一株野生蟬花的生物學特性及馴化栽培研究

關鍵詞：蟬花；生物學性狀；馴化；篩選

中圖分類號：S646 文獻標志碼：A

蟬花（Cordyceps chanhua）又名蟲花、知了花、蟬草或金蟬花，是我國名貴的藥食蟲草真菌，具有重要經濟價值[1-2]。隋唐《藥性論》和明代《本草綱目》詳細記載了蟬花的主要功效。國家衛(wèi)生健康委發(fā)布的2020 年第9 號公告，首次將人工培養(yǎng)的蟬花子實體列為新食品原料，這是繼廣東蟲草和蛹蟲草之后的又一個被正式審批的蟲草類新食品原料，極大促進了蟬花產業(yè)的發(fā)展。蟬花富含多種營養(yǎng)物質和化學活性成分，如蛋白質、不飽和脂肪酸、腺苷、多糖、甘露醇和礦物質等；野生蟬花與人工培養(yǎng)子實體的多種藥理功效相似，且不同培養(yǎng)時期和不同部位的蟬花代謝產物顯著不同，有望開發(fā)成綠色功能食品和治療腫瘤的新資源藥物[3-6]。目前，約20 種蟲草屬物種在市場上廣泛流通[7-9]。

前人曾將Isaria cicadae 視作蟬花的學名，將C. cicadae 作為I. cicadae 的有性型[10]。分子生物學證據(jù)表明，蟲草屬（Cordyceps）和棒束孢屬（Isaria）均為多系起源，此二屬的分類地位和屬下物種多樣性也發(fā)生了較大變化[11-13]。李增智等[14]通過形態(tài)分類學和分子系統(tǒng)學研究，將采自江西井岡山的有性型蟲草標本描述為蟲草科蟲草屬的1 個新種——蟬花（Cordyceps chanhua Z. Z. Li， F.G. Luan， Hywel-Jones， C. R. Liamp;S.L. Zhang），首次明確了蟬花的分類地位，同時明確指出“蟬花”可能是一個復合群，從而為蟬花的開發(fā)利用和蟲草物種多樣性研究提供理論基礎[6]。野生蟬花子座橙色至淡橘黃色，具多次分枝；子囊殼埋生，子囊孢子絲狀，光滑透明，（247～360）μm×（1.5～1.8）μm；孢梗束淡黃色至淡黃褐色，分生孢子長橢圓形，（6.4～13.8）×（2.1～3.1）μm[10]。雖然野生蟬花和人工栽培蟬花在形態(tài)上具有一定差異，但二者的主要營養(yǎng)成分、活性物質和藥效等相似[4， 8]。

蟬花具有巨大開發(fā)價值，但野生蟬花資源短缺，影響野生蟬花菌絲生長和子實體形成的重要因素目前還沒有系統(tǒng)的研究，中國西南地區(qū)的蟬花資源有待深入挖掘[15-16]。本研究基于形態(tài)解剖學和分子生物學證據(jù)，對采自云南曲靖的一株野生蟲草進行物種鑒定，通過組織分離和菌株純化，對其生物學特性和栽培馴化條件進行初步研究，以期為蟲草屬物種多樣性研究、種質資源保護和開發(fā)利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為一株野生蟲草（采集號：hlh1945），采自云南曲靖翠峰山（24°59?N，103°96?E，海拔約2000 m）。基因組DNA 提取試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司；分子生物學實驗試劑購自北京百邁客生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離與物種鑒定 （1）菌株分離。利用組織分離法，從野外采集的新鮮蟲體中挑取少量菌絲在基礎培養(yǎng)基上獲得菌株，菌株保存于曲靖師范學院云南高原生物資源保護與利用研究中心。蟲體利用硅膠干燥，制作成分子材料，用于DNA 提取和標本觀察。

（2）培養(yǎng)基制備。基礎培養(yǎng)基：葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、瓊脂20 g、磷酸二氫鉀0.5 g、硫酸鎂0.5 g、維生素B1 10 mg，定容至1000 mL，自然pH。液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨2 g，磷酸二氫鉀0.5 g、硫酸鎂0.5 g、維生素B1 10 mg，定容至1000 mL，自然pH。培養(yǎng)基于高溫蒸汽滅菌鍋內121 ℃滅菌20 min。

（3）標本和菌株形態(tài)觀察。觀察野生蟲草子實體的形狀、大小和顏色等特征，根據(jù)子實體和菌絲體的菌絲、產孢組織和孢子等顯微特征，進行形態(tài)學初步鑒定。

