基于主要滋味成分指紋圖譜和化學(xué)計(jì)量學(xué)鑒別海南不同地區(qū)咖啡豆

關(guān)鍵詞：咖啡豆；產(chǎn)地溯源；指紋圖譜；化學(xué)計(jì)量學(xué)

中圖分類(lèi)號(hào)：S571.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

咖啡（coffee）是一種茜草科（Rubiaceae）的熱帶植物，分布在23°26?N和23°26?S 之間的地區(qū)，有60 多個(gè)國(guó)家種植。在中國(guó)，咖啡主要生長(zhǎng)于云南和海南，小粒種和中粒種咖啡分別種植在這2個(gè)地區(qū)?？Х仁鞘澜缟献钪匾馁Q(mào)易產(chǎn)品之一，是廣受全球消費(fèi)者歡迎的飲料，并用作許多其他飲料和食品的添加劑，具有長(zhǎng)供應(yīng)鏈和高經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2021 年全國(guó)咖啡種植面積9.39 萬(wàn)hm²，同比下降4.58%；總產(chǎn)量10.91 萬(wàn)t，同比下降17.85%；農(nóng)業(yè)總產(chǎn)值26.51 億元，同比上漲15.22%。海南省咖啡面積、產(chǎn)量和農(nóng)業(yè)產(chǎn)值分別占全國(guó)的1.12%、0.36%和0.30%[2]。我國(guó)海南地區(qū)種植的咖啡品種主要為中粒種咖啡，通常具有濃而不苦，香而不烈的風(fēng)味特征。咖啡中除了碳水化合物、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等成分外，還富含生物堿類(lèi)（咖啡因和葫蘆巴堿）、綠原酸及二萜類(lèi)等成分，這些成分的存在使其具有抗菌、抗炎、抗氧化、降血糖血脂、神經(jīng)保護(hù)、抗抑郁及保肝護(hù)肝等功能特性[3]。

咖啡作為世界上最受歡迎的飲品之一，同時(shí)也是世界上消費(fèi)量最大的飲品，與世界各地?cái)?shù)十億人的生活密切相關(guān)。咖啡含有多種生物活性成分，包括生物堿（咖啡因、可可堿、茶堿、葫蘆巴堿）、多酚（綠原酸、類(lèi)黃酮、香豆素、木脂素）、碳水化合物、氨基酸、蛋白質(zhì)和脂類(lèi)[4]?？Х然钚猿煞忠彩强Х蕊L(fēng)味的前體物質(zhì)。隨著全球?qū)Ω咂焚|(zhì)咖啡的需求和對(duì)生產(chǎn)精品咖啡的興趣不斷增加，探究不同咖啡產(chǎn)區(qū)對(duì)咖啡品質(zhì)影響的研究已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。FASSIO 等[5]研究表明，咖啡豆的質(zhì)量受到不同產(chǎn)區(qū)的環(huán)境條件、作物管理、收獲和收獲后處理的顯著影響。由海拔和緯度決定的環(huán)境因素與飲料質(zhì)量密切相關(guān)，環(huán)境作用極大地影響了最終產(chǎn)品的質(zhì)量。因此，區(qū)分不同產(chǎn)區(qū)咖啡化學(xué)成分的差異對(duì)于咖啡鑒定研究至關(guān)重要。

本研究對(duì)海南不同產(chǎn)地6 種咖啡的滋味成分進(jìn)行研究。通常能夠被人們感知的咖啡基本滋味包括酸味、甜味、苦味和澀味。感官屬性對(duì)于最終咖啡飲品的質(zhì)量尤為重要，主要由咖啡中部分水溶性滋味成分形成，包括綠原酸、生物堿、有機(jī)酸、單糖、氨基酸等構(gòu)成咖啡滋味品質(zhì)的主要成分。這些物質(zhì)在進(jìn)入口腔后繼續(xù)與各類(lèi)受體結(jié)合相互作用，進(jìn)而形成的“味覺(jué)”圖像，即為滋味特征，又因各組分間組成、含量及交互作用的影響而使咖啡表現(xiàn)出不同的風(fēng)格?？Х蕊L(fēng)味對(duì)咖啡質(zhì)量至關(guān)重要，其主要由揮發(fā)性風(fēng)味組分和滋味組分兩部分組成，針對(duì)咖啡滋味組分化學(xué)組成，LANG 等[6]研究表明，咖啡具有明顯苦味，其中最重要的苦味成分為咖啡因，一種具有顯著藥理活性的甲基黃嘌呤生物堿，進(jìn)入人體后反饋出強(qiáng)烈的苦味刺激，對(duì)抑郁癥、心血管疾病和高血壓等具有防護(hù)作用。CORDOBA 等[7]報(bào)道指出，咖啡因、胡蘆巴堿和綠原酸還與咖啡的澀味有關(guān)。雖然烘焙咖啡豆中的滋味成分變換已經(jīng)得到了很好的研究，但關(guān)于產(chǎn)地對(duì)咖啡豆中滋味成分影響的信息尚缺乏。MIAO 等[8]研究表明不同產(chǎn)區(qū)咖啡豆滋味成分含量顯著不同，亞洲咖啡豆的類(lèi)黃酮含量顯著高于其他大洲的咖啡。南美和北美咖啡豆的還原糖含量顯著高于大洋洲咖啡豆。MEHARII 等[9]研究埃塞俄比亞4 個(gè)地理區(qū)域的生咖啡豆中可溶性和細(xì)胞壁結(jié)合多酚的濃度，已發(fā)現(xiàn)生咖啡豆的多酚含量因地理來(lái)源而異。

