溶瘤病毒的免疫學機制及臨床研究進展*

楊 豪 張紹庚 楊鵬輝**

（1）中國人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心，北京 100039；2）河北北方學院，張家口 075000）

全球大約1/6的死亡由惡性腫瘤造成（International Agency for Research on Cancer，IARC，2019），是全球第二大死因，每年導致約1千萬人死亡［1-2］。腫瘤的臨床治療需要根據(jù)患者的身體狀況、腫瘤的病理類型、侵犯范圍等情況，綜合采用手術(shù)、化療、放療、免疫治療、中醫(yī)中藥治療、介入治療、微波治療等手段，以期較大幅度地提高治愈率，改善患者的生活質(zhì)量［3-5］。然而，多數(shù)腫瘤患者的臨床療效并不理想，亟需新的治療策略和手段，改善患者預后。

近年來，溶瘤病毒研究領(lǐng)域的迅猛發(fā)展，使其應用于當前最具潛力的腫瘤免疫療法之中。溶瘤病毒可以是天然的或基因修飾的病毒，其抗腫瘤活性涉及多種機制，包括病毒、腫瘤細胞和免疫系統(tǒng)之間的相互作用。此外，將溶瘤病毒注射到腫瘤局部可產(chǎn)生富集作用，周邊未受感染的腫瘤也會產(chǎn)生免疫反應。這種富集效應通過溶瘤病毒的分步活動發(fā)生，從腫瘤細胞的選擇性復制開始，然后誘導免疫細胞死亡，進而促進抗腫瘤免疫反應。此外，溶瘤病毒可以通過基因工程技術(shù)來表達治療基因，從而進一步增強抗腫瘤活性。

溶瘤病毒可以直接破壞腫瘤細胞，還會刺激機體產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應［6-7］。目前已有4種溶瘤病毒產(chǎn)品獲得批準應用于臨床腫瘤治療，超過50種溶瘤病毒產(chǎn)品已進入臨床試驗階段，個別產(chǎn)品已進入到臨床III期（https://ClinicalTrials.gov）［8-10］。盡管溶瘤病毒療法已成為重要的腫瘤免疫治療手段［11-12］，但是以溶瘤病毒療法為基礎(chǔ)，試驗不同的治療方案，產(chǎn)品的臨床轉(zhuǎn)化也面臨諸多挑戰(zhàn)。為了讓溶瘤病毒更有效更特異性地針對腫瘤細胞，病毒與免疫檢查點基因的結(jié)合以提高對腫瘤的特異性靶向作用，成為腫瘤免疫治療的新視角［13-16］。分子生物學和基因工程技術(shù)的發(fā)展使病毒基因組改造技術(shù)逐漸成熟，溶瘤病毒在靶向性、安全性及溶瘤效果方面都有了顯著進步［17-18］。本文綜述了溶瘤病毒的發(fā)展史、溶瘤病毒的作用機制，以及目前溶瘤病毒的種類、面臨的挑戰(zhàn)等。

