穩(wěn)轉(zhuǎn)oHSV2主要衣殼蛋白VP5人宮頸癌細(xì)胞系的構(gòu)建

［摘 要］ 為建立穩(wěn)定表達(dá)溶瘤Ⅱ型單純皰疹病毒主要衣殼蛋白（VP5）的人子宮頸癌HeLa-VP5細(xì)胞系，探究VP5蛋白是否調(diào)控自然殺傷細(xì)胞（NK）的細(xì)胞毒性。運(yùn)用piggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)，通過lipofectamine 3000TM 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將 pPBDP-UL19和pSPBT質(zhì)粒轉(zhuǎn)入HeLa細(xì)胞，利用嘌呤霉素（Puro）篩選穩(wěn)定細(xì)胞株，用有限稀釋法得到單克隆細(xì)胞，利用western blot鑒定HeLa-VP5細(xì)胞系中VP5蛋白的表達(dá)，以及利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HeLa-VP5中GFP的表達(dá)，最后實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)法比較改造前后細(xì)胞系的生長(zhǎng)活性變化。通過嘌呤霉素抗性篩選和有限稀釋挑取單克隆，獲得3株HeLa-VP5單克隆細(xì)胞；western blot鑒定發(fā)現(xiàn)3株HeLa-VP5細(xì)胞系VP5蛋白均有表達(dá)；流式檢測(cè)單克隆細(xì)胞系GFP陽(yáng)性率均達(dá)到99%；活細(xì)胞實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HeLa-VP5細(xì)胞系與親本細(xì)胞HeLa細(xì)胞具有一致的生長(zhǎng)活性。HeLa-VP5穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系構(gòu)建成功，作為評(píng)估VP5蛋白是否調(diào)控自然殺傷細(xì)胞（NK）細(xì)胞毒性的靶細(xì)胞，為揭示oHSV2發(fā)揮抗腫瘤作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

［關(guān)鍵詞］ 溶瘤Ⅱ型單純皰疹病毒； 主要衣殼蛋白； 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系

［中圖分類號(hào)］ R153" ［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］ A

溶瘤病毒療法是一種新興的實(shí)體瘤治療方式。它使用可自我復(fù)制的溶瘤病毒選擇性地感染腫瘤細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞裂解并產(chǎn)生可以擴(kuò)散到其他腫瘤細(xì)胞的后代[1]，通過直接溶瘤作用和誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)特異性殺死腫瘤細(xì)胞。溶瘤病毒（oncolytic virus，Ovs）是一類可以選擇性地感染和殺死癌細(xì)胞，但不傷害正常細(xì)胞的天然或重組病毒。到目前為止，全球已經(jīng)批準(zhǔn)了Rigvir（ECHO-7）、Oncorine（H101）、T-VEC （Imlygic）和DELYTACT （teserpaturev/G47Δ） 等4個(gè)OVs藥物，分別用于治療黑色素瘤、頭頸癌、轉(zhuǎn)移性黑色素瘤和惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤或任何原發(fā)性腦癌。另外，單純皰疹病毒、牛痘病毒、腺病毒、呼腸孤病毒和新城疫病毒等不同類型的溶瘤病毒已進(jìn)入臨床前和臨床研究階段。單純皰疹病毒（herpes simplex virus，HSV）是包膜雙鏈 DNA 病毒，主要引起野生型唇皰疹和生殖系統(tǒng)感染。改良的HSV是一種用于診斷和治療癌癥的病毒類型。迄今為止，包括Oncovex（T-VEC）、1716、G207、NV1020、HF10和G47Δ在內(nèi)的幾種HSV突變體已經(jīng)完成或進(jìn)入Ⅰ期、Ⅱ期和ⅡⅠ期臨床試驗(yàn)，以治療來自不同組織的黑色素瘤、乳腺癌和膠質(zhì)瘤等不同惡性程度的腫瘤[2]。

