jìn)行3次重復(fù)檢測(cè)，陽性血清樣品S/P值整體一致（圖1）。

陽性樣品的IDEXX試劑盒和金諾試劑盒3次檢測(cè)的S/P值變異系數(shù)平均值分別為13.05%和15.85%，說明IDEXX試劑盒批內(nèi)重復(fù)性均較好，金諾試劑盒批內(nèi)重復(fù)性不如IDEXX試劑盒（表7）。

3討論

目前商品化檢測(cè)試劑盒眾多，但質(zhì)量評(píng)估方法并不完善，只能在使用時(shí)通過主觀判斷或者簡(jiǎn)單的數(shù)據(jù)對(duì)比來評(píng)估試劑盒的檢測(cè)效果［8］。阮周曦等［9］利用4種ELISA試劑盒開展豬繁殖與呼吸綜合征抗體水平監(jiān)測(cè)和免疫效果評(píng)估，結(jié)果顯示4種試劑盒的Kappa值均大于0.90，但不同試劑盒的檢測(cè)時(shí)長有差異，在檢測(cè)工作中應(yīng)根據(jù)具體情況合理選擇試劑盒。

該試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果表明，從敏感性來看，與金諾試劑盒相比，IDEXX試劑盒更加靈敏，金諾試劑盒檢測(cè)敏感性（Dse）為84%，檢測(cè)特異性（Dsp）為100%，特異性良好；總符合率為91.11%，Po=0.911 1，Pe=0.496，Kappa =0.824，說明2種試劑盒特異性高度一致，IDEXX試劑盒敏感性高于金諾試劑盒。

多年來，ELISA檢測(cè)方法被廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室的多種檢測(cè)項(xiàng)目［10］。能否刺激機(jī)體產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)都需要進(jìn)行免疫效果的評(píng)估，采取積極有效的評(píng)估方法對(duì)于檢驗(yàn)豬場(chǎng)的疫苗免疫效果十分重要。實(shí)驗(yàn)室可從檢測(cè)目的、檢測(cè)成本及試劑盒操作流程簡(jiǎn)化程度等方面綜合考慮，選擇相應(yīng)的試劑盒。該試驗(yàn)旨在了解2種PRRSV抗體檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)效果，為從事相關(guān)檢測(cè)工作的科研人員提供數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)，從而更好地為臨床檢測(cè)工作服務(wù)。

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