咖啡受歡迎程度來(lái)自于咖啡對(duì)消費(fèi)者的刺激效果，一方面因其具有潛在的健康效益，另一方面來(lái)自于咖啡獨(dú)特的感官特性。因此，作為全球流行飲品和世界市場(chǎng)上價(jià)值最高的經(jīng)濟(jì)作物之一，影響其感官質(zhì)量的物質(zhì)基礎(chǔ)一直備受關(guān)注。但對(duì)于海南不同產(chǎn)地咖啡烘焙豆主要滋味成分組成含量的差異性尚未得到很好的闡明。因此，本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖潜碚骱Ｄ? 種咖啡烘焙豆的主要滋味成分，研究烘焙后6 種咖啡豆滋味成分的差異。本研究主要采用超高效液相色譜法、離子交換色譜法以及氨基酸檢測(cè)分析技術(shù)，對(duì)構(gòu)成咖啡滋味品質(zhì)的主要成分（生物堿類(lèi)、酸類(lèi)、單糖等）進(jìn)行定性及定量分析，最后使用多元統(tǒng)計(jì)手段利用滋味特征成分的差異對(duì)海南6 種咖啡豆加以區(qū)分。了解烘焙豆中主要滋味成分的化學(xué)組成參數(shù)以及品種間成分組成的變量值，將為優(yōu)質(zhì)咖啡品種篩選、品種區(qū)分及產(chǎn)地溯源提供理論支持，同時(shí)為咖啡飲品開(kāi)發(fā)、進(jìn)一步提高咖啡經(jīng)濟(jì)價(jià)值提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 以海南6 個(gè)地區(qū)咖啡鮮果為原料，選擇紅色成熟、無(wú)霉?fàn)€變質(zhì)、無(wú)病蟲(chóng)害的果實(shí)，經(jīng)過(guò)統(tǒng)一采收、熱風(fēng)干燥（40 ℃處理至水分含量為10%～12%）、機(jī)械脫殼等過(guò)程，最后獲取6 種咖啡生豆，具體樣品信息見(jiàn)表1。將準(zhǔn)備好的生豆在陰涼干燥避光環(huán)境下儲(chǔ)藏備用。

8 種綠原酸標(biāo)品：3-咖啡?？鼘幩幔?-CQA）、5-咖啡?？鼘幩幔?-CQA）、4-咖啡?？鼘幩幔?-CQA）、3，4-二咖啡?？鼘幩幔?，4-diCQA）、3，5-二咖啡?？鼘幩幔?，5-diCQA）、4，5-二咖啡?？鼘幩幔?4，5-diCQA ） 、5- 阿魏?？鼘幩幔?-FQA）、4-阿魏?？鼘幩幔?-FQA）、葫蘆巴堿和咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品，四川省維克奇生物科技公司；8 種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；18 種氨基酸混標(biāo)、氨基酸分析儀試劑（緩沖液、再生液及茚三酮套裝），北京賽卡姆科學(xué)儀器有限公司；單糖標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉生物科技有限公司。以上標(biāo)準(zhǔn)品均為HPLC級(jí)，純度≥98%。其他試劑和耗材：三水合亞鐵氰化鉀（AR，99%），上海麥克林生化科技有限公司；冰乙酸（HPLC級(jí)，≥98%）、二水合乙酸鋅及三氟乙酸（AR，99%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇（HPLC 級(jí)，≥98%），美國(guó)默克公司；試驗(yàn)用水全部為娃哈哈純凈水；鹽酸、磷酸氫二鈉、磷酸（AR），廣州化學(xué)試劑廠。

1.1.2 儀器與設(shè)備 1290 Infinity 型超高效液相色譜儀（UPLC），美國(guó)安捷倫公司；ICS-5000+型離子交換色譜，美國(guó)Thermofisher 公司；S-433D型全自動(dòng)氨基酸分析儀，德國(guó)Sykam 公司；LXJ-IIB 型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；AL204型電子天平， 梅特勒托利多儀器有限公司；PROBATINO Typ 2SSH 型咖啡豆烘焙機(jī)，德國(guó)Probat 儀器公司；VTA-6S3 型咖啡豆研磨機(jī)，德國(guó)MAHLKONIG 儀器公司；SB-5200DT 型超聲波清洗器，寧波新芝生物科技股份有限公司；Lighttells CM-100 咖啡烘焙色度儀，上海大正器具有限公司。

1.2 方法

1.2.1 烘焙樣品制備 在滾筒式咖啡烘焙機(jī)中對(duì)每批次500.0 g 的咖啡生豆進(jìn)行烘焙處理。設(shè)置烘焙初始入鍋溫度180 ℃，烘焙機(jī)燃?xì)饣鹆?.7，烘焙時(shí)長(zhǎng)7.5～8.0 min，最終出鍋溫度為208～209 ℃，得到中等烘烤度（CM-100 得分#55.0～60.0）。烘焙前進(jìn)行預(yù)熱處理（20～30 min），保證后續(xù)烘焙過(guò)程爐溫的穩(wěn)定；烘焙結(jié)束后，采取冷風(fēng)降溫3～5 min，使烘焙豆溫度快速冷卻至室溫，豆內(nèi)成分較快趨于穩(wěn)定。試驗(yàn)前，烘焙咖啡豆經(jīng)研磨處理，過(guò)40 目篩（425 μm）后，置于4 ℃下真空貯存，備用。