單純皰疹病毒是最常用的溶瘤病毒載體之一。常見的溶瘤單純皰疹病毒（oHSV）通過敲除神經(jīng)毒性因子ICP34.5來減弱病毒對(duì)正常細(xì)胞的致病性，增強(qiáng)其在腫瘤細(xì)胞中的選擇性復(fù)制[3]。溶瘤Ⅱ型單純皰疹病毒oHSV2是基于標(biāo)準(zhǔn)株 HSV-2（HG52）而改造的，即敲除了ICP34.5基因和ICP47基因，同時(shí)插入了人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（human granulocyte macrophage colony stimulating factor，hGM-CSF）基因。其改造的優(yōu)勢(shì)在于：1）ICP34.5的基因產(chǎn)物可以通過干擾素途徑抑制細(xì)胞對(duì)病毒的清除，而在腫瘤細(xì)胞內(nèi)此途徑是缺失的，將ICP34.5敲除后，增強(qiáng)了oHSV2對(duì)腫瘤細(xì)胞選擇性復(fù)制；2）ICP47導(dǎo)致了TAP缺陷，從而限制了感染細(xì)胞的免疫識(shí)別，而ICP47基因的缺失恢復(fù)了MHC I，使腫瘤細(xì)胞響應(yīng)免疫應(yīng)答，上調(diào)了US11的表達(dá)，促進(jìn)病毒在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)并提高病毒的溶瘤活性[4]；3）oHSV2載體含有hGM-CSF，它可以激活抗原呈遞細(xì)胞，誘導(dǎo)腫瘤特異性免疫應(yīng)答。

腫瘤已經(jīng)開發(fā)出不同的策略來逃避免疫監(jiān)視，包括對(duì)主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）的經(jīng)典MHC I類抗原進(jìn)行下調(diào)或?qū)Ψ墙?jīng)典HLA-G和HLA-E抗原進(jìn)行上調(diào)。人類白細(xì)胞抗原（HLA-E）在大多數(shù)組織的細(xì)胞表面普遍以低水平表達(dá)，但在腫瘤細(xì)胞和病毒感染的細(xì)胞中過表達(dá)[5]，并通過與自然殺傷（NK）細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞上的受體CD94 / NKG2受體結(jié)合來進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)。HLA-E與CD94 / NKG2受體的結(jié)合，可以導(dǎo)致NK細(xì)胞的抑制或活化，這取決于HLA-E所呈現(xiàn)的肽和與CD94相關(guān)的NKG2受體[5-8]。由于其免疫抑制的特征，HLA-E的表達(dá)可能代表了腫瘤逃避免疫監(jiān)視的重要機(jī)制。

前期研究發(fā)現(xiàn)，UV-oHSV2感染腫瘤細(xì)胞（BGC823、LoVo、A549、HeLa）后，細(xì)胞的HLA-E上調(diào)表達(dá)，并且利用GST pull-down、Co-IP等技術(shù)篩選出HLA-E的互作蛋白——oHSV2主要衣殼蛋白VP5。VP5蛋白是由HSV-2的UL19基因所編碼的主要衣殼蛋白，在感染復(fù)制晚期達(dá)到最高表達(dá)水平。冷凍電子顯微鏡下觀察到HSV-2（MS株）衣殼結(jié)構(gòu)由大約3000個(gè)蛋白質(zhì)組成，分為六鄰體（hexons）、五鄰體（pentons）和三聯(lián)體（triplexes）等3種類型。六鄰體和五鄰體都包含VP5（六鄰體還包含VP26），三聯(lián)體包括VP23和VP19C。VP5蛋白形成了廣泛的分子間網(wǎng)絡(luò)，包括多個(gè)二硫鍵（總共約1500個(gè)）和非共價(jià)相互作用，與VP26蛋白和三聯(lián)體支撐衣殼穩(wěn)定和裝配[9]。

為初步驗(yàn)證VP5蛋白是否影響了HLA-E分子的表達(dá)水平，將表達(dá)VP5蛋白的質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞HLA-E的表達(dá)水平上調(diào)。為進(jìn)一步探究oHSV2的主要衣殼蛋白VP5如何上調(diào)HLA-E以及VP5是否通過干擾HLA-E與CD94/NKG2受體的相互作用從而調(diào)控NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性，本研究擬構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)VP5蛋白的腫瘤細(xì)胞系，以便后續(xù)oHSV2抗腫瘤作用機(jī)制研究。

