廣藿香PcGA2ox1基因克隆、VIGS載體構(gòu)建和表達分析

關(guān)鍵詞：廣藿香；赤霉素2-氧化酶（GA2ox）；基因克?。翰《菊T導(dǎo)基因沉默（VIGS）；表達分析

廣藿香[Pogostemon cablin（Blanco）Benth.]為唇形科刺蕊草屬植物，以干燥地上部分人藥，原產(chǎn)于東南亞菲律賓、馬來西亞等熱帶地區(qū)，宋朝時期傳人我國并在南方廣泛種植，道地產(chǎn)區(qū)主要分布在兩廣、嶺南等，故而有廣藿香之稱。廣藿香少有開花，很難結(jié)果，因而主要采用扦插方式繁殖，但扦插繁殖慢且易引起種質(zhì)退化，難以培育出優(yōu)質(zhì)品種。因此，通過促進側(cè)枝發(fā)育增加地上部分的比重，從而提高廣藿香產(chǎn)量，對選育品質(zhì)優(yōu)良的廣藿香意義重大。

赤霉素（gibberellins，GAs）是一種重要的植物內(nèi)源激素，調(diào)控植物生命周期的各個階段，在根莖葉伸長、側(cè)枝發(fā)育、花期調(diào)控、種子休眠等方面發(fā)揮作用。植物體內(nèi)的GAs分為有活性和無活性兩類，其中GA1和GA4為有活性類。GA20x（gibberellin 2-oxidases）作為赤霉素代謝途徑中的一個關(guān)鍵酶，可以將活性赤霉素（GAI和GA4）降解為無活性狀態(tài)，限制有生物活性GAs的含量，從而調(diào)節(jié)植物發(fā)育，如在擬南芥中阻止種子萌發(fā)、延遲無性繁殖、改變花期、限制主莖和側(cè)芽的伸長等。一般而言，植物體內(nèi)GA2ox過表達會使活性GAs含量降低，從而使植株表現(xiàn)為矮化，而將其沉默，則會促進莖的伸長和植株生長。目前已有眾多植物GA2ox基因被成功克隆并進行了相關(guān)研究，如GA2ox基因在油菜籽、早熟禾、油茶等植物中過表達呈現(xiàn)出矮化表征，生物量減少、開花延遲、葉片顏色呈深綠色等：相反，在煙草中沉默GA2ox可以顯著促進煙草生長和提高纖維產(chǎn)量。目前GA2ox基因在煙草、擬南芥、番茄等植物中已有研究，但未見廣藿香GA2ox基因的相關(guān)研究報道，為此，本研究基于本課題組前期獲得的廣藿香轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對其GA2oxl基因進行克隆和生物信息學(xué)分析，以探尋GA2ox基因在廣藿香中的作用，為后續(xù)研究矮化廣藿香、促進側(cè)枝發(fā)育和增加產(chǎn)量等提供有力依據(jù)。

病毒誘導(dǎo)基因沉默（VIGS）是一種利用植物的病毒防御機制來抑制特定侵襲性病毒轉(zhuǎn)錄物的基因沉默方式，是研究植物基因功能的強有力工具，與傳統(tǒng)的基因功能分析方法相比，VIGS具有沉默單個或多個基因家族成員的潛力，已被應(yīng)用于眾多研究領(lǐng)域，如在木薯、大豆、番茄等植物中利用VIGS技術(shù)進行抗病性研究：Wang等發(fā)現(xiàn)通過VIGS敲除GA中主要DELLA基因，可顯著增強棉花莖木質(zhì)部和韌皮部次生細胞壁的形成：利用VIGS沉默百合花藥的赤霉素上調(diào)基因LoMYB65，可導(dǎo)致花粉發(fā)育不正常，花粉量減少等。為探尋GA2ox基因在廣藿香中的沉默效應(yīng)，本實驗采用煙草脆裂病毒載體對廣藿香葉片進行VIGS侵染，以降低GA2oxl基因的表達水平，探究其對廣藿香表型的影響，以期為廣藿香優(yōu)良品種選育奠定理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1供試材料

組培苗培養(yǎng)：摘取經(jīng)廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院嚴寒靜教授鑒定為唇形科刺蕊草屬植物廣藿香Pogostemon cablin（Blanco）

Benth.的葉片接種于叢芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS+0.2mg/L 6-BA+0.1 mg/LNAA）上培養(yǎng)40d，然后選取生長健壯、長勢一致的不定芽接種于生根培養(yǎng)基（1/2MS）上培養(yǎng)60d，統(tǒng)一采用日光燈為光源，在25℃恒溫培養(yǎng)。

