青海漢族妊娠期高血壓疾病Flt-1基因rs722503多態(tài)性分子特征分析*

武 震,王 馳,宋盼盼,李玉靜,王雪妮,陳文靜,李建華**

(1.河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院,開封 475000;2.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部人體解剖學(xué)教研室,西寧 810016)

妊娠期高血壓疾病(hypertensive disorder of pregnancy,HDP)是產(chǎn)科常見并發(fā)癥,僅次于產(chǎn)后出血,是造成全球孕產(chǎn)婦死亡的第二大原因[1],包括妊娠期高血壓、子癇前期-子癇、妊娠合并慢性高血壓和慢性高血壓伴發(fā)子癇前期[2]。HDP在我國青海省的發(fā)病率約為12%～15%,遠(yuǎn)高于國內(nèi)及全球平均水平[3],但目前其發(fā)病機(jī)制仍不清,因此對(duì)孕婦進(jìn)行早期診斷、評(píng)估并及早制定預(yù)防措施尤為重要。一些研究顯示,可溶性Fms樣酪氨酸激酶1(soluble fms-like tyrosine kinase-1,sFlt-1)與HDP的發(fā)生相關(guān)[4-5],該因子由Fms樣酪氨酸激酶1(fms-like tyrosine kinase-1,Flt-1)基因表達(dá)。rs722503位于Flt-1基因內(nèi)含子10,存在A→G多態(tài)性,有國外學(xué)者研究指出該多態(tài)性與HDP發(fā)生相關(guān)[6-8],但國內(nèi)尚無針對(duì)rs722503與HDP之間關(guān)系的相關(guān)報(bào)道。本研究圍繞Flt-1基因,探討其表達(dá)及rs722503多態(tài)性與青海省漢族HDP的相關(guān)性,旨在為青海省HDP的防治工作提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2021年8月～2022年8月青海省人民醫(yī)院、青海紅十字醫(yī)院、西寧市第二人民醫(yī)院收治的漢族HDP患者143例(HDP組),年齡23～38(28.53±3.63)歲,孕周33～41(36.13±1.92)周。另選取同期住院的漢族正常妊娠孕婦133例為對(duì)照組,年齡23～36(27.91±3.71)歲,孕周34～42(37.45±2.34)周。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)研究對(duì)象均為青海省(平均海拔≥3000m,居住時(shí)間≥5年)居民;(2)自然受孕,單胎妊娠;(3)實(shí)驗(yàn)組患者均符合《妊娠期高血壓疾病診治指南(2020)》中HDP的診斷標(biāo)準(zhǔn)[2];(4)對(duì)照組孕婦臨床常規(guī)檢查結(jié)果均應(yīng)基本正常,如血壓、心電圖、血常規(guī)、生化指標(biāo)等。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)孕前已患原發(fā)性高血壓、心臟病、惡性腫瘤、甲狀腺功能亢進(jìn)或減退等;(2)患有肝炎、肺結(jié)核,梅毒、艾滋病等傳染性疾病;(3)妊娠前或妊娠期間有毒性、放射性物質(zhì)接觸史;(4)多胎妊娠或妊娠過程中合并其他對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有影響的疾患。本研究通過青海大學(xué)倫理協(xié)會(huì)審查,患者及家屬知情同意并自愿配合本調(diào)查研究。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本收集 HDP組在疾病診斷時(shí)收集標(biāo)本,對(duì)照組在入院待產(chǎn)時(shí)收集標(biāo)本。用EDTA抗凝采血管及一次性采血針抽取患者外周靜脈3mL,靜置30min,4℃、3500r/min離心15min,待血清與血細(xì)胞完全分離,分裝于EP管內(nèi),-80℃凍存?zhèn)溆谩山M各隨機(jī)收集30例胎盤組織,用外科手術(shù)于胎盤母體面剪取2cm3大組織,避開梗死、硬化區(qū),用生理鹽水沖洗至無肉眼可見血污后浸于RNAhold(北京全式金),24h內(nèi)放于凍存管,置液氮罐內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 核酸提取 使用EasyPure Blood Genomic DNA Kit(北京全式金)從血細(xì)胞中提取DNA。Trizol(Ambion,美國)法從胚胎組織中提取總RNA。使用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)(Thermo公司,美國)測(cè)定并記錄DNA及RNA的濃度與純度。使用1%瓊脂糖(北京全式金)凝膠電泳,Azure Biosystems C200凝膠成像系統(tǒng)(Azure Biosystems公司,美國)分析電泳結(jié)果,檢查DNA及RNA條帶完整性、有無拖尾、彌散。提取的DNA于-20℃保存,RNA于-80℃保存。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)與合成 基于Flt-1基因序列,使用Primer5.0設(shè)計(jì)覆蓋rs722503的特異性引物,上游:5'-TCCGCCTGCATTTTGAACAACTAAGTAG-3',下游:5'-GGTCTCCTTGGTATTCAAGCACACGTAA-3';使用PrimerBank查找Flt-1實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物,上游:5'-TTTGCCTGAAATGGTGAGTAAGG-3',下游:5'-TGGTTTGCTTGAGCTGTGTTC-3';β-actin上游:5'-TGGCACCCAGCACAATGAA-3',下游:5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3'。以上引物均由生工生物工程(上海)公司合成。