1.2.2 分子系統(tǒng)發(fā)育分析 分別提取野外采集的子實體、分離菌株和人工栽培獲得的子實體的總DNA。基于通用引物ITS1f（5?-CTTGGTCATTTAGACGAAGTAA-3?）和ITS4（5?-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3?）分別擴增以上3 種材料的ITS片段。擴增步驟：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35 個循環(huán)，72 ℃繼續(xù)延伸7 min，將PCR 產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。使用RAxMLv.7.2.6 軟件，基于最大似然法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，步長值設置為1000。

1.2.3 菌絲體生物學特性研究 在基礎培養(yǎng)基中接種菌株，使菌株活化，為菌絲體生物學特性研究提供材料。

（1）碳源對菌絲生長的影響。以不加葡萄糖的基礎培養(yǎng)基為空白對照，將碳源分別設定為蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、果糖、葡萄糖和甘油，濃度均為20 g/L，pH 為6。將直徑約5 mm 菌絲塊接種至直徑為6 cm 的平板上，24 ℃避光培養(yǎng)10 d，每個處理設置3 個重復。菌絲萌發(fā)后，每天觀察、測量并記錄菌絲生長情況，從第2 天起采用十字交叉法測量菌絲生長速度，并觀察記錄菌落形態(tài)。

（2）氮源對菌絲生長的影響。以不加蛋白胨的基礎培養(yǎng)基為空白對照，將氮源分別設定為酵母粉、蛋白胨、硝酸鉀、氯化銨、硫酸銨和尿素，濃度均為2 g/L，pH 為6。

（3）無機鹽對菌絲生長的影響。以不加磷酸二氫鉀和硫酸鎂的基礎培養(yǎng)基為空白對照，將無機鹽分別設定為硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硫酸鈣、硫酸鐵、硫酸鋅和硫酸銅，濃度均為2 g/L，pH為6。

（4）不同pH 對菌絲生長的影響。將基礎培養(yǎng)基設置7 個pH 梯度（4、5、6、7、8、9、10），進行菌絲培養(yǎng)。

（5）不同溫度對菌絲生長的影響。將培養(yǎng)溫度設置7 個梯度（15、18、21、24、27、30、33 ℃），進行菌絲培養(yǎng)。

1.2.4 菌絲生長培養(yǎng)基優(yōu)化的正交試驗 在上述單因素試驗基礎上，對影響蟬花菌絲生長的培養(yǎng)基條件進行正交試驗（表1）。利用三因素三水平基于最適pH 和溫度，以碳源、氮源和無機鹽為影響因子進行正交試驗，每個處理設定6 個重復，確定并優(yōu)化蟬花菌絲生長的最佳培養(yǎng)基。

1.2.5 人工栽培試驗 液體菌種制備：將直徑約5 mm 的菌塊接種至裝有100 mL 液體優(yōu)化培養(yǎng)基的三角瓶中，150 r/min、24 ℃避光振蕩培養(yǎng)6 d，備用。在高9.0 cm、寬6.5 cm 的組培瓶中裝入40 g小麥和大米以1∶1 混合的培養(yǎng)基，水60 mL，透氣膜封口，121 ℃滅菌20 min，反復滅菌3 次，冷卻后接種5 mL 稀釋5 倍的液體菌種，重復10瓶，置于24 ℃培養(yǎng)箱光照培養(yǎng)后采收子實體。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用 SPSS 19.0 軟件進行試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，在單因素和正交試驗方差分析中，Plt;0.05 代表差異顯著。

2 結果與分析

2.1 物種鑒定

通過觀察野外采集的新鮮蟲草標本，獲得相關外部形態(tài)特征和內部顯微結構。從蟬若蟲頭部和胸部各長出若干個淡黃色至橙色具多分枝的子座和孢梗束，分枝柄部橙黃色或黃白色，（8.0～28.0）mm×（1.5～3.0）mm；末端淡黃白色，形成多個西藍花狀或雞冠狀產孢結構，布滿污白色粉末狀分生孢子；分生孢子長橢圓形，連接成長鏈狀，（4.0～8.5）μm×（1.5～3.5）μm（圖1）。基于以上形態(tài)特征，將其初步鑒定為蟬花（C. chanhua）。

野外采集的蟬花子實體、分離菌株和人工栽培獲得的子實體與蟬花模式標本（JGS150713）的ITS 片段在系統(tǒng)發(fā)育樹中聚成一個獨立的分化支系，并獲得100%支持率，結果表明此支系樣本代表蟬花（C. chanhua）（圖2）。