將生根培養(yǎng)60d的組培苗移栽水培兩周，然后移栽至混合土壤（普通土與營養(yǎng)基質(zhì)的體積比為1：1）繼續(xù)培養(yǎng)60d。選取生長良好的廣藿香葉片液氮速凍后用于提取總RNA;選取生長良好的廣藿香植株進行VIGS實驗，取第2．3對葉用于沉默基因表達量分析；選取廣藿香的根、莖（第2對葉與第3對葉之間）、葉（第2或第3對葉）、芽（頂芽），液氮速凍后存于-80℃冰箱，用于組織特異性表達分析。

所用菌株DH5a、農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞，購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司：EcoRI和Xhol快切酶購于寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；pTRV1、pTRV2載體為實驗室留存。

1.2實驗方法

1.2.1總RNA提取及cDNA合成根據(jù)不同實驗要求選用廣藿香不同組織部位材料，使用天根植物RNA prep Pure Plant試劑盒提取廣藿香總RNA，用超微量紫外分光光度計UV2450檢測總RNA純度和濃度，并使用瓊脂糖凝膠電泳法對其完整性進行檢驗。使用TaKaRa生物公司的Pri-meScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成廣藿香cDNA，于-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2廣藿香PcGA2oxl基因的克隆

基于課題組前期獲得的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，使用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計特異引物（表1）。以反轉(zhuǎn)錄得到的廣藿香cDNA為模板，設(shè)定PCR反應(yīng)體系：cDNA1uL，上游引物PcGA20xl-F，下游引物35個循環(huán)；72℃延伸2 min。產(chǎn)物經(jīng)膠回收后檢測純度和濃度，采用北京莊盟國際生物基因科技有限公司的克隆載體One step ZTOPO-Blunt/TA進行連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，將獲得的陽性單菌落送至北京擎科生物科技有限公司測序，檢查該序列是否為目標序列。

1.2.3PcGA2oxl的生物信息學(xué)分析

利用相應(yīng)的在線分析軟件（表2）對PcGA2oxl基因進行生物信息學(xué)分析，利用BLAST對不同植物的GA2ox氨基酸序列進行同源比對，運用MEGA-X軟件利用NJ法對不同植物GA2ox基因序列進行系統(tǒng)進化樹分析。

1.2.4VIGS實驗基于克隆得到的PcGA2oxl基因CDS序列，選取其中第344～558bp片段，利用SnapGene軟件設(shè)計引物（表1），引入EcoR I和Xhol兩個酶切位點，擴增PcGA2oxl基因215 bp片段，構(gòu)建VIGS載體。PCR擴增體系50PCR反應(yīng)條件同1.2.2，回收得到目的基因片段。

使用TaKaRa QuickCut限制酶進行pTRV2載體上的EcoRI和Xhol雙酶切，37℃反應(yīng)15min，切膠回收得到酶切產(chǎn)物，檢測濃度和純度后，將酶切產(chǎn)物與目的基因用莊盟生物的SE無縫克隆試劑盒進行無縫克隆，轉(zhuǎn)化DH5ce感受態(tài)細胞，測序正確后提取得到pTRV2-PcGA20xl質(zhì)粒。

分別將pTRV1、pTRV2和pTRV2-PcGA20xl質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞，涂布在LB培養(yǎng)基平板（含50mg/LKan，50 mg/LRif）上，恒溫培養(yǎng)箱28℃倒置培養(yǎng)24h，挑取單克隆菌經(jīng)PCR鑒定，隨即活化擴大培養(yǎng)陽性克隆菌，培養(yǎng)至菌液OD600值為1.0～1.5，重懸后用侵染液（10mmol/L MES、10mmol/L MgCl2、200umol/L AS）沉淀懸浮，于28℃恒溫培養(yǎng)箱遮光靜置3h，然后將pTRV1侵染液分別與pTRV2和pTRV2-Pc-GA2oxl侵染液按1：1混合，混勻后從葉背面注射侵染廣藿香第2對、第3對葉，于28 0C恒溫培養(yǎng)兩周后，按照不同組別采集廣藿香葉片用于基因表達量測定。

1.2.5PcGA20xl基因表達量測定使用PrimerPremier 5.0軟件設(shè)計VIGS沉默及組織特異性表達的qRT-PCR引物（表1），以18SrRNA為內(nèi)參基因，以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，使用SYBRGreen Premix Pro Taq PCR試劑盒和熒光定量PCR儀CFX96進行實時熒光定量PCR。使用20擴增體系：TB Green⑩Premix Ex TaqⅡ（TliRNaseH Plus）（2x），上、下游引物各0.4，模板cDNA 1.6 VL，雙蒸水（ddH20） 7.6。擴增程序：95℃ 30s;95℃ 5s，60℃ 30s，40個循環(huán)。每個樣品3次重復(fù)，采用2法計算VIGS沉默及不同組織部位的基因表達量，使用Prismchs軟件進行分析繪圖。

