NFATc3敲除對(duì)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的影響及其潛在靶基因的初步篩選

楊菁,關(guān)貴文,張婷,王競(jìng)州,陳香梅,*

(1 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院,新疆 石河子 832000;2 北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系,北京 100191)

NFATc3是活化T細(xì)胞核因子(nuclear factor of activated T cells,NFAT)家族成員之一,廣泛表達(dá)于淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞,以及心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞等多種組織細(xì)胞中。作為一種轉(zhuǎn)錄因子,NFATc3可調(diào)控腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF α)、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)和干擾素(interferon,IFN)等多種細(xì)胞因子的表達(dá)[1],參與機(jī)體免疫應(yīng)答[2]、血管生成、細(xì)胞增殖、細(xì)胞侵襲遷移等過(guò)程的調(diào)控[3]。研究發(fā)現(xiàn),NFATc3基因異常表達(dá)與乳腺癌、肝癌、胰腺癌、胃癌和血液腫瘤等多種惡性腫瘤發(fā)生有關(guān)[4]。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),NFATc3在肝癌組織中的異常低表達(dá)與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5]。在肝細(xì)胞中,NFATc3可直接結(jié)合到IFNβ1和IFNλ1基因啟動(dòng)子區(qū)的固有識(shí)別序列,并協(xié)同RIG-I信號(hào)通路轉(zhuǎn)錄激活I(lǐng)FN表達(dá),進(jìn)而發(fā)揮抑制HBV復(fù)制和抗腫瘤的功能。但NFATc3在肝癌細(xì)胞中調(diào)控的潛在靶基因及在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用尚未完全闡明。

本研究采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA sequencing,RNA-Seq)技術(shù)檢測(cè)了NFATc3基因敲除對(duì)肝癌細(xì)胞系SMMC7721轉(zhuǎn)錄組的影響,并對(duì)NFATc3可能調(diào)控的靶基因進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析和初步驗(yàn)證。本研究結(jié)果將為明確NFATc3調(diào)控的靶基因及尋找新的抗肝癌治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與主要試劑

肝癌細(xì)胞系Huh7、SMMC7721購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù),HepG2細(xì)胞購(gòu)自ATCC細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM購(gòu)自Gibco公司;胎牛血清、青-鏈霉素雙抗試劑和胰酶購(gòu)自Thermo公司;轉(zhuǎn)染試劑 lipo2000 和Lipofectamine RNAiMAX以及Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen 公司;PCDH-NFATc3 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建;細(xì)胞蛋白裂解液 RIPA 購(gòu)自上海碧云天公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量試劑購(gòu)自南京諾唯贊公司;引物由上海生工生物公司合成;NFATc3抗體購(gòu)自Proteintech公司;β-tubulin抗體購(gòu)自北京普利萊公司;HRP標(biāo)記的鼠、兔二抗購(gòu)自LI-COR公司;化學(xué)發(fā)光顯影試劑購(gòu)自Thermo公司。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞使用胰酶消化后接種到培養(yǎng)板中,待細(xì)胞生長(zhǎng)至60%～80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。先將質(zhì)粒/siRNA和轉(zhuǎn)染試劑與opti-DMEM培養(yǎng)基分別孵育5 min,兩者混勻孵育20 min,結(jié)束后將混合液加入細(xì)胞培養(yǎng)板中,每組設(shè)置3個(gè)細(xì)胞復(fù)孔。轉(zhuǎn)染4～6 h后,更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)所用siRNA詳見表1。

表1 siRNA序列名稱及序列

1.3 蛋白印跡法(Western Blot)

檢測(cè)總蛋白表達(dá)水平細(xì)胞培養(yǎng)六孔板每孔加入200 μL細(xì)胞蛋白裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1),按照說(shuō)明書從細(xì)胞中提取總蛋白,并檢測(cè)每組蛋白的濃度。

取相等適量的蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),電泳結(jié)束后將蛋白從凝膠中電轉(zhuǎn)到PVDF膜上,之后將膜放在5% 脫脂奶粉中,室溫封閉2 h。封閉結(jié)束后,使用抗體雜交帶孵育NFATc3和β-tubulin的抗體(用TBST按1∶1 000比例稀釋),4 ℃孵育過(guò)夜;第二天,TBST緩沖液洗膜3次,每次10 min;使用雜交帶孵育相應(yīng)種屬的二抗(用TBST按1∶1 000比例稀釋),室溫孵育2 h;TBST洗膜3次,每次10 min。最后滴加化學(xué)發(fā)光顯色液,放入化學(xué)發(fā)光儀中,按照儀器操作流程設(shè)置相關(guān)參數(shù)后,曝光拍照,保存圖片后分析數(shù)據(jù)。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)mRNA表達(dá)水平