1.2.2 生物堿及綠原酸含量測(cè)定 采用UPLC 法測(cè)定6 種咖啡烘焙豆中生物堿（咖啡因及葫蘆巴堿）、綠原酸組成及含量，單位g/100 g。（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制：將咖啡因、葫蘆巴堿和8 種綠原酸類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)品3-CQA（新綠原酸）、5-CQA（綠原酸）、4-CQA（隱綠原酸）、3，4-diCQA（異綠原酸B）、3，5-diCQA（異綠原酸A）、4，5-diCQA（異綠原酸C）、5-FQA（5-阿魏酰奎寧酸）和4-FQA（4-阿魏?？鼘幩幔┯眉状既芤号渲瞥? mg/mL 的儲(chǔ)備液。制備成100、50、20、10、5、1、0.5 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行UPLC 檢測(cè)。以標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。（2）樣液制備：參考CLIFFORD 等[10]的方法并適量修改。稱(chēng)取0.5 g 咖啡粉，加入50 mL 70%的甲醇溶液，室溫超聲提取30 min 后25 ℃下5000 r/min 離心10 min。取4 mL 上清液，分別加入250 mmol/L三水合亞鐵氰化鉀溶液（卡瑞試劑I）和1 mmol/L含3%冰乙酸的二水合乙酸鋅溶液（卡瑞試劑Ⅱ）各0.1 mL，5000 r/min 離心10 min 以沉淀和除去蛋白質(zhì)。取上清液過(guò)0.22 μm 濾膜，經(jīng)UPLC 檢測(cè)，每種樣品平行測(cè)定3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。（3）UPLC 測(cè)定條件：色譜柱為AgilentZorbax Eclispe Plus C18 （4.6 mm×100 mm，3.5 μm）。流動(dòng)相A 為甲醇，B 為0.1%甲酸水。梯度洗脫程序?yàn)?～20 min ： 5%～30% A ； 20～20.5 min ：30%～35% A ； 20.5～45 min ： 35%～45% A ； 45～50 min：45%～100% A；50～55 min：100% A；運(yùn)行時(shí)間6 min。柱溫25 ℃；流速0.5 mL/min；進(jìn)樣體積2 μL；生物堿及綠原酸類(lèi)DAD 檢測(cè)波長(zhǎng)分別為254 nm 和325 nm。

1.2.3 有機(jī)酸含量測(cè)定 采用UPLC 法測(cè)定6 種咖啡烘焙豆中8 種有機(jī)酸（草酸、酒石酸、奎尼酸、甲酸、蘋(píng)果酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸）的組成及含量，單位g/100 g。（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制：將8 種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇溶液配制成1 mg/mL的儲(chǔ)備液。逐級(jí)稀釋?zhuān)苽涑?00、50、20、10、5、1、0.5 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)UPLC 檢測(cè)。以標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。（2）樣液制備：取5.0 g 咖啡樣品于100 mL 圓底燒瓶，用60 mL 純凈水70 ℃水浴回流提取2.5 h，4000 r/min 下離心10 min，取上清液用超純水定容置于100 mL 容量瓶，樣液過(guò)0.22 μm 水相濾膜后用于UPLC 分析。（3）UPLC 測(cè)定條件：色譜柱為Zorbax SB-AQ 柱（4.6 mm× 250 mm，5.0 μm），柱溫30 ℃。流動(dòng)相A 為甲醇，B 為0.01 mol/L NaH₂PO₄ 溶液（用0.5 mol/L 的磷酸將pH 調(diào)至2.0 ）， 5% 甲醇等度洗脫， 流速為0.5 mL/min，DAD 檢測(cè)器波長(zhǎng)為210 nm，進(jìn)樣量10 μL。

1.2.4 單糖含量測(cè)定 采用離子交換色譜-脈沖安培法測(cè)定10 種單糖（巖藻糖-Fuc、鼠李糖-Rha、阿拉伯糖-Ara、半乳糖-Gal、葡萄糖-Glc、木糖-Xyl、果糖-Fru、核糖-Rib、半乳糖醛酸-GalA、葡萄糖醛酸-GlcA）的組成及含量。儀器配備安培檢測(cè)器，利用Dionex CarboPac PA20（150 mm×3 mm，6.5 μm）高效陰離子色譜柱進(jìn)行分離，配備CarboPac PG20 保護(hù)柱（30 mm×3 mm，6.5 μm）。結(jié)果以“g/100 g”表示。（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制：分別取10 種單糖標(biāo)品配制5 mg/mL 的單糖母液。逐級(jí)稀釋母液， 配置成濃度范圍在0.0005～0.05 mg/mL 的單糖混標(biāo)，過(guò)0.45 μm 濾膜后上機(jī)檢測(cè)。（2）樣液制備：在分析之前，用50 mL 石油醚55 ℃水浴提取細(xì)磨的2.0 g 烘焙咖啡粉25 min，提取2 次以除去脂肪（脫脂），后用溫和的N2流除去殘留的石油醚得脫脂粉[11]。稱(chēng)取20 mg脫脂后的咖啡粉，加入2.0 mL 2 mol/L 的三氟乙酸（trifluoroacetic acid， TFA），抽真空封管后置于110 ℃烘箱水解2 h。旋干三氟乙酸后加入1.0 mL甲醇洗滌旋干，重復(fù)3 次。加入1.0 mL 純凈水溶解成20 mg/mL 的母液，最終稀釋配制成1.0 mg/mL樣品試液。（3）儀器測(cè)定條件。流動(dòng)相：A 相為去離子水；B 相為200 mmol NaOH；C 相為1 mol/LNaAc/25 mmol NaOH；流速為0.5 mL/min，進(jìn)樣量為25 μL。洗脫條件：0～5 min：9% B；5.1～14 min：4% B；14.1～24 min：4% B、5% C；24～24.1 min：4% B、20% C；24.2～40 min：100% B。

