食品中沙門氏菌檢測能力驗(yàn)證的結(jié)果與分析

摘 要：鑒于沙門氏菌感染案例的持續(xù)攀升，食品安全領(lǐng)域面臨的挑戰(zhàn)也愈發(fā)嚴(yán)峻，引發(fā)廣泛關(guān)注。提高沙門氏菌檢驗(yàn)?zāi)芰κ翘嵘称钒踩降闹匾緩街弧１緦?shí)驗(yàn)室積極參與了中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測試評(píng)價(jià)中心主導(dǎo)執(zhí)行的ACAS-PT-1616凍干乳粉中沙門氏菌檢驗(yàn)?zāi)芰︱?yàn)證，按照其項(xiàng)目要求，根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》（GB 4789.4—2016）和《進(jìn)出口乳及乳制品中沙門氏菌快速檢測方法 實(shí)時(shí)熒光PCR法》（SN/T 2415—2010）的試驗(yàn)方法對(duì)樣品進(jìn)行檢驗(yàn)。檢驗(yàn)結(jié)果顯示此次能力驗(yàn)證的2個(gè)樣品均為沙門氏菌陽性，且獲得滿意結(jié)果。通過此次能力驗(yàn)證，本實(shí)驗(yàn)室在沙門氏菌檢測方面的專業(yè)能力得到了顯著提升。

關(guān)鍵詞：沙門氏菌；能力驗(yàn)證；檢驗(yàn)方法

Proficiency Testing Results and Analysis of Salmonella in Food

WEI Ya， XU Hong

（Anhui Guoke Testing Technology Co.， Ltd.， Hefei 230041， China）

Abstract： Given the continuous rise in Salmonella infection cases， the challenges facing the food safety sector have become increasingly severe. Improving the ability of detect Salmonella is one of the important methods to enhance food safety. Our laboratory participated in the ACAS-PT-1616 Salmonella testing capability validation activity in milk powder implemented by the Testing and Evaluation Center of the China Academy of Inspection and Quarantine， according to its project requirements， GB 4789.4—2016 and SN/T 2415—2010 were used for testing. The test results showed that both samples for this proficiency test were positive for Salmonella， and satisfactory results were obtained. Through this proficiency test， the laboratory’s professional capabilities in Salmonella detection have been significantly improved.

Keywords： Salmonella; proficiency testing; detection methods

作為一種危害性極大的食源性致病菌，在細(xì)菌性食物中毒事件中，由沙門氏菌引起的中毒事件占比高達(dá)80%[1]。人類感染沙門氏菌能夠引發(fā)腸胃炎、傷寒、敗血癥、腦膜炎，甚至死亡[2]。現(xiàn)今，已發(fā)現(xiàn)的沙門氏菌血清型有2 600多種[3]，常存在于生肉制品、水產(chǎn)品、乳制品、冷凍食品、禽蛋和蔬菜水果中，且能夠存活數(shù)月之久[4]，對(duì)食品安全、畜牧養(yǎng)殖業(yè)及公眾健康構(gòu)成了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。

在我國，由沙門氏菌引起的食物中毒甚至群體性食物中毒事件常有報(bào)道[5-7]。因此，提升沙門氏菌的檢測能力，是防控食源性疾病和保障食品安全的重要途徑。能力驗(yàn)證作為重要的外部質(zhì)量評(píng)價(jià)活動(dòng)，可長期有效監(jiān)控微生物檢驗(yàn)?zāi)芰昂饬繉?shí)驗(yàn)室的技術(shù)能力，保障檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確度和可信度。

此次參與中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測試評(píng)價(jià)中心主導(dǎo)執(zhí)行的ACAS-PT-1616乳粉中沙門氏菌的檢測能力驗(yàn)證，根據(jù)中心的項(xiàng)目要求，本實(shí)驗(yàn)室采用《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》（GB 4789.4—2016）[8]和《進(jìn)出口乳及乳制品中沙門氏菌快速檢測方法 實(shí)時(shí)熒光PCR法》（SN/T 2415—2010）[9]兩種檢測方法進(jìn)行試驗(yàn)，并最終取得了滿意的結(jié)果。分析對(duì)比兩種檢測方法的檢測過程及結(jié)果，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)，可顯著提升實(shí)驗(yàn)室沙門氏菌檢驗(yàn)水平。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

兩組由中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測試評(píng)價(jià)中心提供的編號(hào)為23-J116和23-H756的凍干乳粉樣品。