1.2.4 Flt-1基因rs722503多態(tài)性檢測(cè) 采用限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-RFLP)進(jìn)行Flt-1基因rs722503多態(tài)性檢測(cè)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體系25μL,包括12μL 2×Easy Taq PCR Super Mix(北京全式金),10μL Nuclease-Free Water,0.5μL上游引物和0.5μL下游引物,2μL模板DNA。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5min,94℃變性1min,52℃退火1min,72℃延伸40s,共33次循環(huán),最后72℃延伸5min。用2%瓊脂糖(北京全式金)凝膠電泳和Azure Biosystems C200凝膠成像系統(tǒng)(Azure Biosystems公司,美國)分析保存電泳結(jié)果。酶切反應(yīng)總體系25μL,包括6.5μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物,16μL Nuclease-Free Water,2μL 10×NEBuffer(NEB公司),0.5μL內(nèi)切酶AvaⅡ(NEB公司)。置GL-1800干式恒溫器(其林貝爾制造)37℃孵育20min,調(diào)節(jié)至80℃孵育20min熱失活。酶切產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠電泳(北京全式金)Azure Biosystems C200凝膠成像系統(tǒng)(Azure Biosystems公司,美國)分析保存電泳結(jié)果。取20μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,由生工生物工程(上海)公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.5 胎盤組織mRNA表達(dá)量測(cè)定 使用Trans Script One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒(北京全式金)將兩組總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA;以cDNA為模板,使用Trans Start Tip Green qPCR SuperMix試劑盒(北京全式金)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。用2-ΔΔCt法計(jì)算兩組胎盤組織中mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 血清sFlt-1水平測(cè)定 使用可溶性Fms樣酪氨酸激酶1(sFlt-1)ELISA試劑盒(江蘇酶標(biāo)生物科技),測(cè)定兩組血清sFlt-1水平。采用BIORAD iMark酶標(biāo)儀(BIORAD,美國)讀取A450數(shù)值。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品濃度。

2 結(jié) 果

2.1 人口學(xué)和臨床特征 HDP組的分娩時(shí)體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)、孕周、SP、DP與對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001);兩組的年齡、孕次、產(chǎn)次與對(duì)照組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1。

表1 HDP組和對(duì)照組一般臨床資料比較

2.2 Flt-1基因rs722503多態(tài)性檢測(cè) PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),目的片段長度為368bp,見圖1。rs722503存在A→G多態(tài)性,酶切后若基因型為AA,則酶切產(chǎn)物為1個(gè)條帶(368bp);若基因型為GG,則酶切產(chǎn)物為2個(gè)條帶(199bp,169bp);若基因型為AG,則酶切產(chǎn)物為3個(gè)條帶(368bp,199bp,169bp),見圖2。測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果,見圖3。

圖1 Flt-1基因rs722503PCR產(chǎn)物電泳圖M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);1～8:PCR產(chǎn)物

圖2 Flt-1基因rs722503酶切電泳圖M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);2、4、7:AA基因型;6:GG基因型;1、3、5:AG基因型

圖3 Flt-1基因rs722503多態(tài)性測(cè)序結(jié)果A:A堿基單峰,AA基因型;B:G堿基單峰,GG基因型;C:A和G堿基雙峰,AG基因型

