棉花黃萎病生防菌篩選鑒定及根瘤菌DG3-1對(duì)棉花生長的影響

關(guān)鍵詞：棉花：內(nèi)生細(xì)菌：棉花黃萎?。耗榭梗焊鼍鶧G3-1：促生

新疆是我國棉花的主要產(chǎn)區(qū)之一，也是我國棉花產(chǎn)量的重要來源，棉花作為最主要的經(jīng)濟(jì)作物已成為新疆經(jīng)濟(jì)發(fā)展不可缺少的一部分。棉花黃萎病是由大麗輪枝菌（Verticillium dahliae Kleb）引起的土傳真菌性病害，隨著連作年限的延長，棉花黃萎病發(fā)生也在不斷加劇，嚴(yán)重影響了棉花產(chǎn)量和品質(zhì)，已成為限制新疆棉花產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素。目前，輪作倒茬、抗病品種選育以及化學(xué)防治等是防治棉花黃萎病的主要措施。但棉花黃萎病菌能產(chǎn)生微菌核，而輪作并不能減少土壤中微菌核的數(shù)量，且抗病品種不易獲得，化學(xué)農(nóng)藥雖然在一定程度上可以減輕棉花黃萎病的危害，但其對(duì)生態(tài)的影響不容忽視。

利用內(nèi)生細(xì)菌防治棉花黃萎病已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。內(nèi)生細(xì)菌廣泛定殖于棉株各組織的細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間隙，并與植株建立了穩(wěn)定的互利共生關(guān)系。目前利用內(nèi)生細(xì)菌防治棉花黃萎病已有較多報(bào)道，周京龍等從健康棉株中分離得到一株蠟樣芽胞桿菌YUPP-10，能夠有效抑制棉花黃萎病的發(fā)生；Zabihullah Sherzad等從棉花根系中分離得到一株解淀粉芽孢桿菌，利用其發(fā)酵液浸泡種子，對(duì)棉花黃萎病的防治效果達(dá)到54.99%：金利容等從棉花莖部分離篩選出一株內(nèi)生細(xì)菌HB3S-20，對(duì)棉花黃萎病菌的平板抑制率達(dá)到47.30%，溫室防控效果達(dá)到60%以上。

分離篩選新型、高效的拮抗菌株是生物防治的基礎(chǔ)。本研究以南疆本地種植的健康棉花為研究對(duì)象，從不同組織中分離篩選對(duì)棉花黃萎病菌有良好拮抗效果的棉花內(nèi)生細(xì)菌，選取一株拮抗效果較好的根瘤菌DG3-1制備菌懸液，利用盆栽試驗(yàn)測定其對(duì)棉花生長的影響，以期為棉花內(nèi)生菌的開發(fā)利用提供菌種資源，為微生物肥料以及微生物菌劑的研發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

棉株：分別于2019年6月、2020年5月采自新疆阿拉爾市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所試驗(yàn)站，品種為新陸中70。

供試病原菌：大麗輪枝菌（Verticillium dahliaeKleb）由塔里木大學(xué)植物保護(hù)專業(yè)病理實(shí)驗(yàn)室提供。

培養(yǎng)基：NA培養(yǎng)基：1L水中加入牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、瓊脂15g，pH值7.3+0.1；LB培養(yǎng)基：1L水中加入胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、瓊脂粉15g、氯化鈉10g，自然pH值；PDA培養(yǎng)基：1L水中加入馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂15v，自然pH值。

主要試劑：Taq Master Mix、ddH2O、細(xì)菌16SrDNA通用引物27F/1492R、瓊脂糖等均購于生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2棉花內(nèi)生細(xì)菌的分離與保存