1.2.5 氨基酸組成及含量測(cè)定 使用全自動(dòng)氨基酸分析儀進(jìn)行茚三酮柱后衍生法同時(shí)測(cè)定6 種咖啡烘焙豆中18 種氨基酸的組成及含量，最終結(jié)果以“g/100 g”表示。使用S-433D 氨基酸分析檢測(cè)系統(tǒng)，配備有電子恒溫自動(dòng)進(jìn)樣器S5200、Sykam S2100 四元梯度泵及DataApex U-PAD2 檢測(cè)器，用于測(cè)定樣品中的氨基酸。100 mg 咖啡粉加入10 mL 鹽酸（6 mol/L），冰藏5 min 取出，抽真空后封管，置于110 ℃下水解22 h，取出冷卻至室溫。取水解液過(guò)濾置10 mL 離心管，-4 ℃下貯存?zhèn)溆?。?.2 mL 于5 mL 試管中，氮?dú)獯蹈珊蠹尤? mL 專(zhuān)用樣品稀釋液，過(guò)0.22 μm 濾膜后上機(jī)檢測(cè)。通過(guò)比較氨基酸的保留時(shí)間與混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間來(lái)鑒定氨基酸。使用峰面積的外部標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)與真實(shí)標(biāo)準(zhǔn)的濃度進(jìn)行定量分析。數(shù)據(jù)分析軟件ClarityAmino 提供快捷準(zhǔn)確的圖譜數(shù)據(jù)分析。

GINZ 等[12]研究表明咖啡的苦味來(lái)源于咖啡中所含的苦味物質(zhì)，咖啡因和葫蘆巴堿被認(rèn)為是咖啡苦味的主要貢獻(xiàn)者?？Х纫蚝秃J巴堿是咖啡中最主要的2 種生物堿，葫蘆巴堿是一種吡啶生物堿，來(lái)源于煙酸氮原子的甲基化，故又被稱(chēng)為N-甲基煙酸，二者對(duì)咖啡飲品苦味和澀味影響較大。6 個(gè)產(chǎn)地烘焙咖啡豆中，咖啡因含量范圍為1.389～1.644 g/100 g，葫蘆巴堿含量則分布在0.399～0.560 g/100 g 之間，如圖2A 所示，咖啡因和葫蘆巴堿均在MS2 咖啡豆中存在最高含量，相反，在MS1 中含量均最低。此外，咖啡因含量QH（1.633 g/100 g）gt;YSL（1.595 g/100 g）gt;XL（1.540 g/100 g）gt;FS（1.532 g/100 g），葫蘆巴堿含量XL（0.514 g/100 g）gt;YSL（0.470 g/100 g）gt;FS（0.424 g/100 g）gt;QH（0.407 g/100 g）。

綜上，咖啡因和葫蘆巴堿含量因咖啡產(chǎn)地不同而產(chǎn)生差異，可能會(huì)影響最終咖啡感官品質(zhì)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），Origin 2018 軟件和SIMCA 14.1 軟件繪圖。所有實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定3 次，結(jié)果以用M±SD表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 6 種咖啡豆綠原酸、咖啡因及葫蘆巴堿組成及含量變化分析

如圖1 咖啡烘焙樣品生物堿和綠原酸分離色譜圖所示，利用UPLC 法能夠使咖啡樣品中生物堿及綠原酸實(shí)現(xiàn)良好的分離效果，進(jìn)而測(cè)定2 種生物堿（葫蘆巴堿、咖啡因）和8 種綠原酸組成及含量。

GINZ 等[12]研究表明咖啡的苦味來(lái)源于咖啡中所含的苦味物質(zhì)，咖啡因和葫蘆巴堿被認(rèn)為是咖啡苦味的主要貢獻(xiàn)者?？Х纫蚝秃J巴堿是咖啡中最主要的2 種生物堿，葫蘆巴堿是一種吡啶生物堿，來(lái)源于煙酸氮原子的甲基化，故又被稱(chēng)為N-甲基煙酸，二者對(duì)咖啡飲品苦味和澀味影響較大。6 個(gè)產(chǎn)地烘焙咖啡豆中，咖啡因含量范圍為1.389～1.644 g/100 g，葫蘆巴堿含量則分布在0.399～0.560 g/100 g 之間，如圖2A 所示，咖啡因和葫蘆巴堿均在MS2 咖啡豆中存在最高含量，相反，在MS1 中含量均最低。此外，咖啡因含量QH（1.633 g/100 g）gt;YSL（1.595 g/100 g）gt;XL（1.540 g/100 g）gt;FS（1.532 g/100 g），葫蘆巴堿含量XL（0.514 g/100 g）gt;YSL（0.470 g/100 g）gt;FS（0.424 g/100 g）gt;QH（0.407 g/100 g）。

綜上，咖啡因和葫蘆巴堿含量因咖啡產(chǎn)地不同而產(chǎn)生差異，可能會(huì)影響最終咖啡感官品質(zhì)。就葫蘆巴堿而言，MS2 咖啡比MS1 咖啡含有較高水平的葫蘆巴堿，由于其不同的含量產(chǎn)生了2 種咖啡風(fēng)味特征。葫蘆巴堿會(huì)伴隨著烘焙過(guò)程發(fā)生熱降解反應(yīng)，最終形成一系列不同揮發(fā)性化合物，如吡啶和吡咯衍生物、煙酸、煙酸甲酯等，這些化合物則會(huì)影響咖啡飲品的風(fēng)味形成和香氣產(chǎn)生[13]。

