間歇性θ節(jié)律經(jīng)顱磁刺激改善大鼠工作記憶的海馬與前額葉跨腦區(qū)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)效應(yīng)研究*

張?zhí)旌?郭苗苗 徐桂芝 吉利輝 王中豪

（河北工業(yè)大學(xué)電氣工程學(xué)院，省部共建電工裝備可靠性與智能化國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市生物電工與智能健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300130）

經(jīng)顱磁刺激（transcranial magnetic stimulation，TMS）是一種非侵入、非藥物治療的神經(jīng)調(diào)控技術(shù)，在探索大腦認(rèn)知功能和治療腦疾病方面得到廣泛的應(yīng)用，具有重要的臨床價(jià)值［1-3］。θ節(jié)律刺激（theta burst stimulation，TBS）是一種模擬神經(jīng)節(jié)律放電特性的新型TMS刺激模式，與傳統(tǒng)的重復(fù)TMS相比，刺激強(qiáng)度降低，刺激時(shí)長(zhǎng)縮短，被認(rèn)為是更有效的刺激模式，并隨后被用于進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的頻率刺激［4-5］。TBS按照間隔時(shí)間不同分為間歇性TBS（intermittent TBS，iTBS）和連續(xù)性TBS（continuous TBS，cTBS）。研究表明，iTBS可以對(duì)大腦皮層產(chǎn)生興奮效果［6］，改善大腦認(rèn)知功能，但其電生理機(jī)制仍不清楚。Blumberger等［7］研究了iTBS和rTMS兩種刺激模式在治療抑郁癥方面的應(yīng)用，結(jié)果表明iTBS的治療效果與10 Hz rTMS的治療效果相當(dāng)，但iTBS的治療周期更短。

工作記憶（working memory，WM）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的高級(jí)功能，在許多復(fù)雜任務(wù)的高級(jí)認(rèn)知活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用，如理解、閱讀及學(xué)習(xí)等［8］。WM障礙是神經(jīng)系統(tǒng)正常衰老和一些神經(jīng)退行性疾病，如輕度認(rèn)知障礙、阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）等的主要臨床表現(xiàn)之一，因此研究WM的神經(jīng)機(jī)制對(duì)WM障礙等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療具有重要的科學(xué)價(jià)值［9］。工作記憶是較高認(rèn)知能力的基礎(chǔ)，腹側(cè)海馬（ventral hippocampus，vHPC）和內(nèi)側(cè)前額葉皮層（medial prefrontal cortex，mPFC）腦區(qū)是工作記憶的主要責(zé)任腦區(qū)［10］。近年來(lái)已有研究證明，TMS作用于大腦多靶區(qū)可以有效改善AD患者的認(rèn)知功能和記憶［11］，特別是輕度障礙患者和AD早期。王欣［12］通過(guò)對(duì)AD轉(zhuǎn)基因鼠的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，TMS可以實(shí)現(xiàn)對(duì)AD早期異常神經(jīng)活動(dòng)的調(diào)控，并實(shí)現(xiàn)了對(duì)AD認(rèn)知障礙的延緩。同時(shí)，iTBS的刺激方案也被廣泛用于研究AD患者記憶障礙皮質(zhì)可塑性的調(diào)節(jié)機(jī)制［13］，iTBS可以通過(guò)誘導(dǎo)突觸可塑性來(lái)影響腦內(nèi)的神經(jīng)活動(dòng)，同時(shí)神經(jīng)元的突觸可塑性與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)［14］，這種新的刺激模式也為探索大腦認(rèn)知功能的神經(jīng)調(diào)控提供新的有效干預(yù)方法和手段。