本研究采用的是piggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)。昆蟲的piggyBac轉(zhuǎn)座子是一種新興的非病毒系統(tǒng)，可以有效誘變和介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移到哺乳動(dòng)物基因組中[10]，與基于病毒的系統(tǒng)相比，是一種更安全的選擇。它可以攜帶高達(dá)14 kb的DNA片段，且轉(zhuǎn)座效率沒有顯著影響。PiggyBac轉(zhuǎn)座子通過“剪切和粘貼”機(jī)制有效地在載體和染色體之間轉(zhuǎn)置。在轉(zhuǎn)位過程中，轉(zhuǎn)座酶識(shí)別位于轉(zhuǎn)座子載體兩端的轉(zhuǎn)座子特異性倒置末端重復(fù)（ITR）序列，將內(nèi)容物從載體上移出并將它們整合到目的染色體的TTAA位點(diǎn)中[11]，其切除精確，不會(huì)留下任何痕跡序列。因此PiggyBac轉(zhuǎn)座子成為哺乳動(dòng)物中使用的主要轉(zhuǎn)座子/轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)。使用帶有UL19基因（編碼VP5蛋白）的轉(zhuǎn)座質(zhì)粒（pPBDP-UL19）和表達(dá)轉(zhuǎn)座酶的質(zhì)粒（pSPBT），將UL19基因整合至HeLa細(xì)胞染色體上，以綠色熒光蛋白（green fluorescent protein 即 GFP）作為熒光標(biāo)記，嘌呤霉素作為細(xì)胞抗性，進(jìn)行細(xì)胞系篩選和單克隆挑選，成功構(gòu)建了HeLa-VP5穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。

本研究構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)溶瘤Ⅱ型單純皰疹病毒主要衣殼蛋白（VP5）的人子宮頸癌HeLa-VP5細(xì)胞系，將其作為評(píng)估VP5蛋白是否調(diào)控自然殺傷細(xì)胞（NK）細(xì)胞毒性的靶細(xì)胞，為揭示oHSV2發(fā)揮抗腫瘤作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器

溶瘤病毒oHSV2由本實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)進(jìn)行基因改造、生產(chǎn)、純化。實(shí)驗(yàn)所使用Hela細(xì)胞、質(zhì)粒載體PiggyBac Dual promoter、Super PiggyBac Transposase由本團(tuán)隊(duì)保存，細(xì)胞培養(yǎng)基是DME/F-12（HyClone，USA），大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)制備，限制性內(nèi)切酶（NEB），質(zhì)粒小提中量試劑盒購(gòu)于諾唯贊公司，嘌呤霉素（Puro）購(gòu)于碧云天生物公司，流式細(xì)胞檢測(cè)儀（BD），體視熒光顯微鏡（Nikon 公司），北京東聯(lián)哈爾二級(jí)生物安全柜。

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建

配制PCR體系及設(shè)置反應(yīng)程序。所用到的引物見表1。

將UL19基因片段產(chǎn)物和pPBDP空載同源重組。其重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α后，搖菌1 h。取菌液涂布LB固體平板（Amp抗性）。待平板長(zhǎng)出單克隆菌落后，挑取10個(gè)單克隆菌落搖菌培養(yǎng)。取菌液做菌落PCR，出現(xiàn)UL19陽(yáng)性結(jié)果的菌株外送測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與NCBI上的發(fā)布序列比對(duì)。

1.3 質(zhì)粒提取

將測(cè)序成功的菌液以1∶1000的比例接種至LB液體培養(yǎng)基（Amp抗性）中，37℃，220 r/min 搖菌14 h后提質(zhì)粒。

1.4 細(xì)胞敏感性實(shí)驗(yàn)

將HeLa細(xì)胞接種于24孔板中。次日將嘌呤霉素（1～10 μg/mL）加入孔中，每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，并做好標(biāo)記。每日觀察孔內(nèi)貼壁細(xì)胞占比，在第2、4、6天更換含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基。將第4天中HeLa細(xì)胞存活率為0時(shí)的嘌呤霉素濃度設(shè)為其最低致死濃度。