綠原酸（CGAs）是咖啡中的主要酚類(lèi)化合物，在烘焙咖啡風(fēng)味的形成中起著重要作用，有助于最終的酸度，并對(duì)確定咖啡杯的質(zhì)量有顯著影響。有文獻(xiàn)指出，低濃度CGAs 會(huì)導(dǎo)致苦味，而高濃度則會(huì)導(dǎo)致酸味[14]。本研究測(cè)定6 種咖啡豆中均含有8 種CGAs，如圖1B 所示，已按出峰時(shí)間依次分離為新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、5-阿魏?？鼘幩?、4-阿魏?？鼘幩?、異綠原酸B、異綠原酸A 和異綠原酸C。CGAs 通常被分為3 種，包括咖啡?？鼘幩幔–QAs）、二咖啡?？鼘幩幔╠iCQAs）和阿魏?？鼘幩幔‵QA），由于碳-碳共價(jià)鍵的熱斷裂，導(dǎo)致它們?cè)诤姹撼跗陔A段發(fā)生異構(gòu)化，例如CQAs 產(chǎn)生3 種異構(gòu)體即新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸（3-CQAs、5-CQAs、4-CQAs）；異綠原酸B（3，4-diCQAs）、異綠原酸A（3，5-diCQAs）和異綠原酸C（4，5-diCQAs）則互為diCQAs 異構(gòu)體。在烘焙后期發(fā)生差向異構(gòu)化、內(nèi)酯化以及降解反應(yīng)，含量會(huì)有所損失，其損失量CQAsgt;diCQAsgt;FQAs[15]。盡管CGAs 不耐熱，但在咖啡中含量相對(duì)較高，是咖啡功能特性的主要成分，如除抗氧化能力和抗炎作用外，還具有抗癌和抗突變特性[16]。如圖2B 所示，6 種咖啡豆中8 種CGAs 的含量分布各不相同。其中，3-CQAs含量（0.473～0.509 g/100 g）在QH 豆中最低，F(xiàn)S中最高；5-CQAs 含量（1.200～ 1.293 g/100 g）在MS1 豆中最低，F(xiàn)S 中最高；4-CQAs（0.635～0.722 g/100 g）在XL 豆中最低，YSL 中最高。與3-CQAs 和5-CQAs 相反，F(xiàn)S 豆中5-FQA 含量（0.549～0.814 g/100 g）最低，MS2 中最高；而MS2咖啡豆中的4-FQA 含量（0.079～0.184 g/100 g）最低，XL 中含量最高。結(jié)果與ONAKPOYA 等[17]研究結(jié)果一致，咖啡中綠原酸類(lèi)化合物主要以綠原酸、新綠原酸和隱綠原酸3 種異構(gòu)體為主，含量十分豐富，三者在咖啡中占多酚總量的80 %以上。就二咖啡?？鼘幩岫?，3，4-diCQAs（0.086～0.102 g/100 g）和4，5-diCQAs（0.063～0.081 g/100 g）含量均在MS1 豆中最低，MS2 豆中最高；3，5-diCQAs 含量（0.040～0.052 g/100 g）則在MS1豆中最低，F(xiàn)S 豆中含量最高。可以看出，CGAs含量在不同咖啡品種中分布不同，表明產(chǎn)地對(duì)咖啡中CGAs 的含量有影響。整體看，CGAs 在6種咖啡烘焙豆中的含量為CQAsgt;FQAsgt;diCQAs。這些酸與咖啡飲品的澀味、苦味和酸度有關(guān)，但并非含量越高對(duì)咖啡的感官質(zhì)量效益越好，例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些以高含量存在的物質(zhì)，如咖啡?？鼘幩酑QAs 和阿魏?？鼘幩酕QA，與不良風(fēng)味有關(guān)[18]。CGAs 是在烘焙過(guò)程中產(chǎn)生的苯酚和兒茶酚前體，可在沖泡過(guò)程中形成令人不快的感官味道[19]。

2.2 6 種咖啡烘焙豆有機(jī)酸組成和含量分析

酸度與甜度、苦度和香味是評(píng)價(jià)咖啡飲品品質(zhì)的重要因素之一，咖啡的酸度主要與咖啡烘焙過(guò)程中產(chǎn)生的有機(jī)酸有關(guān)，通常能夠被感知到的酸度主要?dú)w因于咖啡中的水溶性羧酸，如甲酸、乙酸、檸檬酸及蘋(píng)果酸等，因帶有大量H+，是使沖泡咖啡呈現(xiàn)酸滋味的主要來(lái)源[20]。因此考察不同產(chǎn)地咖啡烘焙豆中有機(jī)酸含量變化對(duì)沖泡咖啡口感影響極為重要。采用UPLC 對(duì)咖啡烘焙豆中的有機(jī)酸進(jìn)行測(cè)定，由樣品有機(jī)酸分離色譜圖（圖3）所示，8 種有機(jī)酸按保留時(shí)間長(zhǎng)短依次分離為草酸（5.612 min）、酒石酸（6.076 min）、奎寧酸（ 6.355 min ）、甲酸（ 6.661 min ）、蘋(píng)果酸（ 7.089 min ）、乙酸（ 8.234 min ）、檸檬酸（9.757 min）以及琥珀酸（10.776 min）。如圖3B可知，8 種有機(jī)酸在6 種咖啡烘焙豆中均有檢出。