2.2 單因素試驗

蟬花菌絲在不同碳源培養(yǎng)基中均能生長，但生長速度和菌絲活力存在一定差異（表2，圖3）。菌絲在蔗糖培養(yǎng)基上生長最快，長勢最好，菌絲潔白且呈絨毛狀；其次是麥芽糖和無碳源對照組（CK1）培養(yǎng)基；在甘油培養(yǎng)基上生長最慢，長勢最差。CK1菌絲雖能生長，但菌絲生長速度不穩(wěn)定，菌絲形態(tài)不規(guī)則，說明碳源是蟲草菌絲生長重要的營養(yǎng)成分之一，其對碳源的種類具有廣泛適應性。不同碳源培養(yǎng)基上的菌絲形態(tài)不同，以果糖為碳源的菌絲最為濃密潔白。當培養(yǎng)時間超過30 d，CK1 和葡萄糖培養(yǎng)基上的菌絲會分泌深黃色色素，菌絲可能易老化（圖3）。綜合菌絲生長速度和長勢，可確定最佳碳源為蔗糖。

不同氮源對菌株菌絲生長有明顯影響，菌絲在酵母粉培養(yǎng)基中生長最快，長勢最好，菌絲潔白呈毛絮狀，其次為蛋白胨、硝酸鉀、CK2、氯化銨和硫酸銨；以尿素為氮源時，菌絲生長速度最慢且長勢最差。以氯化銨和硫酸銨為氮源的菌絲最濃密。和碳源類似，菌絲對氮源的種類也具有廣泛適應性。綜合菌絲生長速度和長勢，可確定最佳氮源為酵母粉（表2，圖3）。

不同無機鹽對菌絲生長影響較小，菌絲在以硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硫酸鈣為無機鹽的培養(yǎng)基上生長速度較快，且差異不顯著；在硫酸鐵、硫酸鋅和硫酸銅培養(yǎng)基上生長較慢，且差異不顯著；但前、后2 組無機鹽下的菌絲生長速度差異顯著。綜合菌絲生長速度和長勢，確定最適無機鹽為硫酸鎂（表2，圖3）。

不同pH 對菌絲生長影響顯著，當5菌絲生長的溫度適應范圍較廣，15～33 ℃均能生長，但不同溫度條件下的菌絲生長速度存在顯著差異。在設定的6 個溫度梯度中，溫度低于24 ℃時，菌絲生長速度隨溫度增高而逐漸加快，菌絲較為稠密；溫度高于24 ℃時，菌絲生長逐漸受抑制，生長速度變慢；溫度達到33 ℃時，菌絲不再生長。24 ℃條件下，菌絲長勢良好、生長快，呈毛氈狀，將其確定為最適溫度（表2，圖3）。

2.3 菌絲生長正交試驗

單因素試驗表明，菌絲生長的最適pH 為6，最適溫度為24 ℃，在此條件下，對3 個因素碳源、氮源和無機鹽各設置3 個成分水平，進行三因素三水平L9（34）正交試驗（表3，圖4）。碳源的極差最大，R 為1.21，說明碳源是影響蟬花菌絲生長的重要因素，其次為氮源和無機鹽。從均值T可知，菌絲生長培養(yǎng)基最佳碳源、氮源和無機鹽分別為蔗糖、酵母粉和硫酸鎂。方差分析表明，碳源的F 值最大，3 種因素的顯著性差異依次為碳源gt;氮源gt;無機鹽，這與正交試驗結果的直觀分析一致（表3，表4）。在蔗糖-酵母粉-硫酸鎂組合下，蟬花菌絲生長速度快、長勢旺盛、不易老化（圖4）。

2.4 人工栽培

蟬花在小麥和大米以1∶1 混合的培養(yǎng)基上可正常生長，子實體采收周期約為40～45 d，每個栽培瓶收獲蟬花干重平均約9.56 g。人工栽培收獲蟬花子實體與野生子實體在外部形態(tài)特征上明顯不同，子實體呈淡土黃色至淡黃色，較柔韌，扁平彎曲狀、分枝較少，高1.5～5.0 cm，寬0.3～0.8 cm，厚0.1～0.2 cm；孢梗束外密布污白色絮狀或粉末狀分生孢子；但二者顯微結構類似，分生孢子呈長橢圓形，連接成長鏈狀，（3.5～8.5）×（1.5～3.0）μm（圖1，圖5）。