1 溶瘤病毒的發(fā)展歷程

1904年，《柳葉刀》（The Lancet）雜志報道，一位患有慢性白血病的婦女無意間感染流感病毒后，白血病癥狀意外好轉(zhuǎn)，這一奇特的現(xiàn)象使人們開始意識到病毒和腫瘤作為醫(yī)學上兩大難以攻克的疾病，或許可以相互影響，開創(chuàng)了病毒治療腫瘤的先河［19］。1912年，意大利醫(yī)生Depace，發(fā)現(xiàn)一位宮頸癌患者，在接種減毒狂犬病疫苗后腫瘤自發(fā)地消退縮小，自此，揭開了病毒治療腫瘤的歷史，溶瘤病毒登上腫瘤免疫治療的舞臺［20］。此后，溶瘤病毒作為一種有前途的腫瘤治療方式被大量的研究，1950～1980年間，許多科學家直接利用多種野生型病毒（例如肝炎病毒、西尼羅河病毒、登革病毒、黃熱病毒等）感染治療數(shù)百個病例不同的腫瘤，但由于醫(yī)療條件差、技術(shù)水平低，對病毒及腫瘤機制的科學認識不足等因素影響，療效極不理想，溶瘤病毒發(fā)展非常緩慢［21-24］。1991年，首次對單純皰疹病毒1型（HSV-1）進行胸苷激酶（thymidine kinase，TK）敲除的基因改造，溶瘤病毒的研究開始突飛猛進［25］。1996年，研究證明帶有E1B55k基因突變的腺病毒可選擇性地在p53缺陷的腫瘤細胞中復制［26］，因此可以作為溶解腫瘤的病毒來發(fā)揮作用，隨后基因改造的腺病毒ONYX-015進入I期臨床試驗［27］。2004年拉脫維亞批準一款非致病性的人腸道細胞病變孤兒病毒（enteric cytopathic human orphan virus） ——RIGVIR，用于黑色素瘤的臨床治療，成為第一款獲得監(jiān)管機構(gòu)批準的用于腫瘤治療的溶瘤病毒［28-29］。2005年，經(jīng)改造的腺病毒H101（Oncorine，重組人5型腺病毒注射液，安柯瑞）在中國獲批上市［30-31］。2015年10月，F(xiàn)DA批準T-VEC（Talimogene laherparepvec，Imlygic）上市，T-VEC是一種經(jīng)過基因修飾的1型單純皰疹病毒（HSV-1），用于治療晚期黑色素瘤，它可以在腫瘤細胞內(nèi)復制并表達粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF），這是首個獲得FDA批準的溶瘤病毒類治療藥物［32-33］。2016年分別在歐洲和加拿大獲批上市，標志著溶瘤病毒技術(shù)的成熟和對溶瘤病毒療效的正式認可。2017年9月，《細胞》（Cell）報道溶瘤病毒T-VEC與PD-1抗腫瘤藥物Keytruda聯(lián)合用藥用于治療黑色素瘤，腫瘤緩解率高達62%，其中33%為完全緩解，掀起了溶瘤病毒聯(lián)合療法研究的熱潮［34-35］。2021年11月1日，日本第一三共制藥股份有限公司宣布第三代HSV-1溶瘤病毒產(chǎn)品Delytact（Teserpaturev/G47Δ）被批準上市，這是首個獲批上市用于治療惡性膠質(zhì)瘤的溶瘤病毒產(chǎn)品，也是目前全球獲批上市的第4款溶瘤病毒產(chǎn)品。該產(chǎn)品具有更強的復制能力和更高的抗腫瘤活性，其在治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤、乳腺癌、前列腺癌、神經(jīng)鞘瘤、鼻咽癌、肝細胞癌、結(jié)腸直腸癌、惡性周圍神經(jīng)鞘瘤和甲狀腺癌均有效［36］。溶瘤病毒發(fā)展歷程見圖1。溶瘤病毒療法發(fā)展至今，已成為臨床上最有希望的癌癥免疫治療手段，受到國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。

Fig.1 Development of oncolytic virus圖1 溶瘤病毒發(fā)展歷程

截止目前，全球已批準上市的有4款溶瘤病毒產(chǎn)品（表1），包括拉脫維亞Sia Latima公司治療黑色素瘤和其他惡性腫瘤的RIGVIR、上海三維生物公司治療鼻咽癌的安科瑞H101、美國Amgen旗下Biovex治療黑色素瘤的T-VEC以及日本第一三共公司治療膠質(zhì)細胞瘤的Delytact（Teserpaturev）。

2 溶瘤病毒分類

前期研究表明，溶瘤病毒是小顆粒，病毒大小多數(shù)分布在20～200 nm之間，在腫瘤細胞中的選擇性復制是可用于腫瘤免疫療法非常重要的特性，復制能力取決于病毒感染能力、腫瘤細胞的特性以及宿主抵抗力［37］。病毒主要由遺傳物質(zhì)和蛋白質(zhì)組成，由單鏈或雙鏈RNA或DNA組成基因組（附件表S1）；外面包裹著一層有規(guī)律排列的蛋白質(zhì)亞單位被稱為衣殼［38］。腫瘤免疫治療的溶瘤病毒的選擇取決于許多特性，包括潛在的致病性、免疫原性、編碼治療能力的基因，在制造過程中可實現(xiàn)的病毒滴度和病毒穩(wěn)定性。病毒生命周期有5個不同的階段——吸附、進入和脫殼、復制、組裝、釋放。在每個階段均可利用基因工程技術(shù)對病毒基因組進行調(diào)節(jié)，并可以設計成靶向腫瘤細胞內(nèi)分泌和復制［39］。此外，病毒表現(xiàn)出的致病性和免疫原性，因病毒種類、劑量、接種途徑、原宿主免疫等因素而異，是能夠促進有效抗腫瘤免疫的特征［40］。