圖4為8 種有機(jī)酸在6 種咖啡樣品中的含量分布，可看出不同咖啡有機(jī)酸含量存在一定差異。其中，6 種咖啡豆中草酸含量范圍為0.130～0.335 g/100g、酒石酸為0.092～0.233 g/100 g、奎寧酸為0.184～0.241 g/100 g、甲酸為12.381～14.011 g/100 g、蘋(píng)果酸為1.901～2.085 g/100 g、乙酸為0.204～1.246 g/100 g、檸檬酸為0.321～ 0.425 g/100 g 以及琥珀酸0.667～0.856 g/100 g；即樣品中含量：甲酸gt;蘋(píng)果酸gt;琥珀酸gt;檸檬酸gt;乙酸gt;奎寧酸gt;草酸gt;酒石酸。草酸、酒石酸和乙酸含量在6 種咖啡樣品間差異顯著（Plt;0.05），其中，草酸和乙酸含量在FS 咖啡豆中最高，而酒石酸含量在FS 中最低；MS1 中草酸含量最低，其乙酸含量（1.079 g/100 g）和酒石酸含量（0.223 g/100 g）較高?？鼘幩崾荂GAs 的主要降解產(chǎn)物，會(huì)隨著烘焙時(shí)間和烘焙程度的增長(zhǎng)或增強(qiáng)而降解，形成兒茶酚、苯酚、苯甲酸和2-呋喃基甲醇等物質(zhì)[21]?？鼘幩帷幟仕岷吞O(píng)果酸有助于增加咖啡飲品的酸度[22]。同樣，F(xiàn)S 豆中奎寧酸、甲酸、蘋(píng)果酸及檸檬酸含量最高，尤其奎寧酸含量（0.241 g/100 g）遠(yuǎn)超其他產(chǎn)地， 而奎寧酸含量在XL 和YSL 豆（ 約0.191 g/100 g）間無(wú)顯著性差異，在QH、MS1 和MS2 豆（約0.185 g/100 g）間差異不顯著。另外，琥珀酸在FS 咖啡豆中含量較低，為0.731 g/100 g，在XL 豆中含量最低，MS2 豆中含量最高，而在QH、YSL 及MS1 豆（0.830～ 0.840 g/100 g）之間差異不顯著?？鼘幩岷虲GAs 一樣，屬于酚酸類(lèi)，高濃度時(shí)會(huì)使咖啡飲品呈現(xiàn)苦味和澀感；而酒石酸、甲酸、蘋(píng)果酸以及檸檬酸等屬于脂肪族酸，濃度高時(shí)會(huì)產(chǎn)生尖酸味[23]。綜上，烘焙咖啡中有機(jī)酸的含量受咖啡產(chǎn)地的影響，因產(chǎn)地不同導(dǎo)致其有機(jī)酸含量的分布差異，進(jìn)而可能會(huì)影響最終咖啡飲品的感官質(zhì)量。

2.3 6種咖啡豆單糖含量分析

除了酸度和苦味，甜度等感官屬性對(duì)咖啡飲品的質(zhì)量亦至關(guān)重要。離子色譜-脈沖安培法（HPAEC-PAD）是近年發(fā)展起來(lái)的一種糖類(lèi)物質(zhì)分析方法，其原理是單糖通過(guò)在安培檢測(cè)器的金電極表面發(fā)生氧化反應(yīng)，引起電流變化而被檢測(cè)。本研究采用HPAEC-PAD 法測(cè)定6 種樣品中10 種單糖的組成及含量，如圖5 所示，6 種咖啡樣品中只檢測(cè)到8 種單糖組分，其中果糖-Fru 和核糖-Rib 在樣品中均未檢測(cè)到。蔗糖是生咖啡豆中最豐富的糖，在烘焙過(guò)程中，被水解成影響咖啡甜度的葡萄糖和果糖[24]。如表2 所示，8 種單糖回歸曲線(xiàn)相關(guān)系數(shù)R2gt;0.990，證明擬合度良好，能夠準(zhǔn)確測(cè)定烘焙咖啡豆中單糖組成含量。

如表3 可知，8 種單糖在6 個(gè)不同產(chǎn)地咖啡豆中的含量分布各不相同， 其含量為MS1（11.386 g/100 g）gt;XL（10.241 g/100 g）gt;FS（9.936g/100 g）gt;YSL（9.724 g/100 g）gt;MS2（9.368 g/100g）gt;QH（8.297 g/100 g），其總含量在QH 中含量最少，MS1 中含量最多（圖6）。除半乳糖醛酸外（FS 和MS2 中含量分別為最低和最高），其他單糖含量均在QH 中最低，而多數(shù)單糖均在MS1 中含量最高。鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖含量較高的樣品在感官品質(zhì)上會(huì)表現(xiàn)出明顯的甜香，鼠李糖在FS、YSL 和MS2 豆中含量較高且差異較??；阿拉伯糖在MS1 中含量最高，在QH 中含量最低，與XL、FS、YSL 和MS2 咖啡豆相比差異顯著（Plt;0.05），而XL、FS、YSL 和MS2 咖啡豆間差異不顯著；XL 和MS1 中葡萄糖含量較高，QH和YSL 中含量較低。8 種單糖在6 種咖啡豆中含量由高到低依次為：半乳糖gt;木糖gt;阿拉伯糖gt;葡萄糖gt;鼠李糖gt;巖藻糖gt;葡萄糖醛酸gt;半乳糖醛酸。與KIM 等[25]的研究結(jié)果一致，半乳糖是咖啡豆中的主要單糖，其次是阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖和鼠李糖。因此，由于咖啡產(chǎn)地的多樣性，單糖的含量出現(xiàn)了差異性。一般來(lái)說(shuō)，較高的糖含量與更好的杯品質(zhì)量有關(guān)[19]。

2.4 6種咖啡豆氨基酸組成及含量分析

氨基酸作為咖啡風(fēng)味的前體物質(zhì)，烘焙過(guò)程中會(huì)與糖類(lèi)發(fā)生美拉德反應(yīng)生成吡嗪類(lèi)、吡咯類(lèi)以及呋喃類(lèi)化合物；也可發(fā)生斯特克降解反應(yīng)生成醛類(lèi)、酮類(lèi)化合物，進(jìn)而形成特有的咖啡風(fēng)味、香氣和滋味[26]。本研究采用氨基酸柱后衍生法即茚三酮法，具有衍生反應(yīng)迅速、產(chǎn)物穩(wěn)定、重現(xiàn)性好、能檢測(cè)多數(shù)氨基酸等優(yōu)點(diǎn)，原理主要是茚三酮可以與一級(jí)氨基酸產(chǎn)生深藍(lán)或藍(lán)紫色衍生物，與二級(jí)氨基酸反應(yīng)生成黃色衍生物[27]。