使用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline,PBS) 清洗細(xì)胞2遍。每孔加入1 mL Trizol 細(xì)胞裂解液,按照說(shuō)明書從細(xì)胞中提取總 RNA,并檢測(cè)RNA 的純度和濃度。

按照說(shuō)明書,將RNA 轉(zhuǎn)錄成cDNA并進(jìn)行qRT-PCR操作。取2 μL逆轉(zhuǎn)錄好的cDNA作為反應(yīng)模板,按照2 × SYBR Green 480 反應(yīng)液 10 μL、上、下游引物各1 μL和ddH2O 6 μL配制反應(yīng)mix;使用羅氏480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀以:95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性30 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸;40個(gè)循環(huán)數(shù)為反應(yīng)條件。采用2-ΔCt方法,以actin作為內(nèi)參計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。所涉及到的定量引物見表2。

表2 引物序列匯總表

1.5 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

分別在HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染PCDH-vector或PCDH-NFATc3和pGL3-S100A8或pGL3-S100A9質(zhì)粒,并以Actin-Renilla質(zhì)粒作為內(nèi)參;轉(zhuǎn)染36 h后棄去培養(yǎng)基,并用PBS漂洗2次,每孔加入250 μL 1x Passive lysis buffer充分裂解細(xì)胞,10 000 rpm離心10 min,吸取25 μL上清加入96孔全白不透光檢測(cè)板中,在各孔中加入25 μL Luciferase Assay Reagent A試劑,檢測(cè)熒光值A(chǔ);隨后加入25 μL Stop&Glo終止反應(yīng),檢測(cè)熒光值B,計(jì)算A/B的比值以比較相對(duì)熒光素酶活性。

1.6 RNA-seq測(cè)序分析

收集有或無(wú)仙臺(tái)病毒(SeV)感染的NFATc3基因穩(wěn)定敲除SMMC7721細(xì)胞株及其對(duì)照細(xì)胞,使用Trizol 試劑提取細(xì)胞的總RNA。RNA測(cè)序由美吉生物完成。Hisat2(2.2.1)[6]用于讀取映射,htseq-count用于計(jì)算基因count值[7]。

使用edgeR包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了歸一化,并進(jìn)行差異表達(dá)基因(different expression genes,DEGs)分析,選擇FDR<0.01且|Fold Change|>1.5作為DEGs的篩選條件。使用STRING在線數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.string-db.org/)[8]將DEGs繪制蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)(Protein-Protein Interaction Networks,PPI)圖。

1.7 GO和KEGG富集分析

對(duì)于功能富集分析,將所有DEGs映射到基因本體(Gene Ontology,GO)數(shù)據(jù)庫(kù)中的通路,然后以P<0.05為閾值在DEG中搜索顯著豐富的GO項(xiàng)。GO項(xiàng)分析分為3個(gè)亞組,即生物過(guò)程(BP)、細(xì)胞成分(CC)和分子功能(MF)。所有DEGs均映射到京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù),并在P<0.05為閾值搜索顯著富集的KEGG通路。

1.8 數(shù)據(jù)庫(kù)分析

TCGA(The Cancer Genome Atlas)數(shù)據(jù)庫(kù)中肝癌組織信息下載于MEXPRESS (https://mexpress.be)。利用Kaplan-Meier Plotter (www.kmplot.com)進(jìn)行基因表達(dá)預(yù)后分析。利用JASPAR在線數(shù)據(jù)庫(kù)(https://jaspar.genereg.net/)和ALGGEN-PROMO數(shù)據(jù)庫(kù)(http://alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3)預(yù)測(cè)基因結(jié)合序列并驗(yàn)證結(jié)合位點(diǎn)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究中涉及的統(tǒng)計(jì)分析采用R(4.2.1)軟件進(jìn)行。兩組間的差異分析使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。定量數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SEM)方法表示。P<0.05則認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。其中ns表示無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;*表示P<0.05;**表示P<0.01;***表示P<0.001;****表示P<0.000 1。