腸沙門氏菌腸亞種CICC21513（陽性對(duì)照）、大腸埃希氏菌CICC25012（陰性對(duì)照），中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；緩沖蛋白胨水（BPW）、四硫酸鈉黃綠增菌液（TTB）、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）、亞硫酸鉍瓊脂（BS）、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂（XLD）、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；沙門氏菌干制生化鑒定試劑盒，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；沙門氏菌屬診斷血清A-F多價(jià)O血清、Vi抗原，寧波天潤生物藥業(yè)有限公司；DNA提取試劑盒、rTaq酶，寶生物工程（大連）有限公司；引物P1為5’-GCGTTCTGAACCTTTGGTAATAA-3’，引物P2為5’-CGTTCGGGCAATTCATTA-3’，引物T為5’-FAM-TGGCGGTGGGTTTTGTTGTCTTCT-TAMARA-3’，生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 工作菌株制備

取磁珠保存的陽性對(duì)照菌株和陰性對(duì)照菌株，分別劃線接種于制備好的營養(yǎng)瓊脂平板中，置于36 ℃倒置培養(yǎng)24 h，待用。

1.2.2 樣品處理

樣品需要用60 mL無菌生理鹽水進(jìn)行再水化。在生物安全柜中無菌開啟西林瓶，立即加入5 mL無菌生理鹽水進(jìn)行再水化，待溶解后，吸入無菌瓶中，再用剩余的無菌生理鹽水反復(fù)清洗西林瓶內(nèi)壁，回收洗液并入上述無菌瓶中。

1.2.3 GB 4789.4—2016方法

（1）預(yù)增菌。無菌操作取25 mL樣品，置于225 mL BPW培養(yǎng)液中，振蕩混勻后，36 ℃培養(yǎng)18 h，以25 mL無菌生理鹽水為空白對(duì)照。用接種環(huán)沾取陽性對(duì)照菌株和陰性對(duì)照菌株的單菌落，置于225 mL"BPW培養(yǎng)液中，振蕩混勻后，于36 ℃培養(yǎng)18 h。

（2）增菌。輕搖混勻預(yù)增菌后的培養(yǎng)物，分別移取1 mL轉(zhuǎn)接于10 mL SC和10 mL TTB培養(yǎng)液內(nèi)。SC培養(yǎng)液于36 ℃培養(yǎng)24 h，TTB培養(yǎng)液于42 ℃培養(yǎng)24 h。

（3）分離。用接種環(huán)取增菌后的培養(yǎng)物1環(huán)，劃線接種于沙門顯色培養(yǎng)基平板、XLD平板和BS平板，于36 ℃分別培養(yǎng)24 h（BS平板培養(yǎng) 48 h）。

（4）生化鑒定。將可疑菌落劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板中，36 ℃培養(yǎng)24 h。取單菌落接種三糖鐵瓊脂斜面，先在斜面劃線，再于底層穿刺，36 ℃培養(yǎng)24 h。同時(shí)挑取營養(yǎng)瓊脂平板上的新鮮培養(yǎng)物至無菌生理鹽水中，仔細(xì)研磨制成0.5個(gè)麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙海么司鷳乙哼M(jìn)行尿素、氰化鉀、賴氨酸脫羧酶、靛基質(zhì)、甘露醇、山梨醇和ONPG試驗(yàn)，36 ℃培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。如果氰化鉀試驗(yàn)呈陰性，可將時(shí)間延長至48 h，再觀察結(jié)果。

（5）血清學(xué)鑒定。取營養(yǎng)瓊脂中培養(yǎng)物進(jìn)行血清學(xué)鑒定，在載玻片上將其與生理鹽水混合制成均一性的懸液，觀察菌體有無自凝現(xiàn)象，對(duì)無自凝性的菌株，按照同樣方法與抗原血清混合，同時(shí)以生理鹽水為對(duì)照，觀察有無凝集現(xiàn)象。

1.2.4 SN/T 2415—2010方法

（1）DNA提取。取1.2.3中得到的預(yù)增菌液1.5 mL于2 mL離心管中，按試劑盒說明書進(jìn)行DNA提取。

（2）實(shí)時(shí)熒光PCR檢測。實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系（25 μL）為模板2 μL，10×PCR緩沖液2.5 μL，dNTPs 1 μL，引物和探針各1 μL，rTaq 0.5 μL，ddH2O 16 μL。設(shè)陰性、陽性和空白對(duì)照，其中樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，對(duì)照設(shè)2個(gè)重復(fù)。實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃、1 min；94 ℃、5 s，60 ℃、20 s，30個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 GB 4789.4—2016方法檢測結(jié)果

2.1.1 菌落形態(tài)