3 討論

野生菌種質資源收集和遺傳多樣性研究是我國食用菌產業(yè)發(fā)展的重要基礎性工作，野生食藥用菌株的分離、鑒定和馴化不僅為真菌資源開發(fā)和利用提供了原材料，還有利于保護真菌物種多樣性[17-18]。云南地形地貌復雜，兼具熱帶、亞熱帶和溫帶植被類型，孕育了極其豐富的真菌資源，但還有大量野生食用菌物種深藏于山間林下而鮮為人知，亟需加大研發(fā)力度，充分發(fā)揮和持續(xù)利用云南豐富的野生食用菌資源，為地方經濟建設和社會發(fā)展服務[19]。蟬花是我國傳統(tǒng)名貴藥食兩用真菌，已有1500 多年的利用歷史。蟬花基因組約為36.9 Mb，基因編碼蛋白數(shù)量高于其他蟲草真菌，線粒體基因組長度也呈現(xiàn)出多態(tài)性，表明其具有豐富的遺傳基因[20-21]。蟬花不同種群內個體在形態(tài)特征、生理特性和分子序列等方面具有豐富的遺傳變異性[22-23]。其不同種群的遺傳譜系隨機分布，與地理來源無明顯相關性，而形態(tài)性狀具有一定地理相關性[23-25]，溫度和濕度是影響蟬花分布的主要因素[26]。

本研究從滇東北海拔約2000 m 的云南松林下獲得一株野生蟲草，該物種野生子實體、實驗室培養(yǎng)菌絲及人工栽培子實體的外部形態(tài)結構和內部顯微結構與模式標本相似，其ITS 片段與蟬花模式標本以高支持率聚在一個系統(tǒng)發(fā)育支，利用形態(tài)解剖和分子系統(tǒng)發(fā)育分析，將其準確鑒定為蟬花。由于天然野生蟬花資源極度缺乏，不少研究逐漸關注蟬花菌絲體的液體發(fā)酵，其培養(yǎng)周期短、發(fā)酵條件可控、易規(guī)模化生產，因此成為獲取蟬花原材料的主要渠道。本文研究表明，蟬花菌絲最適生長溫度為24 ℃，最適pH 為6，最適碳源、氮源和無機鹽分別為蔗糖、酵母粉和硫酸鎂，碳源對菌絲生長影響最大，其次為氮源，無機鹽對菌絲生長影響較小。前人研究表明，碳源、氮源和無機鹽對菌絲生長均有顯著影響，培養(yǎng)溫度范圍為25～28 ℃，最適pH范圍為6～7[27-29]，與本文研究基本一致，表明蟬花不同菌株的培養(yǎng)條件較為穩(wěn)定。

蟬花具有重要的開發(fā)利用價值，因此針對蟬花的人工栽培開展了大量研究。譚悠久等[2]通過蟬花野外菌株繁育，初步建立了蟬花菌株的子實體篩選和分子鑒定體系，有效提高了子實體產量。本研究以小麥和大米為培養(yǎng)基，在24 ℃下培養(yǎng)40～45d后，可獲得長勢整齊的子實體，人工培養(yǎng)獲得的子實體形態(tài)與野生蟬花具有一定差異，顏色較淺、分枝較少、子座和孢梗束呈扁平狀，分生孢子粉呈污白色，分生孢子形狀和大小與野生蟬花一致。陳祝安等[30]首次通過固體培養(yǎng)，初步實現(xiàn)蟬花的人工栽培，觀察到類似寄主體上的孢梗束；孢梗束生長和孢子產量對碳源濃度較敏感，而氮源對其影響不大。蟬花在以無機鹽為主要營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基上均能產生孢梗束，以大米為營養(yǎng)物質的蟬花孢梗束生長最快，適合進行規(guī)模化培養(yǎng)，添加蟬蛹粉可顯著提高子實體產量，蟬花氨基酸、粗多糖和蛋白質含量均高于野生蟬花相應物質含量[31-32]。有研究推測特定微生物群落和土壤理化性質可能在蟬花的子實體發(fā)生中起著關鍵作用[33]。

今后，擬通過進一步的實驗室培養(yǎng)和野外繁育，優(yōu)化菌絲培養(yǎng)基配方的最適濃度，篩選人工栽培技術參數(shù)，并從分子生物學角度對菌株進行優(yōu)化[34]，以期改善蟬花子實體品質，提升其活性物質含量，獲得穩(wěn)定高產的優(yōu)質菌株資源，為蟬花的綜合開發(fā)利用提供理論、資源和技術支持。