采用平皿組織分離法分離棉花不同組織的內(nèi)生細(xì)菌。將根、莖分別切成3～5cm小段，葉切成3x3cm2左右方塊；75%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇溶液浸泡30s，滅菌水沖洗2～3次，用3%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）NaClO溶液浸泡2～3min，滅菌水沖洗2～3次：然后將根和莖切成0.5cm左右的小段，葉片剪成0.5X0.5cm2的組織塊，用無菌手術(shù)刀將根、莖縱剖成兩半，剖面朝培養(yǎng)基放置；取最后一次洗滌滅菌水涂布于NA培養(yǎng)基作為對(duì)照，以確定棉株組織消毒是否徹底。將處理好的組織樣品分別按每皿5塊接種于NA培養(yǎng)基，重復(fù)3次，27℃培養(yǎng)，12h觀察一次；菌落長出后，采用平板劃線法對(duì)菌株進(jìn)行純化，黑暗條件下30℃培養(yǎng)12h：使用無菌接種環(huán)挑取單菌落接種于液體LB培養(yǎng)基，30℃、180r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)16h，吸取800uL菌液加入裝有800uL滅菌甘油（濃度50%）的2mL離心管中混勻，置于-80℃冰箱保存。

1.3棉花黃萎病拮抗細(xì)菌的篩選

采用平板對(duì)峙法，用無菌接種環(huán)挑取大麗輪枝菌菌絲接于PDA培養(yǎng)基正中央：在距離中心30mm相互垂直的四個(gè)方向，接種2uL供試細(xì)菌發(fā)酵液，靜置10～20min，黑暗條件下27℃恒溫倒置培養(yǎng)，以無菌水為對(duì)照：7d后觀察是否有抑菌圈產(chǎn)生，測量并記錄病原菌菌落直徑。內(nèi)生細(xì)菌對(duì)病原真菌的相對(duì)抑菌率（%）=（對(duì)照組病原真菌直徑一試驗(yàn)組病原真菌直徑）／對(duì)照組病原真菌直徑×100。相對(duì)抑菌率超過35%認(rèn)為有抑菌作用，超過50%認(rèn)為是優(yōu)勢(shì)內(nèi)生拮抗細(xì)菌。

1.4內(nèi)生拮抗細(xì)菌的鑒定

挑取純化兩次后干凈無污染的單菌落，與5uL無菌水混合，取1uL作為DNA模板，利用細(xì)菌16S rDNA基因通用引物，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，委托生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.5盆栽試驗(yàn)

菌懸液的制備：挑取供試菌株DG3-1的單菌落接于LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)12h，5000r/mln離心10min，棄上清，加入適量無菌水，繼續(xù)離心，重復(fù)3次，最后一次加入無菌水，與沉淀混勻即為菌懸液。

每盆種4粒棉花種子，恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待棉花長出1～2片真葉時(shí)，處理組（DG3-1）用4mL配制好的根瘤菌DG3-1菌懸液灌根，對(duì)照組（CK）澆灌等量無菌水，6個(gè)重復(fù)；之后每7d灌根一次；21d后測量棉花株高、鮮重、干重以及葉綠素含量等指標(biāo)。

葉綠素含量測定：準(zhǔn)確稱取0.1g棉花葉片，用去離子水洗凈，吸干表面水分后放入具塞試管中；加入80%丙酮溶液，加塞搖勻后室溫下避光浸提48h；吸取葉綠素丙酮提取液2mL，加等體積80%丙酮稀釋后，測定663.2、646.8nm波長下的吸光值，以80%丙酮溶液為空白對(duì)照。葉綠素含量。

2結(jié)果與分析

2.1棉花不同組織內(nèi)生細(xì)菌的分離

利用平皿組織分離法對(duì)棉花根、莖、葉中的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離、純化。如圖1所示，2019年分離獲得16株內(nèi)生細(xì)菌，根部、莖部、葉部分別獲得9、1、6株；2020年分離獲得15株內(nèi)生細(xì)菌，根部、莖部、葉部分別獲得8、3、4株?？梢娒藁ú煌M織內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量存在差異，根部相對(duì)較多。