2結(jié)果與分析

2.1PcGA20xl基因克隆

根據(jù)前期獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，克隆得到Pc-GA20xl的CDS序列，并設(shè)計了特異性引物；以廣藿香cDNA為模板進行PCR擴增，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察到在500 bp左右位置形成了清晰的條帶（圖1）。經(jīng)過對比分析，目的片段與預(yù)期大小相符，由SnapGene測序驗證確認所得序列為完整的561bp的正確CDS序列。

2.2PcGA20xl基因的生物信息學(xué)特征

2.2.1PcGA2oxl蛋白理化性質(zhì)及親疏水性分析

ProParam預(yù)測結(jié)果（表3）顯示，PcGA20xl蛋白的分子式為C930 H1455 N255 0278 S10．分子量為20.98kDa，脂肪系數(shù)為83.87，為親水性的不穩(wěn)定弱酸性蛋白；酸性氨基酸殘基（Asp+Glu）總數(shù)為22，堿性氨基酸殘基（Arg+Lys）總數(shù)為19。ProtScale分析結(jié)果（圖2）表明，PcGA20xl氨基酸多肽鏈的親水性最大值為1. 467，最小值為-1.844．主要表現(xiàn)為親水性，與ProParam預(yù)測結(jié)果一致。

2.2.2PcGA2oxl蛋白跨膜結(jié)構(gòu)、信號肽及亞細胞定位預(yù)測TMHMM分析結(jié)果表明，PcGA20xl蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)。SignalP6.0未預(yù)測到信號肽裂解位點，推測PcGA2oxl蛋白不具有信號肽，屬于非分泌類蛋白。WoLF PSORT亞細胞定位預(yù)測結(jié)果表明．PcGA2oxl編碼蛋白主要定位在細胞核中。

2.2.3PcGA2oxl蛋白二級結(jié)構(gòu)結(jié)果（圖3）顯不，PcGA2oxl蛋白的二級結(jié)構(gòu)由55個a-螺旋、39個延伸鏈、15個轉(zhuǎn)角、77個無規(guī)則卷曲組成，占比分別為29.57%、20.97%、8.06%、41.40%。

2.2.4PcGA2oxl蛋白三級結(jié)構(gòu)利用SWISS-MODEL在線分析平臺構(gòu)建了PcGA2oxl蛋白可能的三級結(jié)構(gòu)模型（圖4），該模型的GMQE值為0.94，其氨基酸序列與珙桐（Nyssaceae）的模型序列相似度高達83.33%，表明對PcGA2oxl蛋白三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果較為可靠。

2.2.5PcGA20xl保守結(jié)構(gòu)域及系統(tǒng)發(fā)育分析在NCBI的CDD（Conserved Domain Database）數(shù)據(jù)庫搜索上傳的PcGA20xl氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)其具有GA20x家族保守的20G-FeⅡ_Oxy結(jié)構(gòu)域，表明其屬于GA20x基因家族（圖5）。

運用MEGA -X軟件的NJ法建立不同植物GA20xl基因序列進化樹，結(jié)果（圖6）顯示，Pc-GA2oxl與丹參GA2ox7同屬于一小支，相似度最高，達到99%，親緣關(guān)系最近；與荔波連蕊茶、煙草、番茄、碧冬茄的同源性也達到50%以上。

2.3病毒誘導(dǎo)PcGA2oxl基因沉默

pTRV2載體經(jīng)EcoRI和XhoI雙酶切后與PcGA2oxl同源臂PCR切膠回收產(chǎn)物連接，獲得pTRV2-PcGA2oxl重組質(zhì)粒，熱激法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，用VIGS法侵染廣藿香。被侵染的廣藿香培養(yǎng)兩周后，取葉片，通過qRT-PCR分析Pc-GA2oxl表達量的變化。以未侵染的葉片為空白對照，注射pTRV2空載的葉片為陰性對照。結(jié)果（圖7）顯示，被侵染的廣藿香葉片中PcGA2oxl表達量分別低于空白對照組和陰性對照組71%和83%，差異顯著，沉默效果明顯：空白對照組與陰性對照組之間沒有顯著差異，表明pTRV2空載不能影響廣藿香葉片GA2oxl基因的表達水平，說明GA2oxl基因在廣藿香中成功沉默。

2.4PcGA2oxl基因組織特異性表達分析

選取生長時間相同、長勢一致的廣藿香植株，對其根、莖、葉和芽中的PcGA2oxl基因表達量進行檢測，結(jié)果（圖8）顯示，PcGA2oxl基因在各組織中均有表達，但表達水平存在差異，以葉中的表達量最高，根中的表達量最低。