2 結(jié)果

2.1 NFATc3敲除細(xì)胞的RNA-seq分析

本研究前期用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建了NFATc3基因穩(wěn)定敲除SMMC7721細(xì)胞株,命名N3-KO細(xì)胞株,對(duì)照細(xì)胞為N3-WT[5]。為探究NFATc3對(duì)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組影響,對(duì)N3-WT組(WTM)和N3-KO組(KOM)細(xì)胞進(jìn)行RNA-seq檢測(cè)。主成分分析圖和小提琴圖結(jié)果顯示(圖1A,圖1B),兩組樣本組內(nèi)一致性較好,兩組間差異明顯。根據(jù)測(cè)序結(jié)果共篩選到677個(gè)DEGs(圖1C,圖1D),其中N3-KO細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)DEGs有153個(gè)(up,1.5倍差異),表達(dá)下調(diào)DEGs有524個(gè)(down,1.5倍差異)。隨后,我們對(duì)上述DEGs進(jìn)行了GO和KEGG分析。結(jié)果顯示,NFATc3基因穩(wěn)定敲除影響的DEGs主要富集在代謝、細(xì)胞外基質(zhì)、分泌和血管生成等GO通路中,并富集在細(xì)胞外基質(zhì)、腫瘤、病毒感染和PI3K-Akt等KEGG通路中(圖1E,圖1F)。

A.SMMC 7721 N3-WT組和SMMC 7721 N3-KO組RNA-seq測(cè)序結(jié)果的PCA圖,藍(lán)色三角代表SMMC 7721 N3-WT組(WTM),橙色點(diǎn)代表SMMC 7721 N3-KO組(KOM)。B.WTM和KOM組細(xì)胞RNA-seq測(cè)序結(jié)果小提琴圖分析。C.WTM和KOM組細(xì)胞RNA-seq測(cè)序結(jié)果火山圖分析。D.WTM和KOM組細(xì)胞RNA-seq測(cè)序DEGs熱圖分析。E.WTM和KOM組細(xì)胞RNA-seq測(cè)序DEGs的GO富集分析。F.WTM和KOM組細(xì)胞RNA-seq測(cè)序DEGs的KEGG富集分析。圖1 N3-KO和N3-WT細(xì)胞的RNA-seq測(cè)序分析

2.2 SeV感染下NFATc3敲除細(xì)胞的RNA-seq分析

本研究前期發(fā)現(xiàn),NFATc3敲除減弱了RIG-I信號(hào)通路對(duì)IFN表達(dá)的轉(zhuǎn)錄激活作用。提示NFATc3可以協(xié)同RIG-I信號(hào)通路調(diào)控肝癌細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)。仙臺(tái)病毒(Sendai virus,SeV)是一類雙鏈RNA病毒,可引起天然免疫RIG-I樣受體(RIG-I like receptors,RLRs)以及下游信號(hào)分子活化,導(dǎo)致干擾素和炎性因子的產(chǎn)生。SeV作為一個(gè)經(jīng)典的模式病毒,已經(jīng)被廣泛用于研究天然免疫通路的激活和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。為了進(jìn)一步探究NFATc3敲除對(duì)SeV感染激活天然免疫后肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的影響,我們對(duì)SeV感染24 h后的N3-WT組(WTS)及N3-KO組(KOS)細(xì)胞也進(jìn)行了RNA-seq檢測(cè)。結(jié)果顯示,兩組樣本的組內(nèi)一致性較好,兩組間差異明顯(圖2A,圖2B)。根據(jù)測(cè)序結(jié)果共篩選到1598個(gè)DEGs(圖2C,圖2D),其中表達(dá)上調(diào)DEGs有636個(gè)(up,1.5倍差異),下調(diào)DEGs有962個(gè)(down,1.5倍差異)。GO和KEGG富集分析結(jié)果顯示,DEGs主要富集在發(fā)育和對(duì)維生素的反應(yīng)等GO通路中,并富集在腫瘤、代謝、和PI3K-Akt等KEGG通路中(圖2E,圖2F)。

A.SeV處理24 h的SMMC 7721 N3-WT組(WTS)和SMMC 7721 N3-KO組(KOS)RNA-seq測(cè)序結(jié)果的PCA圖,藍(lán)色三角代表SMMC 7721 N3-WT組(WTS),橙色點(diǎn)代表SMMC 7721 N3-KO組(KOS)。B.WTS和KOS組細(xì)胞RNA-seq測(cè)序結(jié)果小提琴圖分析。C.WTS和KOS組細(xì)胞RNA-seq測(cè)序結(jié)果火山圖分析。D.WTS和KOS組細(xì)胞RNA-seq測(cè)序DEGs熱圖分析。E.WTS和KOS組細(xì)胞RNA-seq測(cè)序DEGs的GO富集分析。F.WTS和KOS組細(xì)胞RNA-seq測(cè)序DEGs的KEGG富集分析。圖2 SeV感染的N3-KO和N3-WT細(xì)胞的RNA-seq測(cè)序分析