1.5 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前一天將HeLa細(xì)胞接種到24孔板中。按照說明書配制反應(yīng)體系（表2）。

將體系A(chǔ)和B分別制備好后，充分混勻，室溫靜置10 min。將總體系加入孔中，培養(yǎng)48 h后觀察GFP表達(dá)情況。

1.6 HeLa-VP5單克隆細(xì)胞系篩選

換用嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)孔中有90%以上的細(xì)胞發(fā)光時(shí)，進(jìn)行單克隆細(xì)胞篩選。將孔板內(nèi)細(xì)胞消化，用梯度稀釋法將細(xì)胞懸液稀釋到一定密度后接種到96孔板中，確保每孔中只有一個(gè)細(xì)胞。48 h后觀察96孔板，記錄下單個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)應(yīng)的孔。待單細(xì)胞長(zhǎng)成細(xì)胞團(tuán)并有完整細(xì)胞形態(tài)后，選出發(fā)綠色熒光的單克隆細(xì)胞團(tuán)，并將其擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.7 Western blot檢測(cè)HeLa-VP5細(xì)胞系中VP5蛋白的表達(dá)

取HeLa細(xì)胞和HeLa-VP5細(xì)胞，冰上裂解細(xì)胞20 min后，13 000 r/min，4℃離心收集上清。加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液后，100℃煮沸15 min。將上述蛋白樣品進(jìn)行電泳，保證每孔上樣量相同。使用半干法轉(zhuǎn)膜，15 V，20 min，得到樣品NC膜。將NC膜封閉，洗膜，一抗孵育，二抗孵育后，滴加ECL顯色液進(jìn)行顯影。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HeLa-VP5細(xì)胞系中GFP的表達(dá)

取1×106個(gè)HeLa和HeLa-VP5 細(xì)胞。以HeLa細(xì)胞作為對(duì)照組，收集細(xì)胞懸液到EP管中，離心棄去上清。用PBS分別清洗、重懸細(xì)胞，過濾后上機(jī)。設(shè)置流式細(xì)胞儀檢測(cè)通道為 GFP 單通道，收集1×104個(gè)細(xì)胞。GFP通道的相對(duì)熒光強(qiáng)度作為GFP表達(dá)的量化指標(biāo)。

1.9 活細(xì)胞實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)法檢測(cè)HeLa-VP5細(xì)胞系增殖活性

取1×104個(gè)的HeLa和HeLa-VP5 細(xì)胞，以Hela細(xì)胞作為對(duì)照組，將細(xì)胞懸液加入電極板中。將電極孔板放入活細(xì)胞實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)儀上，靜置30 min。監(jiān)測(cè)細(xì)胞指數(shù)，5 min/次，記錄細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。一共監(jiān)測(cè)40～60 h。

2 結(jié)果

2.1 pPBDP-UL19質(zhì)粒的構(gòu)建

以oHSV2的cDNA為模板擴(kuò)增UL19基因（4125 bp，編碼VP5蛋白）。如圖1所示，其擴(kuò)增條帶在約4125 bp處，與目的基因大小一致。通過單克隆菌落PCR鑒定，其擴(kuò)增條帶位置與目的基因一致（圖2）。挑取3個(gè)單菌落外送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank中發(fā)表的序列一致。選取測(cè)序正確的質(zhì)粒，通過雙酶切（圖3）鑒定，證明質(zhì)粒pPBDP-UL19構(gòu)建成功。

2.2 HeLa對(duì)嘌呤霉素敏感性實(shí)驗(yàn)

設(shè)置不同嘌呤霉素濃度（1～10 μg/mL）進(jìn)行Hela細(xì)胞敏感性分析。根據(jù)致死曲線可知，篩選到第4天時(shí)，在2 μg/mL的濃度梯度下觀察到細(xì)胞存活率為0。因此以2μg/mL作為HeLa單克隆細(xì)胞篩選的最佳濃度。

2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞

將pPBDP-UL19質(zhì)粒和pSPBT質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞48 h，通過熒光顯微鏡可以觀察到視野內(nèi)有30%以上的細(xì)胞發(fā)光（圖5），說明pPBDP-UL19質(zhì)粒和pSPBT質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率較高，并成功表達(dá)了GFP。