2.2拮抗細(xì)菌對(duì)棉花黃萎病菌的抑制作用

從棉花不同組織中分離出31株內(nèi)生細(xì)菌，通過平板對(duì)峙試驗(yàn)篩選出11株對(duì)棉花黃萎病菌有拮抗作用（表1），相對(duì)抑菌率在35.99%～68.28%之間，有3株的相對(duì)抑菌率達(dá)到60%以上，具有開發(fā)為生防菌劑的潛力。部分拮抗效果見圖2。

2.3 拮抗細(xì)菌鑒定

利用細(xì)菌16SrDNA基因通用引物27F/1492R擴(kuò)增目的菌株片段。PCR產(chǎn)物利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，在WD-9413B型凝膠成像分析儀系統(tǒng)中成像并拍照（圖3）。PCR產(chǎn)物測序結(jié)果使用NCBI網(wǎng)站的在線BLAST與GenBank中已提交的相似序列進(jìn)行同源性比對(duì)。結(jié)果（表2）表明，具有拮抗效果的11株內(nèi)生拮抗細(xì)菌基因片段長度在1286～1462bp。根部6株，其中，芽孢桿菌屬4株，編號(hào)為DGI-1、XGI-4、XG2-1、XG3-1，DGl-1菌株序列與蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus，登錄號(hào)MN543738.1）同源性100.00%，XGI-4與遲緩芽孢桿菌（Bacillus lentus，登錄號(hào)LS483476.1）同源性99.86%，XG2-1與蠟樣芽孢桿菌（登錄號(hào)FJ483513.1）同源性99.72%，XG3-1與解淀粉芽孢桿菌（Ba-cillLLS amyloliquefaciens，登錄號(hào)MK521053.1）同源性99.93%;根瘤菌屬2株，編號(hào)為DG3-1、XG4-（1），DG3-1與根瘤菌（Agrobacterium salini-tolerans，登錄號(hào)MK949137.1）同源性100.00%，XG4-（1）與根瘤菌（Rhizobium sp.，登錄號(hào)MK092996.1）同源性99.78%。莖部2株，均為芽孢桿菌屬，編號(hào)為DJ3-1、XJ1-1，其中，DJ3-1與解淀粉芽孢桿菌（登錄號(hào)JF460751.1）同源性99.86%、XJ1-1與貝萊斯芽孢桿菌（Bacillusvelezensis，登錄號(hào)MN938176.1）同源性99.65%。葉部3株，均為芽孢桿菌屬，編號(hào)為DY3-1、DY3-2、XY3-（1），其中，DY3-1與蠟樣芽孢桿菌（登錄號(hào)MT974192.1）同源性99.86%，DY3-2與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，登錄號(hào)KF836534.1）同源性99.72%，XY3-（1）與蘇云金桿菌（BacillusthuringiensLs．登錄號(hào)MT492022.1）同源性99.93%。

2.4根瘤菌DG3-1對(duì)棉花生長的影響

盆栽試驗(yàn)結(jié)果（表3）表明，與CK相比，使用DG3-1菌懸液灌根處理后棉花株高提高9.38%：地上部鮮重、地上部干重、地下部鮮重、地下部干重分別增加2.12、2.29、1.05、0.75倍；葉綠素含量提高1.75倍。表明DG3-1菌株對(duì)棉花生長有一定的促進(jìn)作用。

3討論與結(jié)論

微生物防治是利用有益微生物或其代謝產(chǎn)物來防治和控制植物病害的方法，對(duì)植物和環(huán)境友好，分離和篩選新型的有益微生物是提高生物防治效果的有效途徑。本研究利用組織分離法對(duì)棉花不同組織內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生細(xì)菌在棉花的根、莖、葉中普遍存在，且根部菌株數(shù)量最多，莖部最少，與羅明等的研究中棉花內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量在種子中最多，其次是根、莖、葉的分布規(guī)律有差異，可能與棉花的品種、生育期、樣本數(shù)量以及消毒方式等因素有關(guān)。