為了篩選在肝癌細(xì)胞中受NFATc3調(diào)控同時(shí)又在RIG-I信號(hào)通路激活后調(diào)控仍然存在的潛在靶基因,我們對(duì)有和無(wú)SeV感染激活天然免疫的N3-WT和N3-KO細(xì)胞RNA-seq的DEGs進(jìn)行交集分析,共計(jì)獲得449個(gè)DEGs(圖3A)。其中,有30個(gè)基因在GO數(shù)據(jù)庫(kù)中被注釋為免疫相關(guān)基因,包括10個(gè)NFATc3敲除后上調(diào)的基因和20個(gè)下調(diào)的基因(圖3B)。對(duì)這30個(gè)免疫相關(guān)基因使用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)(Protein-protein interaction network,PPI)分析(圖3C)。

A.有或無(wú)SeV處理的SMMC 7721 N3-WT組和SMMC 7721 N3-KO組RNA-seq DEGs取交集的韋恩圖。B.交集中30個(gè)免疫相關(guān)基因的表達(dá)水平熱圖。C.免疫相關(guān)DEGs的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖。圓圈代表各個(gè)蛋白,線條代表兩個(gè)蛋白之間的相互作用。圖3 有或無(wú)SeV感染的SMMC 7721 N3-KO RNA-seq DEGs交集

結(jié)果顯示GAPDH、小分子肽S100鈣結(jié)合蛋白A8(S100 calcium binding protein A8,S100A8)和小分子肽S100鈣結(jié)合蛋白A9(S100 calcium binding protein A9,S100A9)處于PPI網(wǎng)絡(luò)的核心位置。既往文獻(xiàn)報(bào)道,S100A8和S100A9[9]參與炎癥過(guò)程和免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)[10],并且在腫瘤生長(zhǎng)中起重要作用[11]。而無(wú)論有無(wú)SeV處理NFATc3敲除均能上調(diào)S100A8和S100A9的表達(dá)水平,提示S100A8和S100A9可能是NFATc3在肝癌細(xì)胞中下調(diào)的重要下游靶基因。

2.3 S100A8/S100A9是NFATc3負(fù)調(diào)控的潛在靶基因

為驗(yàn)證NFATc3對(duì)S100A8和S100A9表達(dá)的影響,首先采用qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NFATc3基因穩(wěn)定敲除SMMC7721 N3-KO及其對(duì)照N3-WT細(xì)胞株S100A8和S100A9 mRNA水平。結(jié)果顯示,敲除NFATc3基因后,S100A8和S100A9 mRNA水平均顯著上調(diào)(圖4A)。我們?cè)诟伟┘?xì)胞系Huh7細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染了靶向NFATc3 mRNA的si-NFATc3和對(duì)照siRNA,Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染si-NFATc3顯著降低了Huh7細(xì)胞內(nèi)源NFATc3蛋白水平,而qRT-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)敲減NFATc3顯著上調(diào)了S100A8和S100A9 mRNA水平(圖4B)。此外,我們?cè)趦?nèi)源NFATc3表達(dá)較低HepG2細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染PCDH-NFATc3及PCDH-vector對(duì)照質(zhì)粒,Western blot實(shí)驗(yàn)表明轉(zhuǎn)染PCDH-NFATc3顯著上調(diào)了HepG2細(xì)胞內(nèi)的NFATc3蛋白水平,而qRT-PCR實(shí)驗(yàn)顯示過(guò)表達(dá)NFATc3降低S100A8和S100A9 mRNA水平(圖4C)。為探究NFATc3是否可直接調(diào)控S100A8和S100A9基因的轉(zhuǎn)錄,通過(guò)JASPAR在線數(shù)據(jù)庫(kù),對(duì)S100A8和S100A9啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,S100A8和S100A9基因啟動(dòng)子區(qū)分別存在10個(gè)、7個(gè)NFATc3的結(jié)合位點(diǎn)(圖4D)。