2.4 HeLa-VP5單克隆細(xì)胞系挑選及培養(yǎng)

經(jīng)過2 μg/mL嘌呤霉素加壓篩選后，進(jìn)行單克隆細(xì)胞系挑選及培養(yǎng)，得到了3株穩(wěn)定表達(dá)GFP的單克隆細(xì)胞株（圖6）。

2.5 HeLa-VP5細(xì)胞系VP5蛋白的表達(dá)

收集HeLa細(xì)胞和HeLa-VP5細(xì)胞，將細(xì)胞裂解后取上清進(jìn)行western blot分析。3株HeLa-VP5單克隆細(xì)胞均檢測(cè)到VP5（圖7）。

2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HeLa-VP5細(xì)胞系純度

如圖8所示，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)HeLa-VP5細(xì)胞與HeLa細(xì)胞的GFP陽(yáng)性率（FL1-A+表示GFP陽(yáng)性率）。HeLa-VP5-1和HeLa-VP5-3與對(duì)照組相比， GFP陽(yáng)性率均在99%以上，說明HeLa-VP5單克隆細(xì)胞系構(gòu)建成功。

2.7 活細(xì)胞實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)法檢測(cè)HeLa-VP5細(xì)胞系增殖活性

通過生長(zhǎng)曲線（圖9）可以得知，HeLa-VP5與其親本細(xì)胞HeLa生長(zhǎng)曲線趨勢(shì)一致，說明VP5蛋白的表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖活性沒有影響。

3 討論與結(jié)論

本研究運(yùn)用piggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。通過構(gòu)建帶有UL19基因的轉(zhuǎn)座質(zhì)粒（pPBDP-UL19）和表達(dá)轉(zhuǎn)座酶的質(zhì)粒（pSPBT），完成了HeLa細(xì)胞對(duì)UL19基因的整合，利用嘌呤霉素抗性篩選陽(yáng)性細(xì)胞。通過western blot、流式細(xì)胞術(shù)、活細(xì)胞實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)等方法證實(shí)了UL19整合到HeLa細(xì)胞的基因組中并成功表達(dá)VP5蛋白，證明使用piggyBac轉(zhuǎn)座子/轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)在人宮頸癌細(xì)胞（HeLa）中進(jìn)行永久性基因轉(zhuǎn)移是可行的。

溶瘤病毒作為用于治療的病毒，可以選擇性地在腫瘤組織內(nèi)復(fù)制，并將其破壞裂解，但不會(huì)感染正常組織[12]。而腫瘤細(xì)胞裂解釋放出的抗原，則能進(jìn)一步激活系統(tǒng)性的抗腫瘤免疫應(yīng)答，實(shí)現(xiàn)對(duì)原位和轉(zhuǎn)移腫瘤的殺傷[13]。然而，腫瘤已經(jīng)發(fā)展出逃避免疫系統(tǒng)監(jiān)測(cè)的機(jī)制，免疫抑制分子（如白細(xì)胞免疫球蛋白樣受體LILRB4和細(xì)胞程序性死亡一配體1（PD-L1））的高表達(dá)，可以抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)[14]。

免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICIs）是近年來治療腫瘤的流行免疫療法之一，其通過靶向和抑制免疫檢查點(diǎn)（包括 CTLA-4 和 PD-1）來激活免疫應(yīng)答。但與“熱”腫瘤相比，免疫檢查點(diǎn)抑制劑在治療“冷”腫瘤方面效果較小，原因在于促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生和T細(xì)胞浸潤(rùn)的水平將在一定程度上改變腫瘤微環(huán)境（TME）的“冷”（非T細(xì)胞炎癥）與“熱”（T細(xì)胞炎癥）性質(zhì)，這與腫瘤發(fā)展過程中表現(xiàn)出的抑制或支持性質(zhì)密切相關(guān)?！盁帷蹦[瘤的特征是T細(xì)胞浸潤(rùn)和免疫激活的分子標(biāo)志物?！盁帷蹦[瘤對(duì)免疫治療的反應(yīng)率較高，而“冷”腫瘤表現(xiàn)出明顯的T細(xì)胞缺陷或排斥反應(yīng)[15]。