大腦是一個(gè)非常復(fù)雜的系統(tǒng)，多個(gè)神經(jīng)元、神經(jīng)元集群或者多個(gè)腦區(qū)相互連接成龐雜的結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)，并通過(guò)相互作用完成腦的各種功能［15］。在體多通道記錄技術(shù)能夠長(zhǎng)期穩(wěn)定記錄動(dòng)物清醒狀態(tài)下大腦多個(gè)腦區(qū)的神經(jīng)元電活動(dòng)信號(hào)，為研究大腦特定目標(biāo)腦區(qū)的神經(jīng)活動(dòng)提供有效技術(shù)手段［16］。大腦結(jié)構(gòu)和功能的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)連接與腦認(rèn)知機(jī)制之間存在緊密聯(lián)系［17］，學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能的實(shí)現(xiàn)需要大腦多個(gè)腦區(qū)的神經(jīng)同步活動(dòng)，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)研究已經(jīng)成為腦功能與腦疾病研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)［18］。有研究表明，在空間工作記憶任務(wù)期間，vHPC-mPFC網(wǎng)絡(luò)中雙向信息流增加，認(rèn)為信息流的增加預(yù)測(cè)了記憶的準(zhǔn)確性［19］。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)，記憶和認(rèn)知能力下降與大腦不同腦區(qū)之間聯(lián)系的改變有關(guān)，這可能是由相應(yīng)腦區(qū)之間結(jié)構(gòu)和功能上的連接障礙所致［20-21］。工作記憶障礙被認(rèn)為是大腦認(rèn)知功能衰退的核心特征，它來(lái)源于局部腦回路與遠(yuǎn)程腦回路間的失聯(lián)［22］，Dai等［23］基于磁共振成像和圖論網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)AD患者的臨床表現(xiàn)與大腦功能連接網(wǎng)絡(luò)或結(jié)構(gòu)連接的異常有關(guān)。因此，從前額葉-海馬神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)協(xié)同性的角度探索經(jīng)顱磁刺激對(duì)工作記憶的調(diào)控機(jī)制研究具有十分重要的意義和價(jià)值［24］。

因此，本文應(yīng)用工作記憶行為學(xué)和電生理學(xué)，通過(guò)在體多通道微電極記錄技術(shù)，記錄并獲取工作記憶過(guò)程中大鼠mPFC和vHPC的局部場(chǎng)電位（local field potentials，LFPs）信號(hào)，基于時(shí)域格蘭杰因果方法，深入分析了mPFC-vHPC雙腦區(qū)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)連接，從神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)協(xié)同性的角度，研究了iTBS磁刺激模式對(duì)工作記憶過(guò)程中跨腦區(qū)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控作用，為臨床TMS模式優(yōu)化提供科學(xué)依據(jù)與理論支撐，具有重要的學(xué)術(shù)價(jià)值和應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 磁刺激大鼠模型制備

本文以12只成年雄性Wistar大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，隨機(jī)分為刺激模型組和對(duì)照組，每組6只，大鼠周齡為8～10周，體重約300 g，本實(shí)驗(yàn)均已由河北工業(yè)大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過(guò)（審查編號(hào)：HEBUTaCUC201905）。

TMS設(shè)備采用重復(fù)脈沖磁刺激系統(tǒng)（英國(guó)Magstim公司生產(chǎn)，型號(hào)：Rapid2），刺激線圈采用8字型線圈。刺激時(shí)，將大鼠的頭部固定，同時(shí)避免其掙扎減少應(yīng)激反應(yīng)。刺激線圈放置在與大鼠的頂骨平行的頭皮表面上方約2～3 mm處。刺激組采用iTBS經(jīng)顱磁刺激模式對(duì)大鼠頭部進(jìn)行刺激，刺激強(qiáng)度為100%運(yùn)動(dòng)閾值，刺激頻率為5 Hz，每天刺激600個(gè)脈沖，刺激總時(shí)長(zhǎng)為14 d，對(duì)照組大鼠不進(jìn)行任何刺激操作。經(jīng)顱磁刺激的TBS模式中每個(gè)脈沖又包含3個(gè)50 Hz的高頻脈沖，iTBS刺激模式為刺激2 s，間隔8 s（圖1）。

Fig.1 Schematic diagram of iTBS magnetic stimulation paradigm

1.2 電極植入與數(shù)據(jù)采集

磁刺激完成后，利用在體多通道技術(shù)對(duì)大鼠進(jìn)行電極植入手術(shù)，分別在大鼠vHPC和mPFC腦區(qū)各植入8通道微電極陣列（1～8通道為mPFC，9～16通道為vHPC），電極位置排布均為2×4（圖2b）。