A.SMMC7721 N3-KO和N3-WT細(xì)胞株的S100A8和S100A9 mRNA水平。B.Huh7細(xì)胞中敲減NFATc3后S100A8和S100A9 mRNA水平。C.HepG2細(xì)胞過(guò)表達(dá)NFATc3后S100A8和S100A9 mRNA水平。D.S100A8和S100A9啟動(dòng)子區(qū)上NFATc3的結(jié)合位點(diǎn)。E.雙熒光報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)NFATc3對(duì)S100A8或S100A9啟動(dòng)子區(qū)活性影響。T test,**表示P<0.01;***表示P<0.001;****表示P<0.000 1。圖4 NFATc3可能的靶基因S100A8/S100A9的驗(yàn)證

進(jìn)一步在HepG2中分別轉(zhuǎn)染含有S100A8或S100A9啟動(dòng)子區(qū)序列的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒(PGL3-S100A8或PGL3-S100A9)及PCDH-vector或PCDH-NFATc3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒,以Actin-Renilla作為內(nèi)參。雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)NFATc3后S100A8和S100A9啟動(dòng)子區(qū)熒光素酶活性均下調(diào)且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,提示轉(zhuǎn)錄因子NFATc3可能通過(guò)直接結(jié)合S100A8和S100A9的啟動(dòng)子區(qū)從而負(fù)向調(diào)控S100A8和S100A9表達(dá)。

2.4 S100A8/S100A9異常表達(dá)促進(jìn)肝癌的進(jìn)展

為了探究S100A8/S100A9在肝癌發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮的作用,我們利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù),分析了S100A8/S100A9在肝癌組織中的表達(dá)。結(jié)果表明,肝癌組織和癌旁組織中S100A8(P<0.000 1)和S100A9(P=0.012 8)均存在顯著差異(圖5A)。此外,利用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步分析后發(fā)現(xiàn),S100A8(P=0.032)、S100A9(P=0.000 13)和S100A8+S100A9(P=0.000 023 )高表達(dá)與肝癌患者的不良預(yù)后有關(guān)(圖5B)。上述結(jié)果提示,S100A8和S100A9在肝癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮促癌作用[12-17]。

A.TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中S100A8/S100A9 mRNA表達(dá)水平。B.基于Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)中S100A8、S100A9或S100A8+S100A9 mRNA水平繪制的肝癌患者總生存曲線。T test,*表示P<0.05;****表示P<0.0001。圖5 肝癌中S100A8/S100A9的表達(dá)水平及預(yù)后

3 討論

肝癌是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一,但其發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制目前尚未完全闡明。我們前期研究發(fā)現(xiàn),NFATc3可以上調(diào)肝細(xì)胞中IFNβ1和IFNλ1表達(dá)從而發(fā)揮抑制HBV復(fù)制和抗肝癌雙重作用,且NFATc3低表達(dá)與肝癌患者不良預(yù)后有關(guān),提示NFATc3發(fā)揮抑癌作用[5]。作為一種轉(zhuǎn)錄因子,NFATc3蛋白活化入核后往往需要以同源或異源二聚體的形式與其它轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合,協(xié)同發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。在免疫細(xì)胞中,NFATc3主要轉(zhuǎn)錄激活I(lǐng)L-6、IL-10、IL-12、TNF-α和IFN-γ等細(xì)胞因子。但在其他組織細(xì)胞中,已經(jīng)確定的NFATc3靶基因較少。本研究首次采用RNA-seq技術(shù),對(duì)敲除NFATc3基因的SMMC7721細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析,并發(fā)現(xiàn)S100A8和S100A9可能是受NFATc3負(fù)調(diào)控的下游靶基因。

研究發(fā)現(xiàn),NFATc3的缺失或低表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[18-19]。NFATc3可通過(guò)負(fù)調(diào)控Ras-JNK1/2-AP-1通路抑制小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH3T3的增殖活性[20],而且在Nfatc3基因敲除的小鼠中更易發(fā)生淋巴腫瘤與乳腺腫瘤。我們前期研究也發(fā)現(xiàn),NFATc3在肝癌組織中呈顯著低表達(dá),體外實(shí)驗(yàn)表明NFATc3可抑制肝癌細(xì)胞的增殖和遷移能力。已有文獻(xiàn)報(bào)道,NFAT家族蛋白具有調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、免疫應(yīng)答、細(xì)胞凋亡及血管生成等功能[2,21],但NFATc3異常表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞的功能影響目前尚未明確。本研究發(fā)現(xiàn),在肝癌細(xì)胞中敲除NFATc3基因后,其影響的宿主基因功能主要富集在發(fā)育、代謝、細(xì)胞外基質(zhì)和血管生成等GO通路以及細(xì)胞外基質(zhì)、代謝、病毒感染、腫瘤和PI3K-Akt等KEGG通路中。上述GO以及KEGG通路都與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),提示NFATc3基因敲除可能通過(guò)影響肝癌細(xì)胞的發(fā)育、代謝、腫瘤與免疫等通路相關(guān)基因,進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用。