目前在Clinical Trials網(wǎng)站注冊的溶瘤病毒主要有：痘病毒、腺病毒、HSV-1、呼腸孤病毒、麻疹病毒、新城疫病毒、柯薩奇病毒、水泡型口炎病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒等，其中以痘苗病毒、腺病毒和單純皰疹病毒最多（附件表S1）［41］。由于腺病毒基因重組制備比較容易，臨床開發(fā)廣，試驗開展最多，而HSV-1和痘苗病毒等因其基因組比較大，可加入任意的外來基因，在基因改造或修飾方面具有很大優(yōu)勢，應用備受青睞［42］。本課題組前期創(chuàng)新性利用流感病毒反向遺傳學技術(shù)，建立了成熟的流感病毒為載體的重組溶瘤病毒技術(shù)體系，成功獲得了嵌合外源基因GM-CSF、免疫檢查點PD-1、CTLA4抑制劑抗體等的多株重組溶瘤流感病毒，體內(nèi)外實驗證實溶瘤病毒具有良好的安全性、有效性和穩(wěn)定性，有望為臨床腫瘤免疫治療提供新策略［43-44］。

3 溶瘤病毒靶向殺傷腫瘤細胞的免疫學機制

溶瘤病毒是當前腫瘤治療中極具前景的免疫治療藥物，其抗腫瘤活性通過影響腫瘤免疫周期的多種機制介導。溶瘤病毒殺傷腫瘤細胞的機制尚未完全研究清楚，目前公認的機制主要有：溶瘤病毒通過自我復制在腫瘤細胞中大量增殖，最終裂解腫瘤細胞，進而釋放更多的溶瘤病毒，引起腫瘤溶解；溶瘤病毒可以誘導全身及局部抗腫瘤免疫，激活T細胞靶向殺傷腫瘤細胞，使腫瘤消退［45］。

a.靶向腫瘤細胞裂解作用：作為有前途的腫瘤基因治療劑，溶瘤病毒具有在腫瘤細胞中大量復制并導致腫瘤細胞衰退甚至死亡的獨特能力，在正常組織中不復制，進一步導致腫瘤相關(guān)抗原暴露引起機體免疫反應［46］。溶瘤病毒這種腫瘤嗜性（溶瘤病毒在腫瘤細胞中的選擇性復制能力）是溶瘤病毒作為腫瘤免疫療法非常重要的特性［47］。盡管有些病毒表現(xiàn)出天生的抗腫瘤傾向性，但其他病毒必須通過基因工程技術(shù)加工后選擇性感染腫瘤細胞［48］。感染后，病毒會利用腫瘤細胞的蛋白質(zhì)工廠，使腫瘤細胞無法產(chǎn)生足夠的蛋白質(zhì)滿足生長需要，從而破壞腫瘤細胞的正常生理過程［49］。

b.抗腫瘤免疫應答：溶瘤病毒誘導局部和全身特異性抗腫瘤免疫。誘導機體腫瘤特異性免疫反應是溶瘤病毒根除腫瘤的關(guān)鍵因素［50］。溶瘤病毒的治療效果取決于直接腫瘤細胞溶解和間接激活抗腫瘤免疫反應的組合。在感染溶瘤病毒后，腫瘤細胞啟動由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）和基因毒性應激組成的抗病毒反應。這種反應導致活性氧（ROS）的上調(diào)和抗病毒細胞因子的產(chǎn)生［51］。活性氧和細胞因子，特別是I型干擾素（IFN），從受感染的腫瘤細胞釋放并刺激免疫細胞（抗原呈遞細胞、CD8+T細胞和自然殺傷（NK）細胞）［52］。溶瘤病毒感染腫瘤細胞死亡，引起腫瘤溶解，隨后釋放腫瘤相關(guān)抗原，子代病毒、病原體相關(guān)分子模式（PAMP）、危險相關(guān)分子模式信號（DAMP）和包括新抗原在內(nèi)的腫瘤相關(guān)抗原（TAAs），可促進適應性免疫反應，通過激活Toll樣受體（TLR）等受體刺激免疫系統(tǒng)［53-54］。