首先，在大鼠腹腔注射水合氯醛（40 mg/kg）進(jìn)行麻醉，皮下注射阿托品以減少呼吸道分泌。待其麻醉后，剔除大鼠頭部毛發(fā)并將其頭部固定在立體定位儀上。切開頭部皮膚，暴露顱骨，找到冠狀縫與矢狀縫的交點(diǎn)，為前囟點(diǎn)位置。參考大鼠腦定位圖譜［25］，以前囟點(diǎn)為參考原點(diǎn)，定位mPFC腦區(qū)（向前2.5～4.5 mm，旁開0.2～1.0 mm，深度2.5～3.0 mm）和vHPC腦區(qū)（向后4.0～5.3 mm，旁開4.0～5.0 mm，深度7.5～8.5 mm）（圖2）。

Fig.2 The location of electrode placement in brain regions of rats and the LFPs signals

使用顱鉆在顱骨上述定位區(qū)域各開一個(gè)矩形窗，暴露并移除硬腦膜，將雙腦區(qū)微電極陣列緩慢垂直推進(jìn)至目標(biāo)腦區(qū)深度，同時(shí)，對(duì)記錄到的神經(jīng)元信號(hào)進(jìn)行持續(xù)監(jiān)控，最后用牙科水泥和不銹鋼螺釘進(jìn)行固定。手術(shù)完成后，將大鼠放回飼養(yǎng)籠進(jìn)行單獨(dú)飼養(yǎng)，恢復(fù)期2 d后，進(jìn)行T迷宮工作記憶行為學(xué)任務(wù)，并同步采集記錄行為學(xué)過(guò)程中的大鼠vHPC和mPFC腦區(qū)的LFPs信號(hào)。

本文應(yīng)用在體多通道神經(jīng)電生理信號(hào)采集系統(tǒng)（美國(guó)Plexon公司生產(chǎn)，OmniPlex128）對(duì)大鼠vHPC和mPFC腦區(qū)的神經(jīng)電信號(hào)進(jìn)行記錄，采樣頻率為1 kHz，通過(guò)500 Hz低通濾波從神經(jīng)電信號(hào)中提取原始LFPs信號(hào)，再經(jīng)過(guò)去除50 Hz工頻干擾和基線漂移，以及0.5～100 Hz濾波等預(yù)處理，然后用于后續(xù)的數(shù)據(jù)處理與分析。

Fig.3 T Maze WMbehavioral task

1.3 T迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

本文應(yīng)用T迷宮［26-27］行為學(xué)實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)大鼠工作記憶能力。大鼠恢復(fù)期過(guò)后，開始對(duì)大鼠進(jìn)行2 d適應(yīng)性訓(xùn)練，即讓大鼠在迷宮中自由探索，2次/d，每次30 min，隨后開始正式訓(xùn)練任務(wù)。每天對(duì)每只大鼠進(jìn)行兩組T迷宮WM任務(wù)訓(xùn)練，每組訓(xùn)練包含20次實(shí)驗(yàn)。每次實(shí)驗(yàn)任務(wù)均包括自由選擇和延時(shí)交替選擇兩個(gè)階段（圖3）。任務(wù)開始前，在T迷宮左右兩目標(biāo)臂端放置食物獎(jiǎng)勵(lì)；任務(wù)開始后，大鼠從起始端出發(fā)，首先進(jìn)行自由選擇階段，此時(shí)大鼠可以任意進(jìn)入一個(gè)目標(biāo)臂端，并獲得食物獎(jiǎng)勵(lì)。隨后大鼠回到起始端經(jīng)過(guò)5～10 s延遲，重新出發(fā)，開始延時(shí)交替選擇階段。此時(shí)當(dāng)大鼠選擇與自由選擇階段不同目標(biāo)臂端時(shí)，大鼠可以獲得食物獎(jiǎng)勵(lì)，并視為正確執(zhí)行WM任務(wù)；而當(dāng)大鼠選擇與自由選擇階段同一目標(biāo)臂端時(shí)，則大鼠不能獲得食物獎(jiǎng)勵(lì)，視為錯(cuò)誤執(zhí)行WM任務(wù)。一次實(shí)驗(yàn)任務(wù)完成以后，大鼠返回到起始區(qū)域，準(zhǔn)備重新開始下一次WM任務(wù)訓(xùn)練。在大鼠執(zhí)行T迷宮WM任務(wù)行為學(xué)過(guò)程中同步采集記錄vHPC和mPFC腦區(qū)的LFPs信號(hào)。