利用棉花內(nèi)生菌防治棉花病害的優(yōu)勢(shì)在于，內(nèi)生菌存在于棉花組織中，占據(jù)有利于防治病害的生態(tài)位，且能順利定殖。棉花組織內(nèi)有豐富的拮抗菌資源，已有多項(xiàng)研究報(bào)道棉花內(nèi)生菌對(duì)棉花黃萎病菌有抑制活性或防治作用。周燚等從棉花維管束組織中分離出對(duì)棉花黃萎病有防治效果的解木聚糖類芽孢桿菌YUPP-1，經(jīng)質(zhì)粒標(biāo)記發(fā)現(xiàn)其能在棉株中順利定殖：張瓊等從棉花根系分離得到的貝萊斯芽孢桿菌SZADI能顯著減輕棉花黃萎病的發(fā)生：張金鳳等從棉花根部分離出的解淀粉芽孢桿菌4IB-IR，不但能減輕棉花黃萎病的危害，還能有效提高棉花幼苗對(duì)棉花黃萎病的抗性。本研究篩選出11株對(duì)棉花黃萎病菌具有拮抗活性的菌株，經(jīng)鑒定其中9株隸屬芽孢桿菌屬，2株屬根瘤菌屬，對(duì)棉花黃萎病菌的平板抑菌率在35.99～68.28%之間，其中有些菌株表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性，具有作為生防菌的潛力。然而內(nèi)生拮抗菌在皿內(nèi)試驗(yàn)表現(xiàn)出良好的拮抗作用是不夠的，如何將微生物應(yīng)用在大田中，且在田間試驗(yàn)中仍表現(xiàn)出穩(wěn)定的防病效果，以更好地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐，也是下一步的研究方向。

根瘤菌雖常與豆科植物共生，但也有研究表明其也能作為非豆科植物的根際有益菌促進(jìn)植物生長。目前已有研究證明根瘤菌可在非豆科植物中定殖，且表現(xiàn)出明顯的促生作用。王平等通過外源標(biāo)記基因特異性檢測技術(shù)測定華癸根瘤菌在水稻、小麥、油菜和棉花4種非豆科作物根圈的定殖能力，發(fā)現(xiàn)其不僅能在這4種植物根圈定殖，并且對(duì)棉花和油菜根系生長有一定影響，顯著促進(jìn)水稻生長。本研究從棉花根部篩選鑒定出2株根瘤菌，其中菌株DG3-1對(duì)棉花黃萎病菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的拮抗活性，抑菌率為（56.63+1.82）%，用DG3-1菌懸液并對(duì)棉花進(jìn)行灌根處理后，棉株地上鮮重、地上干重、地下鮮重、地下干重、葉綠素含量均高于對(duì)照組，表明其具有一定的促生作用。本試驗(yàn)僅測定了DG3-1對(duì)棉花部分生長指標(biāo)的影響，其對(duì)棉花的促生能力，如何在棉株中定殖，以及相關(guān)促生機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究從棉花不同組織中分離獲得11株對(duì)棉花黃萎病菌具有抑制活性的菌株，其中9株為芽孢桿菌屬，2株為根瘤菌屬。根瘤菌DG3-1對(duì)棉花黃萎病菌具有較強(qiáng)的拮抗能力，并且對(duì)棉花的生長具有促進(jìn)作用，兼具抑菌和促生能力，可為研發(fā)防治棉花黃萎病的生防制劑提供菌種資源。在棉花黃萎病的生物防治中，棉花內(nèi)生菌有良好的應(yīng)用前景，但要將生防菌株應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)，還要考慮到其是否能夠在棉株中穩(wěn)定定殖、繁殖等因素，關(guān)于根瘤菌與非豆科植物的相互作用機(jī)理以及應(yīng)用仍需進(jìn)一步研究。