小菜蛾幼蟲生防菌株毒力測定及產(chǎn)毒條件優(yōu)化

關(guān)鍵詞：小菜蛾幼蟲；生防菌株篩選；毒力測定；粉紅粘帚霉；產(chǎn)毒條件優(yōu)化

小菜蛾（Plutella xylostellaL．）隸屬于鱗翅目菜蛾科菜蛾屬，又稱小青蟲、兩頭尖，為害白菜、蘿卜等十字花科蔬菜最為嚴(yán)重。它啃食蔬菜葉片，導(dǎo)致葉片變成網(wǎng)狀，品質(zhì)下降，銷售受到影響。小菜蛾一直在我國南方省份嚴(yán)重發(fā)生，導(dǎo)致許多蔬菜作物失去原有價(jià)值，一些地區(qū)甚至顆粒無收，種植戶們苦不堪言，已成為一種亟待防治的主要害蟲之一。

目前，已從化學(xué)防治、物理防治、生物防治以及一些農(nóng)業(yè)防治等領(lǐng)域?qū)π〔硕甑姆乐巫龀鲅芯?，其中生物防治是較為高效且對(duì)人畜低毒或無毒的防治方法。有研究表明，蠟蚧輪枝菌（Ver-ticilliu.m lecanii）、球孢白僵菌（Beauveria bassi-ana）及金龜子綠僵菌（Metarhizium anisopliae）菌劑的10倍稀釋液對(duì)小菜蛾都具有很好的防治效果。但關(guān)于粉紅粘帚霉（Clonostachys rosea）、淡紫擬青霉（Purpureocillium lilacinum）、02號(hào)生赤殼屬（Bionectria sp.）菌株防治小菜蛾的研究還未見報(bào)道。粉紅粘帚霉作為一種在世界范圍內(nèi)廣泛分布的絲狀真菌，具有很高的生防潛力。它是自然界中一類重要的寄生真菌，可寄生于植物、昆蟲和線蟲活體內(nèi)，也是一種重要的重寄生菌，除了用于防治蟲害外，還可用于防治病害且防治效果較好。蘆俊佳等曾對(duì)粉紅粘帚霉防治楚雄腮扁葉蜂幼蟲進(jìn)行過研究，發(fā)現(xiàn)其具有較好的防治效果。同時(shí)，也有一些研究表明，粉紅粘帚霉對(duì)植物生長具有促進(jìn)作用。淡紫擬青霉是很多植物寄生線蟲的重要天敵，是一種極具推廣潛力的生防菌和功能菌。孫漫紅等曾報(bào)道過淡紫擬青霉M-14具有很強(qiáng)的殺線蟲活性。Lopez等通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)淡紫擬青霉對(duì)棉花蚜蟲有較強(qiáng)防效。02號(hào)生赤殼屬菌株首次被發(fā)現(xiàn)是在對(duì)紅豆杉（Taxus chinensis var. maLrez）內(nèi)生真菌的研究中，被歸類為生赤殼科，一系列抑菌試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)并證明其代謝產(chǎn)物具有明顯的抗菌作用。

真菌的產(chǎn)毒與培養(yǎng)環(huán)境息息相關(guān)，比如培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)基pH值、培養(yǎng)時(shí)間、光照條件、振蕩培養(yǎng)條件等，對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化有利于生防真菌的進(jìn)一步開發(fā)利用和害蟲防治。本研究選用粉紅粘帚霉、淡紫擬青霉、02號(hào)生赤殼屬菌株對(duì)小菜蛾幼蟲進(jìn)行噴霧浸染，首先篩選出對(duì)小菜蛾生防效果較好的高毒力菌株，繼而測定其對(duì)小菜蛾的半致死濃度（LC50）和半致死時(shí)間（LT50），優(yōu)化其產(chǎn)毒條件，以期為小菜蛾的生物防治提供新的微生物資源，為高毒力菌株的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1供試菌株粉紅粘帚霉SWFUYOO、02號(hào)生赤殼屬菌株SWFUY02、淡紫擬青霉SWFUY08來源于云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2供試蟲源3齡小菜蛾幼蟲購于濟(jì)源白云實(shí)業(yè)有限公司。

1.1.3儀器與試劑TGL-16G型臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品：GXM-358A型光照培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠產(chǎn)品：XB-K-25型血球計(jì)數(shù)板，上海求精生化試劑儀器有限公司產(chǎn)品；MQW-63R型振蕩培養(yǎng)箱，上海曼泉儀器有限公司產(chǎn)品。其他試劑均為分析純。