記錄每天大鼠行為學(xué)數(shù)據(jù)結(jié)果，以正確執(zhí)行WM任務(wù)次數(shù)占總?cè)蝿?wù)次數(shù)的百分比表示大鼠每天任務(wù)的正確率。當(dāng)大鼠執(zhí)行T迷宮WM任務(wù)的正確率達(dá)到并保持在80%以上連續(xù)2 d，認(rèn)為其“學(xué)會(huì)”此任務(wù)。在大鼠進(jìn)行T迷宮工作記憶行為學(xué)任務(wù)的同時(shí)，同步采集記錄行為學(xué)過(guò)程中的大鼠vHPC和mPFC腦區(qū)的LFPs信號(hào)。將大鼠正確執(zhí)行工作記憶任務(wù)中延時(shí)交替選擇階段的LFPs數(shù)據(jù)用于后續(xù)的網(wǎng)絡(luò)計(jì)算和分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

本文基于格蘭杰因果［28-29］（Granger causality，GC）網(wǎng)絡(luò)連接模型，構(gòu)建復(fù)雜因果網(wǎng)絡(luò)，對(duì)比分析不同組大鼠在工作記憶任務(wù)過(guò)程中vHPC-mPFC跨腦區(qū)網(wǎng)絡(luò)的因果關(guān)聯(lián)特性，研究iTBS磁刺激對(duì)大鼠工作記憶的跨腦區(qū)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制。

格蘭杰因果關(guān)系GC值的大小反映了不同電極通道之間神經(jīng)信號(hào)因果連接的強(qiáng)度大小。計(jì)算神經(jīng)信號(hào)每?jī)蓚€(gè)通道之間的因果連接GC值，同時(shí)采用Bonferronni校正計(jì)算有顯著性（P<0.05）的格蘭杰因果GC值，去除無(wú)效連接，這樣可以得到一個(gè)因果連接矩陣網(wǎng)絡(luò)GCd：

其中，GCij表示通道j對(duì)通道i的因果連接。分別計(jì)算vHPC與mPFC腦區(qū)內(nèi)部以及vHPC-mPFC神經(jīng)信號(hào)每?jī)蓚€(gè)通道之間的因果連接GC值，可以分別構(gòu)建得到vHPC與mPFC腦區(qū)自身的因果網(wǎng)絡(luò)，以及vHPC-mPFC兩個(gè)腦區(qū)的跨腦區(qū)因果網(wǎng)絡(luò)。

然后在矩陣網(wǎng)絡(luò)GCd的基礎(chǔ)上，對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行閾值化處理剔除網(wǎng)絡(luò)偽連接，得到二值矩陣網(wǎng)絡(luò)GCb：

其中，GCbij的值只為0或者1，當(dāng)GCbij大于閾值為1，小于閾值為0。當(dāng)計(jì)算每個(gè)腦區(qū)內(nèi)因果連接時(shí)，對(duì)角線為節(jié)點(diǎn)自連接，設(shè)置為0。

在二值矩陣網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步計(jì)算網(wǎng)絡(luò)連接強(qiáng)度、連接密度、全局效率以及因果流向性等網(wǎng)絡(luò)特性進(jìn)行對(duì)比分析。

網(wǎng)絡(luò)連接密度可以表征網(wǎng)絡(luò)通道節(jié)點(diǎn)之間連接數(shù)目的多少，用CD表示：

其中，N表示通道數(shù)量，K表示矩陣網(wǎng)絡(luò)中所有非零元素的數(shù)量。

全局效率指的是網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點(diǎn)之間最短路徑長(zhǎng)度的調(diào)和平均數(shù)的倒數(shù)，最短路徑長(zhǎng)度表示網(wǎng)絡(luò)中從一個(gè)節(jié)點(diǎn)到另一個(gè)節(jié)點(diǎn)的最短連接邊的長(zhǎng)度。全局效率是衡量網(wǎng)絡(luò)對(duì)信息的總體傳輸能力的全局指標(biāo)，用Eg表示：