OV的治療活性不僅限于其溶瘤活性，還包括腫瘤微環(huán)境和免疫系統(tǒng)的整合調(diào)節(jié)。因此，OV提供了逆轉(zhuǎn)腫瘤微環(huán)境的免疫抑制并使腫瘤對(duì)免疫檢查點(diǎn)阻斷敏感的理想手段。當(dāng)與全身免疫檢查點(diǎn)阻斷（如CTLA-4和PD-1阻斷）相結(jié)合時(shí)，溶瘤病毒療法的抗腫瘤療效顯著增強(qiáng)[16-17]。此外，轉(zhuǎn)基因可以通過病毒基因組工程技術(shù)插入OV基因組，其中病毒編碼的基因表達(dá)可以免疫調(diào)節(jié)腫瘤，還可以構(gòu)建表達(dá)檢查點(diǎn)抑制性抗體分子的新OV。通過病毒抗體治療（即重組抗體的基因遞送），結(jié)合不同模式的直接和間接殺傷癌細(xì)胞，增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的局部免疫應(yīng)答[18-20]。

抗腫瘤是免疫系統(tǒng)的多個(gè)組成部分相互協(xié)作、共同作用的結(jié)果。在腫瘤微環(huán)境中，NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞是協(xié)調(diào)oHSV清除腫瘤細(xì)胞的主要參與者。NK細(xì)胞通過表面的激活性或抑制性受體直接靶向并殺死外源細(xì)胞，其免疫過程不具備抗原特異性和MHC限制性。它已被證明可被招募到腫瘤微環(huán)境中，并有助于病毒感染細(xì)胞的清除[21-22]。NK細(xì)胞表面激活性受體和抑制性受體之間的相互協(xié)調(diào)、共同作用，決定了其對(duì)靶細(xì)胞的最終反應(yīng)[6]。當(dāng)腫瘤細(xì)胞中的激活性配體表達(dá)上調(diào)時(shí)，會(huì)結(jié)合大量的NK表面激活性受體，從而增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷能力。NK細(xì)胞被激活后，除了可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞外，還可以通過分泌細(xì)胞因子和趨化因子，增強(qiáng)其他免疫細(xì)胞的殺傷能力。相反，當(dāng)抑制性受體與相應(yīng)配體結(jié)合時(shí)，則減弱了NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性。CD94 / NKG2A異二聚體作為抑制NK細(xì)胞反應(yīng)的重要一員，在腫瘤浸潤(rùn)處的NK和CD8+T細(xì)胞中高表達(dá)， 而HLA-E在腫瘤細(xì)胞和病毒感染的細(xì)胞中過表達(dá)[4]。隨著HLA-E的上調(diào)，它與抑制性受體的結(jié)合成為調(diào)控NK細(xì)胞活性的主要影響因素，某些腫瘤和免疫性疾病通過該途徑逃避免疫檢查。

通過前期研究發(fā)現(xiàn)了oHSV2的主要衣殼蛋白VP5可以引起不同腫瘤細(xì)胞HLA-E的上調(diào)。有研究報(bào)道一些病毒感染的細(xì)胞中也發(fā)生了HLA-E的表達(dá)上調(diào)[7-8，23-24]，認(rèn)為病毒蛋白編碼由人白細(xì)胞抗原E（HLA-E）呈遞的肽（如HCMV（人巨細(xì)胞病毒）、HCV（丙型肝炎病毒））存在病毒感染引起HLA-E表達(dá)上調(diào)的現(xiàn)象。HCMV感染細(xì)胞后，通過其糖蛋白UL40產(chǎn)生的多肽與HLA-E結(jié)合，上調(diào)HLA-E在細(xì)胞表面的表達(dá)，然后通過CD94/NKG2A受體，從而逃脫NK細(xì)胞的裂解[7]。Nattermann等在HCV中也發(fā)現(xiàn)了類似的機(jī)制，HCV導(dǎo)致HLA-E上調(diào)，通過其與CD94/NKG2A的相互作用，從而抑制NK細(xì)胞的裂解功能[8]。但EBV（Epstein-Barr病毒）能夠產(chǎn)生一種多肽綁定HLA-E分子，破壞NKG2A的識(shí)別，導(dǎo)致NK細(xì)胞的激活[23]。與自身肽相反，病毒肽可以增強(qiáng)或抑制HLA-E和受體CD94 / NKG2的結(jié)合，從而影響NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷。本研究構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)VP5蛋白的腫瘤細(xì)胞系，并將其作為評(píng)估VP5蛋白是否調(diào)控自然殺傷細(xì)胞（NK）細(xì)胞毒性的靶細(xì)胞，為后續(xù)oHSV2抗腫瘤作用機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。