BS和XLD平板上的沙門氏菌屬典型菌落形態(tài)，見標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.4—2016的5.3；沙門氏菌顯色培養(yǎng)基平板上的典型菌落呈紫紅色。本次能力驗(yàn)證樣品和對(duì)照菌株在3種平板上的菌落形態(tài)如表1所示。陽性和陰性對(duì)照菌株在3個(gè)平板上均呈現(xiàn)出對(duì)應(yīng)的典型菌落特征。2個(gè)能力驗(yàn)證樣品的菌落形態(tài)也基本一致，在BS平板上只有1種典型菌落形態(tài)；在沙門氏菌顯色培養(yǎng)基和XLD平板上的菌落均有2種形態(tài)，且各有1種為典型菌落形態(tài)。

2.1.2 生化鑒定

沙門氏菌屬的生化反應(yīng)特征見GB 4789.4—2016中5.4。本文選擇BS、XLD和沙門顯色培養(yǎng)基平板上的典型菌落進(jìn)行純培養(yǎng)后，按照沙門氏菌干制生化鑒定試劑盒的方法進(jìn)行鑒定，結(jié)果見表2。樣品23-J116和23-H756中分離菌株的生化反應(yīng)均為三糖鐵瓊脂底層產(chǎn)酸呈黃色、斜面產(chǎn)堿呈紫紅色、產(chǎn)氣、產(chǎn)硫化氫，賴氨酸脫羧酶陽性，靛基質(zhì)、氰化鉀、尿素均為陰性，均可確定為沙門氏菌陽性。

2.1.3 血清學(xué)鑒定

23-J116、23-H756和陽性對(duì)照菌株均無自凝性。取樣品和對(duì)照菌株分別進(jìn)行多價(jià)菌體抗原（O）和鞭毛抗原（H）鑒定，結(jié)果顯示23-J116、23-H756和陽性對(duì)照菌株的抗原（O）和抗原（H）血清均呈凝集現(xiàn)象。

2.2 SN/T 2415—2010方法檢測結(jié)果

2.2.1 DNA提取

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 2415—2010中5.5.3對(duì)樣品DNA濃度和純度的要求，當(dāng)DNA濃度為10～100 μg·mL-1，A260/A280比值在1.7～1.9時(shí)，適宜于實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。本文用試劑盒對(duì)樣品和對(duì)照菌株的BPW增菌液進(jìn)行DNA提取，得到的DNA濃度和純度如表3所示，均滿足實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增的要求。

2.2.2 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測

實(shí)時(shí)熒光PCR檢測體系的有效性要求：空白和陰性對(duì)照無熒光對(duì)數(shù)增長，相應(yīng)的CT值＞25.0；陽性對(duì)照有熒光對(duì)數(shù)增長，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，CT值＜25.0。檢測結(jié)果的判定要求：樣品有熒光對(duì)數(shù)增長，且CT值≤25，則判定樣品陽性。本文的陽性、陰性和空白對(duì)照的檢測值滿足標(biāo)準(zhǔn)有效性的要求，同時(shí)樣品23-J116和23-H756的CT值均＜25.0，故判定樣品為陽性（表3）。

3 結(jié)論與討論

本文采用GB 4789.4—2016的傳統(tǒng)培養(yǎng)法和SN/T 2415—2010的實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測能力驗(yàn)證樣品，得到的檢測結(jié)果一致，且能力驗(yàn)證獲得滿意結(jié)果。但上述2種方法也各有不足之處，GB 4789.4—2016檢測步驟較多，較為耗時(shí)；SN/T 2415—2010雖然減少了檢測時(shí)間，但對(duì)檢測人員和檢測環(huán)境的要求較高。劉曉靜等[10]開發(fā)了一種基于納米酶的免疫層析試紙條法，該方法的操作簡單快速，但目前僅針對(duì)腸炎沙門氏菌，且該方法的檢出限為103 CFU·mL-1。董永貞等[11]研究出一種納米酶介導(dǎo)的磁弛豫免疫傳感器，在食源性沙門氏菌檢測方面具備良好的穩(wěn)定性，是一種高效、經(jīng)濟(jì)且簡便的檢測方法，但檢出限仍然只有50 CFU·mL-1。趙青等[12]研究發(fā)現(xiàn)，食源性致病菌存在細(xì)菌活的不可培養(yǎng)狀態(tài)（Viable But Nonculturable，VBNC），該狀態(tài)下的腸炎沙門氏菌需要在TSB培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)7 d方可復(fù)蘇，因此對(duì)于該狀態(tài)下的沙門氏菌，可能需要有針對(duì)性的方法對(duì)其進(jìn)行檢驗(yàn)。

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