其中，dij表示從節(jié)點(diǎn)j到節(jié)點(diǎn)i的最短路徑，auv表示從節(jié)點(diǎn)j到節(jié)點(diǎn)i的連接邊，Lij表示從節(jié)點(diǎn)j到節(jié)點(diǎn)i的最短路徑長(zhǎng)度。

節(jié)點(diǎn)的度定義為網(wǎng)絡(luò)中與節(jié)點(diǎn)之間相連的其他節(jié)點(diǎn)數(shù)目，一個(gè)節(jié)點(diǎn)的度越大意味著這個(gè)節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中越重要。在有向網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點(diǎn)的度包括出度和入度，節(jié)點(diǎn)總的度大小為該節(jié)點(diǎn)出度與入度的和：

其中，kiin為入度，表示其他通道對(duì)通道i有因果連接的通道數(shù)；kiout為出度，表示通道i對(duì)其他通道有因果連接的通道數(shù)。

因果流向性是復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)連接中的一個(gè)重要性質(zhì)。網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的因果流向定義為其出度和入度之間的差值，用CFi表示：

其中，CFi值大于0，表示該節(jié)點(diǎn)對(duì)整個(gè)網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生強(qiáng)烈的因果影響，為因果源，反之CFi值小于0，表示該節(jié)點(diǎn)為因果匯。

1.5 組織學(xué)檢驗(yàn)

在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)大鼠腦組織進(jìn)行切片，驗(yàn)證微電極陣列在大鼠腦區(qū)的植入位置。將大鼠全腦完整地取出，放入多聚甲醛溶液中進(jìn)行浸泡固定24 h，再將全腦放入30%的蔗糖溶液中進(jìn)行脫水，等待大腦沉降24 h后取出，分別進(jìn)行前額葉和海馬腦區(qū)的修塊保留，然后使用振動(dòng)切片機(jī)，沿電極植入方向進(jìn)行大腦冠狀切片，腦片厚度為150μm，將切好的腦片按照順序貼在載玻片上，并用中性樹膠進(jìn)行封片，最后應(yīng)用光學(xué)顯微鏡拍照記錄實(shí)際電極植入位置，并與大鼠腦圖譜進(jìn)行比對(duì)，驗(yàn)證植入位置是否在海馬腦區(qū)和前額葉皮層。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P值大小為參考對(duì)不同組間數(shù)據(jù)差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義進(jìn)行判斷，認(rèn)為當(dāng)P＜0.05時(shí)數(shù)據(jù)具有顯著性差異并記為“*”，同時(shí)P＜0.01時(shí)記為“**”，P＜0.001時(shí)記為“***”。

2 結(jié) 果

2.1 組織學(xué)驗(yàn)證結(jié)果

對(duì)大鼠腦組織進(jìn)行切片檢測(cè)，記錄大鼠前額葉皮層和海馬腦區(qū)的切片圖，并與大鼠腦圖譜進(jìn)行對(duì)照，結(jié)果如圖4所示。

Fig.4 The histological representations of the electrode positions

圖4右側(cè)部分為標(biāo)準(zhǔn)腦圖譜［25］，圖中PrL和CA1分別為前囟點(diǎn)前4.20 mm前額葉皮層和前囟點(diǎn)后5.04 mm海馬腦區(qū)位置；左側(cè)為實(shí)際大腦切片圖，由于微電極陣列位置排布均為2×4，在腦組織切片上可以觀察到兩列電極孔道，圖中黑色框和黑色箭頭表示為兩列電極孔道位置和電極末端位點(diǎn)。

2.2 行為學(xué)統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)每組大鼠“學(xué)會(huì)”工作記憶任務(wù)所需時(shí)長(zhǎng)天數(shù)，作為評(píng)價(jià)大鼠工作記憶能力的行為學(xué)指標(biāo)，并對(duì)刺激組和對(duì)照組大鼠平均時(shí)長(zhǎng)天數(shù)進(jìn)行對(duì)比分析（圖5）。