溶瘤病毒作為內(nèi)源性抗原如何進入ER、如何與主要組織相容性復合體（MHC）I類分子結(jié)合及APC細胞中如何提呈給CD8+T細胞是一個復雜的過程。人類MHC表達在不同細胞表面。MHC基因調(diào)節(jié)機體對各種病原體產(chǎn)生最佳免疫應答，以適應多變的內(nèi)外環(huán)境［55-56］。在T細胞分化發(fā)育中是必不可少的，且對免疫應答的啟動和調(diào)節(jié)發(fā)揮著重要作用?？乖f呈細胞（antigen-presenting cell，APC）是一類具有攝取、加工、遞呈胞外（外源）抗原，激活CD4+T細胞的細胞，且都可表達MHCⅠ類分子［56］。APC細胞包括巨噬細胞（macrophage，Mф）、樹突細胞（dendritic cell，DC）和B淋巴細胞，其中樹突狀細胞在體內(nèi)數(shù)量很少，但分布很廣［57］。已有研究表明DC在外周攝取病毒抗原、腫瘤相關(guān)抗原/新生抗原后被激活，進入引流淋巴結(jié)，分化為成熟的DC［58］。失去主動攝取抗原的能力，上調(diào)并高表達MHC分子、協(xié)同刺激分子和黏附分子［59］。淋巴結(jié)中的DC主要集中在T細胞區(qū)，它們已不具有吞噬功能，當溶瘤病毒進入細胞，DC對它們進行加工呈遞。通過MHCⅠ類和Ⅱ類分子呈遞病毒抗原，激活CD4+和CD8+T細胞。加工呈遞的抗原分為內(nèi)源性抗原和外源性抗原。溶瘤病毒感染后進入胞質(zhì)屬于內(nèi)源性抗原，被宿主細胞識別后被蛋白酶水解，產(chǎn)生的肽段被抗原加工相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白（TAP）有選擇性地從胞質(zhì)轉(zhuǎn)運到ER，并在此與新合成的MHCⅠ類分子結(jié)合［60］。而后一起表達于細胞膜上，在這里被CD8+T細胞上的TCR識別。內(nèi)源性抗原肽加工、Ⅰ類分子與抗原肽結(jié)合過程結(jié)束。結(jié)合肽后的Ⅰ類分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，從ER進入高爾基體經(jīng)糖基化修飾后，通過胞吐轉(zhuǎn)運到細胞表面，供CD8+T細胞識別［61］。經(jīng)過加工的抗原以MHC/肽復合物形式表達在靶細胞或APC表面，由表達特異性TCR的CD4+T細胞或CD8+T細胞對之進行選擇性識別［62］。未致敏T細胞在周圍淋巴器官與APC相遇并被激活，而已致敏的T細胞則離開周圍淋巴器官，經(jīng)血流到達遠端腫瘤部位發(fā)揮效應功能。

在由此產(chǎn)生的免疫刺激環(huán)境中，抗原呈遞細胞釋放并吸收TAAs和NEO（新生抗原），在未暴露于病毒的遠處腫瘤部位介導腫瘤消退。這些會激活抗原特異性CD4+和CD8+T細胞反應［63］。一旦被激活，CD8+T細胞可以擴展為細胞毒性效應細胞，能夠進入已確定的腫瘤生長部位，并在抗原識別后介導抗腫瘤免疫（圖2）［64］。