1.1.4培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dex-trose agar，PDA）培養(yǎng)基：葡萄糖20g，瓊脂粉20g，馬鈴薯200g，蒸餾水1000mL。馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基（potato sucrose agar，PSA）：蔗糖20g，瓊脂粉20g，馬鈴薯200g，蒸餾水1000mL。察氏液體培養(yǎng)基（Czapek）：KN03 2g，KCl0.5g，F(xiàn)eS040.01g，K2 HP041g．MgS04.7H2 00.5g，蒸餾水1000mL。薩氏葡萄糖瓊脂酵母膏（Sachs dex-trose agar yeast，SDAY）：酵母浸粉20g，葡萄糖40g，蛋白胨10g，蒸餾水1000mL。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)及方法

本試驗(yàn)于2023年2月在西南林業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院實(shí)驗(yàn)室與云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2.1凍存菌株活化培養(yǎng)活化培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。將凍存的粉紅粘帚霉、02號(hào)生赤殼屬、淡紫擬青霉進(jìn)行活化，每種菌株活化30皿，恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15～30d待用。

1.2.2孢子懸浮液制備取培養(yǎng)15～30d且長滿菌絲的培養(yǎng)皿，用含吐溫80的無菌水進(jìn)行洗脫，多次攪拌，過濾菌絲得到孢子懸浮液，將三種菌株孢子懸浮液均通過16格×25格血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)確定孢子濃度為1.0x108個(gè)孢子/mL。計(jì)算公式為：

孢子濃度（個(gè)/mL）=每小方格中孢子平均數(shù)x400x104×稀釋倍數(shù)。

1.2.3生防菌篩選采用噴霧法進(jìn)行。設(shè)置粉紅粘帚霉、淡紫擬青霉、02號(hào)生赤殼屬菌株為試驗(yàn)組，以無菌水為對(duì)照組，每組重復(fù)3次，每重復(fù)20頭3齡小菜蛾幼蟲。小菜蛾幼蟲先用無菌水噴霧處理消毒，處理后吸干水分，然后用三種菌株的孢子懸浮液（1.0x108個(gè)孢子/mL）對(duì)小菜蛾幼蟲進(jìn)行噴霧處理，將處理后的小菜蛾幼蟲連同蔬菜葉片一起放入墊有濕棉花和用無菌水濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，用透明保鮮膜封閉培養(yǎng)皿后再在透明膜上用針扎70個(gè)小孔。之后三種菌株分別做好標(biāo)記，對(duì)照組編號(hào)為CK，放人培養(yǎng)箱中恒溫恒濕培養(yǎng)，每隔6h觀察一次，記錄死亡蟲數(shù)并計(jì)算死亡率。

死亡率（%）=死亡蟲數(shù)／試驗(yàn)總蟲數(shù)×100；

校正死亡率（%）=（試驗(yàn)組死亡率一對(duì)照組死亡率）／（1-對(duì)照組死亡率）×100。

死亡判定標(biāo)準(zhǔn)：用細(xì)毛筆輕觸小菜蛾腹部，不動(dòng)者視為死亡。

觀察到部分死亡小菜蛾幼蟲尸體上長出菌絲后，挑出菌絲接到新的培養(yǎng)基上，置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～10d．觀察新長出菌株的形態(tài)特征，并與浸染生防菌株的形態(tài)特征進(jìn)行比較，確定小菜蛾幼蟲死因是生防菌株浸染所致。

1.3高毒力菌株毒力測定

對(duì)預(yù)先培養(yǎng)的生長良好的高毒力菌株進(jìn)行洗脫，確定孢子懸浮液濃度。設(shè)置測定半致死濃度的孢子懸浮液濃度梯度為1.0x104、1.0x105、1.0x106、1.0x107、1.0x108個(gè)孢子/mL。測定半致死時(shí)間的孢子懸浮液濃度為1.0x108個(gè)孢子/mL。制備好的孢子懸浮液用1.2.3的方法進(jìn)行處理，并觀察記錄數(shù)據(jù)。

1.4高毒力菌株產(chǎn)毒條件優(yōu)化

1.4.1不同培養(yǎng)基對(duì)高毒力菌株產(chǎn)毒的影響選用不加瓊脂的PDA培養(yǎng)基（以下用PDB表不）、PSA培養(yǎng)基、SDAY培養(yǎng)基、Czapek液體培養(yǎng)基進(jìn)行測定。挑取3塊5 mm的高毒力菌株菌餅放于配制好的培養(yǎng)基中，于黑暗條件下28℃、180r/min搖床中培養(yǎng)，7d后通過4層紗布和兩層濾紙過濾，8000r/min離心10min，上清液即為無菌絲的粗毒素。將提取出的粗毒素用噴霧法處理小菜蛾幼蟲，方法與1.2.3中的一致，每6h記錄一次小菜蛾幼蟲死亡數(shù)，計(jì)算校正死亡率。培養(yǎng)觀察期間分別以對(duì)應(yīng)的粗毒素保濕，對(duì)照采用無菌水處理。