［ 參 考 文 獻(xiàn) ］

［1］ ZHAO Q， ZHANG W， NING Z F，et al. A novel oncolytic herpes simplex virus type 2 has potent anti-tumor activity. J PloS one[J]， 2014， 9（03）：e93103.

[2] WANG Y， JIN J， LI Y， et al. NK cell tumor therapy modulated by UV-inactivated oncolytic herpes simplex virus type 2 and checkpoint inhibitors[J]. Translational Research， 2022， 240： 64-86.

[3] HARDCASTLE J， KUROZUMI K， DMITRIEVA N， et al. Enhanced Antitumor Efficacy of Vasculostatin （Vstat120） Expressing Oncolytic HSV-1[J]. Molecular Therapy， 2010， 18（02）： 285-294.

[4] 趙倩. 新Ⅱ型單純皰疹溶瘤病毒的構(gòu)建和功能研究[D]. 北京：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院， 2014.

[5] SELIGER B， JASINSKI-BERGNER S， QUANDT D， et al. HLA-E expression and its clinical relevance in human renal cell carcinoma[J]. Oncotarget. 2016，7（41）：67360-67372.

[6] DAI H-S， GRIFFIN N， BOLYARD C， et al. The Fc domain of immunoglobulin is sufficient to bridge NK cells with virally infected cells[J]. Immunity， 2017， 47（01）： 159-170.

[7] ULBRECHT M， MARTINOZZI S， GRZESCHIK M， et al. Cutting edge： the human cytomegalovirus UL40 gene product contains a ligand for HLA-E and prevents NK cell-mediated lysis[J]. The Journal of Immunology， 2000， 164（10）： 5019.

[8] NATTERMANN J， NISCHALKE H D， HOFMEISTER V， et al. The HLA-A2 restricted T cell epitope HCV Core 35-44 Stabilizes HLA-E expression and inhibits cytolysis mediated by natural killer cells[J]. The American Journal of Pathology， 2005， 166（02）： 443-453.

[9] YUAN S， WANG J， ZHU D， et al. Cryo-EM structure of a herpesvirus capsid at 3.1 [J]. Science， 2018， 360（6384）： eaao7283.

[10] CHEN Y-T， FURUSHIMA K， HOU P-S， et al. Piggybac transposon-mediated， reversible gene transfer in human embryonic stem cells[J]. Stem Cells and Development， 2009， 19（06）： 763-771.

[11] Sandoval-Villegas N， Nurieva W， Amberger M， et al. Contemporary Transposon Tools： A Review and Guide through Mechanisms and Applications of Sleeping Beauty， piggyBac and Tol2 for Genome Engineering[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2021，22（10）：5084.

[12] RUSSELL S J， PENG K-W. Viruses as anticancer drugs[J]. Trends in Pharmacological Sciences， 2007， 28（07）： 326-333.

[13] TOGNARELLI E I， PALOMINO T F， CORRALES N， et al. Herpes simplex virus evasion of early host antiviral responses[J]. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology， 2019，30（09）：127.

[14] DENG M， GUI X， KIM J， et al. LILRB4 signalling in leukaemia cells mediates T cell suppression and tumour infiltration[J]. Nature， 2018， 562（7728）： 605-609.

[15] DUAN Q， ZHANG H， ZHENG J， et al. Turning Cold into Hot： Firing up the Tumor Microenvironment[J]. Trends in Cancer， 2020， 6（07）： 605-618.