如圖7 可知，對(duì)咖啡中17 種氨基酸含量進(jìn)行了分析，分別為7 種必需氨基酸：異亮氨酸（Ile）、甲硫氨酸（Met）、纈氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）、蘇氨酸（Thr）、苯丙氨酸（Phe）以及賴(lài)氨酸（Lys）；10 種非必需氨基酸：天冬氨酸（Asp）、絲氨酸（Ser）、谷氨酸（Glu）、脯氨酸（Pro）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、半胱氨酸（Cys）、酪氨酸（Tyr）、組氨酸（His）以及精氨酸（Arg）。烘焙咖啡豆中單個(gè)氨基酸含量略有不同，且6 種咖啡中含量分布和占比也不同（表4）。XL 和QH咖啡豆中大多數(shù)氨基酸含量略高，相反，MS1 和MS2 中多數(shù)氨基酸含量較低。氨基酸受熱會(huì)降解生成其他化合物，例如，色氨酸（Trp）降解后會(huì)產(chǎn)生吲哚以及3-甲基吲哚，6種咖啡豆中未檢測(cè)出Trp，可能在烘焙過(guò)程中分解程度較劇烈，含量無(wú)法到達(dá)檢出限，故未檢測(cè)出。

因氨基酸受體不同，氨基酸可分為鮮味、甜味、苦味和無(wú)味氨基酸組分，天冬氨酸及谷氨酸等為主要的鮮味氨基酸，呈鮮甜口感；異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和纈氨酸則為苦味氨基酸，呈現(xiàn)苦味；呈甜味氨基酸則包括絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸以及丙氨酸[28]?？Х榷购卸喾N氨基酸，實(shí)際分布取決于許多變量，包括咖啡豆的產(chǎn)區(qū)。QH 中的Asp 含量為0.947 g/100 g，其含量顯著高于其他產(chǎn)區(qū)（Plt;0.005），由圖8 可以看出，Asp 占6 種咖啡豆總氨基酸含量的11%，說(shuō)明在不同產(chǎn)地間分布均勻且含量較高。同樣，Thr在QH（0.302 g/100 g）中含量仍為最高且較其他產(chǎn)地差異顯著，然而整體含量與其他氨基酸相比較低，只占總氨基酸含量的3%～4%。谷氨酸在QH 和MS2 中分別占據(jù)最高和最低含量，且含量與其他產(chǎn)地豆間差異顯著（Plt;0.05）；Val 在6 種咖啡豆中差異性較小，占總氨基酸含量的4%，在FS 中發(fā)現(xiàn)最低含量為0.300 g/100 g。6 種咖啡豆17 種氨基酸總含量為7.154～8.535 g/100 g，QH咖啡豆中含量最高，MS2 中最低，最終含量分布為QHgt;XLgt;YSLgt;FSgt;MS1gt;MS2。不同產(chǎn)區(qū)對(duì)咖啡豆氨基酸含量影響較大，對(duì)咖啡滋味造成影響。17 種氨基酸在烘焙咖啡豆中含量分布不同，其中谷氨基酸含量最高（1.497～1.956 g/100 g；占比21%～23%）；Asp（0.817～0.947 g/100 g）含量較高、Arg（0.070～0.098 g/100 g）其中含量最低，占比1%。

2.5 多元統(tǒng)計(jì)分析對(duì)6種咖啡豆樣品滋味特征成分差異性研究

多元分析技術(shù)，如主成分分析（PCA）可進(jìn)行樣品整體品質(zhì)差異的區(qū)分檢驗(yàn)，該技術(shù)允許從大數(shù)據(jù)矩陣中減少數(shù)據(jù)，而不損失重要信息，可用于獲得整體質(zhì)量和化學(xué)成分之間的關(guān)聯(lián)，將變量關(guān)聯(lián)為樣本，并且還可識(shí)別主成分形成中變量之間的關(guān)系。PLS-DA 分析可用于原產(chǎn)地保護(hù)產(chǎn)品以及品牌產(chǎn)品真?zhèn)伪孀R(shí)。PLS 為多因變量對(duì)多自變量的回歸建模方法，適于多自變量個(gè)數(shù)多于觀測(cè)樣本數(shù)或變量之間高度相關(guān)的數(shù)據(jù)分析，具有PCA 和多元線(xiàn)性回歸分析的優(yōu)點(diǎn)[29]。為更好地了解6 種咖啡中主要滋味成分的變化，應(yīng)用PCA和PLS-DA 統(tǒng)計(jì)分析方法獲得了不同咖啡樣品中滋味特征成分的差異概況。