然而，病毒誘導機體抗病毒免疫反應的能力可能通過中和抗病毒抗體和細胞毒性T細胞介導的免疫反應清除病毒。病毒中和作用對腫瘤免疫誘導的影響程度是復雜的，可能受到許多變量的影響，最顯著的是病毒和腫瘤微環(huán)境的特征。腫瘤相關(guān)抗原的釋放，特別是與局部細胞因子和DAMP釋放相結(jié)合，有利于誘導針對腫瘤細胞的先天性和適應性免疫反應（圖2）［65］。這種效應對于在未注射或未暴露于病毒的遠處腫瘤部位調(diào)節(jié)腫瘤消退可能極為重要。臨床前研究已經(jīng)證明腫瘤特異性CD8+T細胞在溶瘤病毒介導的腫瘤免疫反應中的重要性［66］。I型干擾素和DAMP也可以直接激活NK細胞，這是天然免疫應答反應的重要部分。NK細胞可以殺死MHC I類表達下調(diào)的靶細胞，這在腫瘤細胞中很常見［67］。NK細胞的影響可能取決于宿主種類和病毒的特征［68-69］。此外，NK細胞通過清除病毒感染的細胞而損害溶瘤病毒的效力［70］。多種因素綜合產(chǎn)生針對病毒感染腫瘤細胞的免疫反應，以及針對未感染的腫瘤細胞上表達TAAs/NEO抗原的從頭免疫反應［71］。但影響免疫介導的病毒清除和誘導抗腫瘤免疫之間平衡的因素尚不完全清楚。

總之，溶瘤病毒破壞病毒感染的腫瘤細胞，釋放細胞因子，減少腫瘤生長，并從即將死亡的腫瘤細胞中獲取病毒和腫瘤抗原，以呈現(xiàn)和激活T細胞，激活機體的局部和全身免疫，起到抗腫瘤的效果［72］。

Fig.2 Mechanism of action of oncolytic viruses圖2 溶瘤病毒的作用機制

4 挑戰(zhàn)與展望

近年來，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，人們對病毒基因功能和結(jié)構(gòu)的認識不斷深入，優(yōu)化設計和操作病毒基因組以產(chǎn)生非致病性病毒已成為溶瘤病毒研究的方向，極大推動了溶瘤病毒療法的進步。經(jīng)基因修飾的溶瘤病毒，可以靶向感染腫瘤細胞，增強機體免疫反應，毒副作用降低，成為更穩(wěn)定的表達載體。2015年T-VEC被批準用于晚期黑色素瘤患者臨床治療，2021年Delytact被批準用于惡性膠質(zhì)瘤的臨床治療，溶瘤病毒療法在癌癥治療中取得了重大飛躍，溶瘤病毒療法已成為腫瘤免疫治療的一種重要手段。

盡管諸多臨床試驗結(jié)果證實溶瘤病毒療法具有良好的安全性、有效性和穩(wěn)定性，但該療法仍存在一定的局限性亟待解決。本課題組［44］在拯救重組溶瘤流感病毒的過程中也遇到諸多難題。a.如何從基因序列源頭優(yōu)化設計病毒，提高溶瘤病毒靶向性，避免對正常細胞的影響，降低個體差異性；b.如何避免溶瘤病毒在進入腫瘤細胞前被人體免疫系統(tǒng)清除；c.溶瘤病毒療法的生物安全性還需進一步研究，基因重組的溶瘤病毒是否會基因重排、基因突變，甚至產(chǎn)生超級病毒；d.目前用于臨床治療或試驗的溶瘤病毒類型有限，是否有其他對人類更友好且更易操作的病毒有待進一步探索。為解決以上問題，進一步提高溶瘤病毒療法的治療效果，使患者獲益，仍需要更多的臨床試驗來保證溶瘤病毒療法的安全性和有效性，確定最佳的給藥劑量和給藥途徑以達到最優(yōu)的治療效果，此外應盡快構(gòu)建更多類型的溶瘤病毒用于臨床治療［73］。

溶瘤病毒與化療或免疫治療藥物聯(lián)合治療，甚至多種溶瘤病毒藥物聯(lián)合應用，可能會更有效地控制腫瘤進展或治愈腫瘤，為腫瘤患者提供極具潛力的臨床治療選擇?，F(xiàn)有臨床證據(jù)表明，溶瘤病毒可以加強腫瘤對免疫調(diào)節(jié)檢查點抑制劑、CAR-T細胞等免疫治療方法的反應率，是聯(lián)合治療策略中的理想對象。相信隨著溶瘤病毒研究的不斷深入，溶瘤病毒療法在治療人類疾病中將會發(fā)揮更廣泛、更深入的作用。附件 PIBB_20210340_Table S1.pdf請見本文網(wǎng)絡版（www.pibb.ac.cn或www.cnki.net）

Table 1 Oncolytic virus products on the market表1 已上市的溶瘤病毒產(chǎn)品