1.4.2不同初始pH值對(duì)高毒力菌株產(chǎn)毒的影響

設(shè)置pH值為5、6、7、8、9共5個(gè)處理，以PDB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)7d后提取粗毒素，按1.4.1的方法進(jìn)行提取和處理小菜蛾幼蟲，并記錄數(shù)據(jù)。

1.4.3不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)高毒力菌株產(chǎn)毒的影響

設(shè)置3、5、7、9d和11d共5個(gè)培養(yǎng)日寸間，以PDB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別于不同培養(yǎng)時(shí)間提取粗毒素，按1.4.1的方法進(jìn)行提取和處理小菜蛾幼蟲，并記錄數(shù)據(jù)。

1.5數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理并作圖，用SPSS 26.0軟件中Duncan's新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性比較（Plt;0.05）。

2結(jié)果與分析

2.1生防菌株篩選

死亡小菜蛾幼蟲體表菌絲回接培養(yǎng)7～10d后觀察形態(tài)，發(fā)現(xiàn)從幼蟲體表長出的菌株形態(tài)和生長狀況與接種的菌株一致，表明小菜蛾幼蟲死因是受到接種菌株的浸染。小菜蛾幼蟲接種不同菌株的校正死亡率如圖1所示，粉紅粘帚霉SWFUYOO、02號(hào)生赤殼屬菌株SWFUY02、淡紫擬青霉SWFUY08對(duì)小菜蛾幼蟲均有致死作用，60h時(shí)累計(jì)校正死亡率分別為98.04%、47.06%和54.90%。綜合比較三種生防菌株對(duì)小菜蛾幼蟲的浸染致死率，發(fā)現(xiàn)粉紅粘帚霉對(duì)小菜蛾幼蟲的浸染致死作用較強(qiáng)。因此，選取粉紅粘帚霉進(jìn)行后續(xù)的毒力測定和產(chǎn)毒條件優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2高毒力菌株毒力測定

高毒力菌株粉紅粘帚霉SWFUYOO對(duì)小菜蛾幼蟲的致死情況如圖2所示。接種60h時(shí)，孢子懸浮液濃度為1.0x108個(gè)孢子/mL日寸小菜蛾幼蟲校正死亡率可達(dá)98%以上，濃度為1.0x104個(gè)孢子/mL時(shí)校正死亡率為63.33%?？芍〔硕暧紫x死亡率隨菌株孢子懸浮液濃度的增加而逐漸增高，致死率與孢子懸浮液濃度呈正相關(guān)。

選取孢子濃度為1.0x108個(gè)孢子/mL試驗(yàn)組數(shù)據(jù)（表1）計(jì)算得出，粉紅粘帚霉對(duì)小菜蛾幼蟲的半致死時(shí)間LT50為30.88h。根據(jù)顯著性最高時(shí)間段54h時(shí)小菜蛾幼蟲死亡率與孢子懸浮液濃度之間的回歸關(guān)系可得，粉紅粘帚霉對(duì)小菜蛾幼蟲的半致死濃度LC50為4.365x104個(gè)孢子/mL（表2）。

2.3高毒力菌株產(chǎn)毒條件優(yōu)化

2.3.1不同培養(yǎng)基對(duì)高毒力菌株產(chǎn)毒的影響四種培養(yǎng)基培養(yǎng)的粉紅粘帚霉毒素發(fā)酵濾液——粗毒素對(duì)小菜蛾幼蟲的致死力存在一定的差異，但均有毒殺作用（圖3）。其中，SDAY和PDB培養(yǎng)基粗毒素的毒殺作用較強(qiáng)，其次為PSA，Czapek的毒殺作用最弱?？梢?，四種培養(yǎng)基中SDAY和PDB較有利于粉紅粘帚霉產(chǎn)毒。

2.3.2不同初始pH值對(duì)高毒力菌株產(chǎn)毒的影響

以PDB為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，設(shè)置5、6、7、8、9共5個(gè)pH值梯度發(fā)酵培養(yǎng)并制備粉紅粘帚霉粗毒素。結(jié)果（圖4）顯示，各粗毒素對(duì)小菜蛾幼蟲都具有毒殺作用，但致死力存在顯著差異。粉紅粘帚霉粗毒素毒性隨pH值增大呈先增強(qiáng)后減弱趨勢，初始pH值為6時(shí)粗毒素毒殺作用最強(qiáng)，據(jù)此確定其最適產(chǎn)毒pH值為6。