PCA二維得分投影圖如圖9A 所示，前2 個(gè)主成分PC1和PC2方差貢獻(xiàn)率分別為38.7%和20.2%。整體來(lái)看，6 個(gè)品種均處于各自的集中分布區(qū)，其中XL、YSL 和MS2 咖啡豆較密切地聚集，與產(chǎn)地FS、QH 和MS1 距離較遠(yuǎn)，說(shuō)明這3個(gè)產(chǎn)地咖啡在主要滋味成分上與其他品種差異較大，且結(jié)合載荷圖（圖9B）可以看出，3 個(gè)產(chǎn)地咖啡與隱綠原酸和乙酸相關(guān)性最高；此外，QH與氨基酸相關(guān)性較高，琥珀酸和5-阿魏奎寧酸同MS1 相關(guān)性較高，而新綠原酸和奎寧酸與FS 咖啡相關(guān)性較高。PCA 基礎(chǔ)上采用PLS-DA 分析（圖9C）產(chǎn)地間差異，所得分析結(jié)果和PCA 分析結(jié)果一致，證實(shí)了分析方法的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性[30]。以滋味特征成分為X 變量，對(duì)應(yīng)的咖啡產(chǎn)地做Y 變量建立偏最小二乘分析模型，進(jìn)一步探討不同產(chǎn)地咖啡樣品與滋味化學(xué)組分之間的關(guān)系。PLS 模型中包含的2 個(gè)潛在變量（PC1 和PC2）代表了X 矩陣方差的38.4%和Y 矩陣方差的20.3%。圖9D 顯示XL和QH樣品同時(shí)位于PC1 的正維度中，其中XL 中綠原酸和異綠原酸含量較突出，QH 則與氨基酸含量呈正相關(guān)。另外，F(xiàn)S 和YSL 接近PC1 中心軸線(xiàn)，MS1 和MS2 則位于PC1 的負(fù)維度中，因滋味成分含量不同呈現(xiàn)明顯區(qū)分，且相關(guān)性結(jié)果與PCA 分析結(jié)果一致。綜上表明主要滋味化學(xué)組分可用于鑒別海南不同產(chǎn)地咖啡，結(jié)合多種化學(xué)計(jì)量學(xué)方法分析，成功將6 種咖啡區(qū)分，其中XL、YSL 和MS2 間具有較高的相似性。

3 討論

目前，咖啡化學(xué)成分以及滋味特征成分的研究較普遍，例如比較不同品種和不同初加工預(yù)處理方式、不同烘焙方式以及不同的萃取沖泡方式等對(duì)咖啡滋味成分的影響[31]；而針對(duì)海南目前不同產(chǎn)地咖啡對(duì)滋味特征成分表征分析研究尚未見(jiàn)報(bào)道。GLOESS 等[32]研究來(lái)自不同物種和地理來(lái)源的小粒種和中粒種咖啡結(jié)果表明，在相同烘焙條件下滋味成分綠原酸含量在中粒種咖啡種中高于小粒種咖啡。CIARAMELLI 等[33]通過(guò)核磁共振波譜研究來(lái)自10 個(gè)不同產(chǎn)區(qū)的中度烘焙咖啡豆的代謝物結(jié)果表明，來(lái)自肯尼亞的中粒種咖啡提取物中的綠原酸和咖啡因的含量較高，可能與其種植地理環(huán)境有關(guān)。本研究結(jié)果表明，8 種綠原酸總含量在6 種不同產(chǎn)區(qū)的中粒種咖啡豆中分布為MS2（3.483 g/100 g）gt;YSL（3.439 g/100 g）gt;FS（3.403 g/100 g）gt;MS1（3.368 g/100 g）gt;XL（3.356 g/100 g）gt;QH（3.318 g/100 g）。6 種咖啡豆中檢測(cè)出咖啡因含量范圍為1.532～1.633 g/100 g，而葫蘆巴堿含量為0.407～ 0.514 g/100 g，在XL中含量最高，QH 中含量最低；即不同產(chǎn)區(qū)咖啡豆滋味成分含量不同與其地理環(huán)境密切相關(guān)。8種有機(jī)酸在不同咖啡樣品中的含量不同，其中草酸（ 0.130～0.335 g/100 g ）、酒石酸（ 0.092～0.233 g/100 g）和乙酸（0.204～1.246 g/100 g）含量在6 種咖啡樣品之間差異最為顯著。6 種咖啡中8 種單糖的總含量在8.297～11.386 g/100 g 之間，在QH 中含量最少，MS1 中含量最多。6 種咖啡豆17 種氨基酸總含量為7.154～8.535 g/100 g，QH 咖啡豆中含量最高，MS2 豆中最低，最終含量分布為QHgt;XLgt;YSLgt;FSgt;MS1gt;MS2；且在烘焙咖啡豆中含量分布不同，其中谷氨基酸含量最高（1.497～1.956 g/100 g；占比21%～23%），精氨酸（0.070～0.098 g/100 g）含量最低，占比1%。PEREZ等[34]論述了基于咖啡豆的化學(xué)成分用于追蹤咖啡地理起源的技術(shù)，該方法可以在大陸或更局部的層面上區(qū)分咖啡種植區(qū)。本研究的PCA 和PLS-DA 結(jié)果顯示，主要滋味化學(xué)組分含量可用于鑒別海南不同產(chǎn)地咖啡，并通過(guò)多種化學(xué)計(jì)量學(xué)分析方法，成功將6 種咖啡區(qū)分，其中XL、YSL 和MS2 間具有較高的相似性。結(jié)果證明，通過(guò)主要滋味成分指紋圖譜，能夠?qū)Ｄ? 個(gè)產(chǎn)地咖啡進(jìn)行良好區(qū)分。綜上所述，6 種咖啡豆在滋味特征方面呈現(xiàn)不同，并體現(xiàn)在豆間化學(xué)組分含量的差異性上。了解不同化學(xué)組成參數(shù)對(duì)海南咖啡風(fēng)味的調(diào)控及影響，將為海南咖啡烘焙工藝改進(jìn)及品質(zhì)提升提供參考，為沖泡和影響飲品感官特性的化學(xué)成分之間的聯(lián)系提供有價(jià)值的見(jiàn)解，將為優(yōu)質(zhì)咖啡品種篩選、品種區(qū)分及產(chǎn)地溯源提供理論支持。