2.3 兩組Flt-1基因rs722503基因型及等位基因頻率 HDP組與對(duì)照組Flt-1基因rs722503基因型頻率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.518,P<0.05),其中HDP組中AA基因型頻率高于對(duì)照組,GG基因型頻率低于對(duì)照組,AG基因型頻率低于對(duì)照組;HDP組與對(duì)照組等位基因頻率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.855,P<0.05),HDP組A等位基因頻率高于對(duì)照組,G等位基因頻率低于對(duì)照組。HDP組與對(duì)照組相比(OR=1.575,95%CI=1.089～2.277),A等位基因(OR=1.143,95%CI=1.024～1.275)是導(dǎo)致HDP發(fā)生的危險(xiǎn)因素,G等位基因(OR=0.726,95%CI=0.559～0.943)是避免HDP發(fā)生的保護(hù)因素;兩組聯(lián)合基因型分布頻率顯示,AA基因型(OR=1.756,95%CI=1.89～2.830)是導(dǎo)致HDP發(fā)生的危險(xiǎn)因素,見表2、3。兩組孕婦Flt-1基因rs722503基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡(P>0.05),樣本具有代表性,見表4。

表3 HDP組和對(duì)照組Flt-1基因rs722503聯(lián)合基因型分布頻率

表4 Flt-1基因rs722503基因型Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)

2.4 兩組胎盤組織Flt-1mRNA表達(dá)量和血清sFlt-1水平比較 HDP組胎盤組織中Flt-1mRNA相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.422,P=0.016)。HDP組血清sFlt-1水平(7.04±1.94)ng/mL高于對(duì)照組(2.92±1.02)ng/mL,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.083,P<0.001)。見圖4。

圖4 HDP組和對(duì)照組Flt-1mRNA相對(duì)表達(dá)量*P<0.05

2.5 HDP組Flt-1基因rs722503各基因型血清sFlt-1水平比較 HDP組Flt-1基因rs722503基因型AA、AG、GG血清sFlt-1水平分別為(12.10±6.49)ng/mL、(10.49±5.41)ng/mL、(7.70±5.69)ng/mL。各基因型之間血清sFlt-1水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=2.279,P>0.05)。

3 討 論

HDP是妊娠期特有疾病,其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,可能涉及人口、環(huán)境、基因、遺傳等多種因素。上述危險(xiǎn)因素可通過免疫調(diào)節(jié)及氧化應(yīng)激等機(jī)制使滋養(yǎng)細(xì)胞侵潤子宮內(nèi)膜、肌層及螺旋動(dòng)脈的能力下降[9-10],從而造成小動(dòng)脈重鑄數(shù)量減少和重鑄深度變淺(又稱“胎盤絨毛淺著床”),導(dǎo)致子宮動(dòng)脈血流阻力增加,胎盤灌注降低、缺血缺氧[11]。受到損害的胎盤釋放抗血管生成因子sFlt-1進(jìn)入母體循環(huán),造成全身內(nèi)皮細(xì)胞廣泛受損、小動(dòng)脈痙攣及血管內(nèi)小血栓形成,最終導(dǎo)致HDP發(fā)生[12]。研究表明,sFlt-1在胎盤的血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)體系中起到至關(guān)重要的調(diào)節(jié)功能,可控制各種病變的發(fā)生和發(fā)展[13]。VEGF家族是一類重要的內(nèi)皮生長素,可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的成長,激活毛細(xì)血管的形成,提高毛細(xì)血管的通透性[14]。目前已知在哺乳動(dòng)物中該家族共有5個(gè)成員:VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和胎盤生長因子(placental growth factor,PLGF)[15]。該家族的已知受體共有三種:Flt-1、胎肝激酶1(fetal liver kinase-1,Flk-1)和Flt-4。其中Flt-1可與VEGF-A、VEGF-B及PLGF結(jié)合,介導(dǎo)促進(jìn)血管的形成、重塑和再植及促絨毛細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的生物學(xué)功能[14]。