[16] LIU Z， RAVINDRANATHAN R， KALINSKI P， et al. Rational combination of oncolytic vaccinia virus and PD-L1 blockade works synergistically to enhance therapeutic efficacy[J]. Nature Communications， 2017， 8（01）： 14754.

[17] RIBAS A， DUMMER R， PUZANOV I， et al. Oncolytic virotherapy promotes intratumoral t cell infiltration and improves Anti-PD-1 Immunotherapy[J]. Cell， 2017， 170（06）： 1109-1119.

[18] MARTIN N T， BELL J C. Oncolytic Virus Combination Therapy： Killing One Bird with Two Stones[J]. Molecular Therapy， 2018， 26（06）： 1414-1422.

[19] SHI G， YANG Q， ZHANG Y， et al. Modulating the tumor microenvironment via oncolytic viruses and CSF-1R inhibition synergistically enhances Anti-PD-1 immunotherapy[J]. Molecular Therapy， 2019， 27（01）： 244-260.

[20] KONTERMANN R E， UNGERECHTS G， NETTELBECK D M. Viro-antibody therapy： engineering oncolytic viruses for genetic delivery of diverse antibody-based biotherapeutics[J]. mAbs， 2021， 13（01）： 1982447.

[21] HONG B， SAHU U， MULLARKEY M P， et al. Replication and spread of oncolytic herpes simplex virus in solid tumors[J]. Viruses， 2022， 14（1）：118.

[22] PERERA MOLLIGODA ARACHCHIGE A S. Human NK cells： From development to effector functions[J]. Innate Immunity， 2021， 27（03）： 212-229.

[23] MBIRIBINDI B， PENA J K， ARVEDSON M P， et al. Epstein–Barr virus peptides derived from latent cycle proteins alter NKG2A+NK cell effector function[J]. Scientific Reports， 2020， 10（01）： 19973.

[24] HAMMER Q， DUNST J， CHRIST W， et al. SARS-CoV-2 Nsp13 encodes for an HLA-E-stabilizing peptide that abrogates inhibition of NKG2A-expressing NK cells[J]. Cell Reports， 2022， 38（10）： 110503.

Construction of A Human Cervical Cancer Cell Line Containingthe Main Capsid Protein VP5 of Stable OncolyticHerpes Simplex Virus Type Ⅱ

FAN Jiaqi ， ZHANG Hui， LI Le， ZHOU Qin， WANG Yang，HU Han， LIU Binlei

（School of Biological Engineering and Food Science， Hubei Univ. of Tech.， Wuhan 430068， China）

Abstract： This paper aims to establish a human cervical cancer HeLa VP5 cell line stably expressing the main capsid protein （VP5） of oncolytic herpes simplex virus type Ⅱ， and to lay a foundation for exploring whether VP5 protein regulates the cytotoxicity of natural killer cells （NK）. To this end， pPBDP-UL19 and pSPBT plasmids were transferred into HeLa cells by using piggyBac transposition system and lipofectamine 3000 TM liposome transfection method; Purinomycin （Puro） was used to screen stable cell lines; Monoclonal cells were obtained by finite dilution method; Western blot was used to identify the expression of VP5 protein in HeLa VP5 cell line; The expression of GFP in HeLa VP5 was detected by flow cytometry; Live cell real time monitoring method was used to compare the growth activity changes of cell lines before and after transformation. The results show that three HeLa VP5 monoclone cells were obtained by purinomycin resistance screening and limited dilution selection; Western blot showed that VP5 protein was expressed in three HeLa VP5 cell lines; The positive rate of GFP was 99% by flow cytometry; The live cell real time monitoring method showed that the HeLa" VP5 cell line had the same growth activity as the parent cell HeLa cells. The HeLa VP5 stably transfected cell line has been successfully constructed as a target cell to evaluate whether VP5 protein regulates the cytotoxicity of natural killer cells （NK）， providing a theoretical basis for revealing the mechanism of oHSV2's anti-tumor effect.

Keywords： oncolytic herpes simplex virus type Ⅱ; Main capsid protein; Stable cell line

［責(zé)任編校： 張 眾］