為了篩選受NFATc3轉(zhuǎn)錄調(diào)控的潛在靶基因,我們將有無(wú)SeV感染的兩組RNA-seq篩選到的DEGs做了交集分析,這部分基因代表的是受NFATc3調(diào)控且在SeV感染下仍然發(fā)生表達(dá)差異的宿主基因。鑒于NFATc3具有抗HBV感染和抗肝癌細(xì)胞增殖的作用,二者均與宿主細(xì)胞的免疫功能有關(guān),我們選取了DEGs交集中的30個(gè)免疫相關(guān)基因,進(jìn)行了PPI蛋白互作分析。我們發(fā)現(xiàn)S100A8、S100A9位于網(wǎng)絡(luò)互作圖的核心位置,且敲減或過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)均證實(shí)NFATc3可以下調(diào)肝癌細(xì)胞中S100A8、S100A9的表達(dá)。S100A8/S100A9屬于S100蛋白家族成員,二者通常以異二聚體的形式存在。S100A8/S100A9不僅參與炎癥反應(yīng),而且還在多種自身免疫病以及癌癥發(fā)展中發(fā)揮重要作用[10]。在食管鱗狀細(xì)胞癌中,S100A8/A9在腫瘤細(xì)胞和腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞中均呈高表達(dá)[13,22],并可通過(guò)激活A(yù)kt和p38 MAPK信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[23]。在DEN誘導(dǎo)的小鼠肝癌模型中,S100A9基因敲除小鼠的腫瘤細(xì)胞增殖減少[17]。外源性表達(dá)S100A9可激活MAPK/c-Jun信號(hào)通路,促進(jìn)肝癌細(xì)胞的體外增殖和侵襲[24]。上述結(jié)果提示,S100A8/A9二聚體可能通過(guò)影響肝臟腫瘤微環(huán)境,增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移/侵襲等能力,從而促進(jìn)肝臟腫瘤發(fā)生[12]。通過(guò)qRT-PCR實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)NFATc3可以負(fù)調(diào)控S100A8和S100A9的mRNA水平,同時(shí)S100A8和S100A9啟動(dòng)子區(qū)均存在多個(gè)NFATc3的潛在結(jié)合位點(diǎn)([T]GGAAA),且雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)NFATc3能下調(diào)S100A8和S100A9的啟動(dòng)子區(qū)活性,提示NFATc3可通過(guò)影響S100A8和S100A9的啟動(dòng)子區(qū)活性從而負(fù)向調(diào)控S100A8和S100A9的表達(dá)。但是,NFATc3是否通過(guò)與S100A8和S100A9的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合還需通過(guò)ChIP實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。此外,已有文獻(xiàn)報(bào)道NFATc3可以與多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子如AP1、GATA4和FOXP3等結(jié)合,協(xié)同發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用[25]。因此,NFATc3是否結(jié)合并協(xié)同負(fù)向調(diào)控S100A8和S100A9基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄因子,進(jìn)而抑制S100A8和S100A9表達(dá)也需未來(lái)深入探究?，F(xiàn)有S100A8/A9特異性抑制劑帕奎莫德(Paquinimod),可通過(guò)結(jié)合S100A9并抑制其與TLR4/MD2和RAGE的相互作用[26]。但S100A8/A9抑制劑在肝癌中的作用尚未見文獻(xiàn)報(bào)道,其是否可以用于肝癌治療的靶向藥物尚需更多的基礎(chǔ)及臨床探究。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞中敲除NFATc3基因主要影響發(fā)育、代謝、病毒感染、血管生成和PI3K-Akt等通路,且S100A8和S100A9可能作為NFATc3負(fù)調(diào)控的下游靶基因參與NFATc3的抗HBV和抗肝癌作用。本研究不僅為明確NFATc3的功能及調(diào)控靶基因提供理論依據(jù),也將為開發(fā)新的肝癌治療藥物提供潛在靶點(diǎn)。