人類Flt-1基因位于第13號(hào)染色體長臂1區(qū)2帶,sFlt-1由Flt-1前體mRNA選擇性剪接及提前終止產(chǎn)生[16]。在蛋白層面上,sFlt-1是Flt-1的分泌性剪接變體,為抗血管生成因子,可抑制血管新生并且加速血管內(nèi)皮損傷[17-18]。與Flt-1相比,sFlt-1缺少了第7個(gè)免疫球蛋白樣的結(jié)構(gòu)域和激酶結(jié)構(gòu)域,而該結(jié)構(gòu)域是指導(dǎo)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的序列,因此sFlt-1缺乏細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶配體,sFlt-1可與Flt-1競爭結(jié)合VEGF,但不能將其信號(hào)傳到細(xì)胞內(nèi)[19],并且sFlt-1還能與Flt-1及Flk-1結(jié)合形成異源二聚體,完全阻斷VEGF的生物學(xué)活性,引起血管生成障礙并影響血管壁的完整性和通透性[20]。本研究顯示,正常孕婦與HDP患者胎盤組織中均存在Flt-1 mRNA,但HDP患者胎盤組織中Flt-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于正常孕婦,HDP患者血清sFlt-1水平明顯高于正常孕婦。劉靜芳等[21]對(duì)39例重度子癇前期患者和39例正常孕婦胎盤組織中Flt-1 mRNA表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示研究組(1.1325±0.0823)Flt-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組(0.8254±0.0752)。Triin等[22]對(duì)愛沙尼亞孕婦Flt-1基因rs4769613位點(diǎn)研究顯示,子癇前期患者胎盤組織中Flt-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量及血清sFlt-1水平均高于對(duì)照組,但該位點(diǎn)各基因型之間的Flt-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量及血清sFlt-1水平并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Akiko等[23]對(duì)日本孕婦的研究同樣顯示,HDP患者胎盤組織中Flt-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量及血清sFlt-1水平均高于對(duì)照組。上述研究均支持本實(shí)驗(yàn)結(jié)果。但Park等[24]對(duì)韓國12例正常孕婦及10例HDP患者的研究顯示,HDP患者胎盤組織Flt-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量與正常孕婦并無差異。

一些研究指出,Flt-1基因某些單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)可能影響轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的活性、功能及sFlt-1的表達(dá)水平[25-26],從而影響HPD的發(fā)病過程。如rs4769613位于Flt-1增強(qiáng)子區(qū)域,其C/T多態(tài)性可能影響基因轉(zhuǎn)錄,從而導(dǎo)致其表達(dá)受到影響[22]。rs722503位于Flt-1基因內(nèi)含子10中,屬于非編碼區(qū)SNP,但該SNP位于增強(qiáng)子和啟動(dòng)子組蛋白標(biāo)記以及許多細(xì)胞類型的脫氧核糖核酸酶1(DNase I)超敏位點(diǎn),并與調(diào)節(jié)基序的改變有關(guān)[27]。本研究顯示,rs722503多態(tài)性與青海省漢族HDP相關(guān),A等位基因和AA基因型可能是HDP發(fā)生的危險(xiǎn)因素,而G等位基因可能是避免HDP發(fā)生的保護(hù)因素。一項(xiàng)關(guān)于菲律賓人群的研究顯示[7],Flt-1 rs722503與≥40歲孕婦子癇前期的發(fā)生相關(guān),且在≥40歲以上孕婦中,所有擁有AA基因型的孕婦都患有子癇前期。Mona等[8]對(duì)于伊朗孕婦的研究結(jié)果也顯示,Flt-1基因rs722503多態(tài)性可能在子癇前期易感性中起重要作用,其中TT(AA)基因型(OR=1.53,95%CI=1.03～1.27,P=0.04)和T(A)等位基因(OR=1.41,95%CI=1.03～1.91,P=0.03)是HDP發(fā)生的危險(xiǎn)因素,而C(G)等位基因(OR=0.71,95%CI=0.52～0.96,P=0.03)是避免HDP發(fā)生的保護(hù)因素。Sindhu等[6]研究顯示,Flt-1基因rs722503單核苷酸多態(tài)性與美國白人孕婦子癇前期顯著相關(guān),其中A等位基因(OR=2.12,95%CI=1.07～4.19,P=0.03)為風(fēng)險(xiǎn)等位基因,但該研究同樣顯示,Flt-1基因中的等位基因變異與子癇前期患者血清sFlt-1水平升高無關(guān)。上述報(bào)道均與本研究結(jié)果相符。

本研究提示,Flt-1基因的rs722503多態(tài)性、胎盤組織Flt-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量及血漿sFlt-1蛋白水平均與青海省漢族HDP相關(guān)。目前國內(nèi)外關(guān)于Flt-1基因rs722503多態(tài)性意義的報(bào)道較少,且本研究對(duì)于該位點(diǎn)不同基因型的血清sFlt-1水平統(tǒng)計(jì)顯示,各基因型之間的血清sFlt-1水平并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。因此未來研究應(yīng)加大樣本的數(shù)量及廣度,納入不同地區(qū)、不同人群,圍繞rs722503的生物學(xué)功能,開展進(jìn)一步深入研究。