2.3.3不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)高毒力菌株產(chǎn)毒的影響

以PDB為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，設(shè)置3、5、7、9d和11d共5個(gè)培養(yǎng)時(shí)間梯度發(fā)酵培養(yǎng)并制備粉紅粘帚霉粗毒素。結(jié)果（圖5）顯示，各粗毒素對(duì)小菜蛾幼蟲都有毒性，且隨培養(yǎng)時(shí)間延長呈先增強(qiáng)后減弱趨勢，以7d時(shí)毒力最強(qiáng)，9d和11d時(shí)減弱且兩者間差異不顯著。其原因可能是，粉紅粘帚霉在培養(yǎng)過程中逐漸分泌毒素，培養(yǎng)后期培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)減少，粉紅粘帚霉生長減緩，分泌的毒素隨之減少。據(jù)此，確定粉紅粘帚霉產(chǎn)毒的最適培養(yǎng)時(shí)間為7d。

3討論與結(jié)論

本研究中，供試三種生防菌株粉紅粘帚霉、淡紫擬青霉、02號(hào)生赤殼屬對(duì)小菜蛾幼蟲都具有毒殺作用。其中，粉紅粘帚霉對(duì)小菜蛾幼蟲的生防毒力最強(qiáng)，接種36h時(shí)小菜蛾幼蟲校正死亡率為58.37%，接種60h時(shí)為98.04%：淡紫擬青霉次之；生赤殼屬最弱。

半致死時(shí)間LT50和半致死濃度LC50是衡量生防菌株對(duì)寄主毒力的重要指標(biāo)。甄偉用濃度為107個(gè)孢子/mL的球孢白僵菌[Beauveria bassi-ana（Balsamo）

Vuillemin]處理小菜蛾幼蟲，6d時(shí)的校正死亡率為87.14%。劉曼等用貴州麻江白僵菌（Beauveria majiangensis）MJ1015菌株對(duì)三種金龜子幼蟲的毒力進(jìn)行測定發(fā)現(xiàn)，其LC50分別為4.75x106、1.29x107、2.78x107個(gè)孢子/mL，LT50范圍在3.86～13.3d之間。周立等篩選出兩株對(duì)斜紋夜蛾有高致病力的球孢白僵菌，其LT50分別為5.01d和5.98d，LC50分別為3.29×107、8.09x107個(gè)孢子/mL。本研究中，粉紅粘帚霉對(duì)小菜蛾幼蟲的LT50為30.88h，LC50為4.365×104個(gè)孢子/mL。同比可見，粉紅粘帚霉對(duì)小菜蛾幼蟲具有毒力高、致病速度快等特點(diǎn)，可作為小菜蛾生物防治的優(yōu)良微生物資源，下一步可對(duì)其進(jìn)行田間防效試驗(yàn)。

粉紅粘帚霉是自然界中一類重要的寄生菌，可寄生于植物、昆蟲和線蟲活體內(nèi)，也是一種重要的重寄生菌，除了防治蟲害，還可用于防治病害。許多研究表明，粉紅粘帚霉對(duì)草莓、番茄和玫瑰的灰霉病具有很好的防治效果。楊蕊等研究了粉紅粘帚霉對(duì)玉米莖基腐病的抑菌防病作用，發(fā)現(xiàn)其對(duì)玉米莖基腐病具有生防潛力，其孢子液還能在一定程度上提高種子的發(fā)芽率和單株鮮重。還有研究表明，粉紅粘帚霉和淡紫擬青霉具有促進(jìn)植物生長、產(chǎn)生多種功能酶和降解農(nóng)藥等作用，前者還有望被用于生產(chǎn)生物燃料，具有很大的開發(fā)前景。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，粉紅粘帚霉的最適產(chǎn)毒培養(yǎng)基為SDAY、PDB，最適產(chǎn)毒pH值為6，最適產(chǎn)毒培養(yǎng)時(shí)間為7d。本研究得出的粉紅粘帚霉的產(chǎn)毒優(yōu)化條件，可為其在生防上進(jìn)～步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。但本試驗(yàn)只選取了培養(yǎng)時(shí)間、初始pH值和培養(yǎng)基3個(gè)條件，更多條件的優(yōu)化還有待進(jìn)行：且本試驗(yàn)只研究了粉紅粘帚霉對(duì)小菜蛾幼蟲的毒殺作用，它在其他害蟲上的毒力情況還有待挖掘，后續(xù)可對(duì)其生防價(jià)值展開進(jìn)一步研究。