3討論

GAs的生物合成在高等植物生長發(fā)育過程中不可或缺，GAs代謝過程中有多種酶，這些酶會影響生物合成與分解之間的平衡，能維持特定發(fā)育階段生物活性水平，實現(xiàn)植物生長發(fā)育正常進行。GA2氧化酶使GAs羥基化，導(dǎo)致活性赤霉素鈍化為非活性形式，因此可以調(diào)節(jié)植物體內(nèi)赤霉素含量，影響植物生長過程。GA2ox是由多基因家族編碼的雙加氧酶，可分為三類，I類和Ⅱ類都作用于C19-GAs，I類使其失活，Ⅱ類使其前體失活；Ⅲ類作用于C20-GAs，使其2-羥基化。根據(jù)生物信息學(xué)分析及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹可知，廣藿香PcGA2oxl基因與丹參的GA2ox7相似度最高，達到99%，親緣關(guān)系最近；與荔波連蕊茶、煙草、番茄、碧冬茄也聚在一支，同源性達到50%以上。推測PcGA2oxl基因同上述植物的GA2ox基因相似，也屬于I類，催化C19-GAs失活，從而使具有生物活性的GA1和GA4失活。

研究表明，GA2ox基因在植物生長發(fā)育過程中存在組織特異性表達差異。大麥HvGA2oxl和HvGA20x3在成熟種子的節(jié)間和胚乳中高表達，HvGA2ox6主要在胚中表達：丹參SmGA20xl在花中的表達較高，SmGA20x4在根中的表達較高，SmGA2ox7在葉中高表達，SmGA2ox10在莖中高表達：而荔波連蕊茶CIGA2oxl基因在嫩枝和二年生莖段中的表達量最高，在幼葉中的表達量最低；萬壽菊GA2ox基因在莖及葉中的表達量較高．在種子中的表達量較低。表明不同物種GA2ox基因雖同源性較高，但功能存在差異。本研究結(jié)果表明，Pc-GA2oxl基因在廣藿香的根、莖、葉、芽中均有表達，以葉中的表達量最高，芽中的次之，根中的表達量最低，且其表達在根與葉、莖與葉、根與芽、莖與芽間均存在顯著性差異，具有一定的組織特異性。由此推測PcGA2oxl基因主要參與廣藿香葉、芽的生長發(fā)育。

由于易用性好和產(chǎn)生表型所需的時間短，VIGS被廣泛用于植物遺傳學(xué)中的基因沉默。在廣藿香中，靳巧春等利用VIGS技術(shù)沉默廣藿香醇合酶PcPTS基因，對其功能進行了鑒定，并初步建立了廣藿香的VIGS體系：楊豫章通過VIGS技術(shù)有效沉默了廣藿香基因，一定程度上影響了廣藿香中百秋李醇的生物合成：王小兵利用TRV病毒載體沉默廣藿香內(nèi)源PcPDS基因，使其表達量明顯下降，且觀察到葉片白化表型。本研究利用VIGS技術(shù)沉默廣藿香PcGA2oxl基因，qRT-PCR結(jié)果顯示，沉默兩周后，PcGA2oxl基因表達量與陰性對照相比顯著下降83%，與空白對照相比顯著下降71%。表明PcGA2oxl基因在廣藿香中被有效沉默。

已有研究表明，VIGS沉默技術(shù)用于GA20x基因上可促進莖節(jié)生長、新枝發(fā)育等，如：Joanna等利用VIGS技術(shù)沉默碧冬茄“夢幻藍”的GA2ox基因，基因沉默植株會表現(xiàn)出莖伸長：Li等在紫薇垂枝性狀機制研究時發(fā)現(xiàn)，VIGS誘導(dǎo)可降低GA信號傳導(dǎo)水平，使紫薇長出新枝。但本研究僅采用煙草脆裂病毒載體TRV使用注射法瞬時侵染廣藿香葉片，且調(diào)查時間短，尚未發(fā)現(xiàn)明顯表型變化，后續(xù)將延長侵染時間，觀察廣藿香生長的變化，并通過含量測定和激素水平分析等進一步探尋VIGS沉默PcGA2oxl基因是否對廣藿香生長發(fā)育產(chǎn)生影響。

4結(jié)論

本研究首次從廣藿香中克隆出PcGA2oxl基因，全長為561bp，編碼186個氨基酸，為親水性蛋白，具有GA2ox基因家族的保守結(jié)構(gòu)域，主要定位在細胞核。PcGA2oxl基因在廣藿香中的表達存在組織特異性，在葉中的表達量最高：利用VIGS技術(shù)成功沉默了PcGA2oxl基因，初步驗證了該基因的功能。本研究結(jié)果可為今后深入研究PcGA2oxl基因的功能、選育矮化廣藿香等奠定基礎(chǔ)。