對(duì)照組大鼠“學(xué)會(huì)”工作記憶任務(wù)的平均時(shí)長(zhǎng)天數(shù)為（7.67±1.966）d，刺激組大鼠“學(xué)會(huì)”工作記憶任務(wù)的平均時(shí)長(zhǎng)天數(shù)為（5.00±0.894）d，刺激組大鼠“學(xué)會(huì)”工作記憶任務(wù)所需時(shí)長(zhǎng)天數(shù)明顯低于對(duì)照組，完成工作記憶任務(wù)所需時(shí)長(zhǎng)減少了（2.67±1.63）d，經(jīng)Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)，兩組時(shí)長(zhǎng)天數(shù)之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（df=5，Z=-2.207b，P=0.027）（圖5）。結(jié)果表明，iTBS刺激增強(qiáng)了大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，使其完成工作記憶任務(wù)所需時(shí)長(zhǎng)減少。

Fig.5 The behavioral results of rats in T maze(n=6,*P＜0.05)

2.3 磁刺激對(duì)前額葉腦區(qū)因果連接的影響

選取大鼠在正確執(zhí)行工作記憶任務(wù)中延時(shí)交替選擇階段的LFP數(shù)據(jù)，以T迷宮行為學(xué)參考點(diǎn)為0點(diǎn)，前后各取了2 000 ms，總共4 000 ms的數(shù)據(jù)長(zhǎng)度進(jìn)行計(jì)算，利用格蘭杰因果網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建方法，構(gòu)建分析了對(duì)照組和刺激組大鼠在工作記憶過(guò)程中mPFC腦區(qū)的腦因果網(wǎng)絡(luò)以及網(wǎng)絡(luò)特性值（圖6）。

Fig.6 The comparison of mPFC causal network between iTBS group and control group

如圖6a1所示，網(wǎng)絡(luò)矩陣的橫坐標(biāo)與縱坐標(biāo)均表示mPFC植入的電極通道，矩陣中的每個(gè)元素對(duì)應(yīng)從橫軸對(duì)應(yīng)通道到縱軸對(duì)應(yīng)通道的格蘭杰因果連接強(qiáng)度，色條表示因果連接強(qiáng)度的大小，顏色越接近紅色表示對(duì)應(yīng)兩個(gè)通道之間的因果連接越大；反之，顏色越接近藍(lán)色表示對(duì)應(yīng)的因果連接越小，對(duì)角線表示通道的自因果，均設(shè)置為0。同時(shí)，在mPFC腦區(qū)的有向網(wǎng)絡(luò)連接中（圖6a2），單向連接用黑色線表示，雙向連接用紫色線表示?？梢钥闯觯诖笫蟮膍PFC腦區(qū)因果網(wǎng)絡(luò)中，iTBS組大鼠mPFC腦區(qū)因果網(wǎng)絡(luò)連接強(qiáng)度明顯強(qiáng)于對(duì)照組，網(wǎng)絡(luò)雙向連接數(shù)量多于對(duì)照組，表明iTBS刺激增強(qiáng)了工作記憶過(guò)程中mPFC腦區(qū)內(nèi)的因果連接性。

進(jìn)一步對(duì)網(wǎng)絡(luò)連接強(qiáng)度、連接密度以及全局效率等網(wǎng)絡(luò)特性進(jìn)行對(duì)比分析（圖6b），可以看出，iTBS組大鼠mPFC腦區(qū)因果網(wǎng)絡(luò)的連接強(qiáng)度、連接密度以及全局效率值都明顯高于對(duì)照組大鼠。經(jīng)Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)，兩組之間均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（連接強(qiáng)度：df=119，Z=-4.460b，P=8.00×10-6；連接密度：df=119，Z=-4.621b，P=4.00×10-6；全局效率：df=119，Z=-3.150b，P=0.002），3種網(wǎng)絡(luò)特性值變化趨勢(shì)基本一致，表明iTBS刺激增強(qiáng)了工作記憶過(guò)程中mPFC腦區(qū)內(nèi)的因果連接強(qiáng)度，使連接數(shù)量增多，連接密度增大，并進(jìn)一步提高了信息傳遞效率。

2.4 磁刺激對(duì)海馬腦區(qū)因果連接的影響

按照同樣的方法，構(gòu)建分析了對(duì)照組和刺激組大鼠在工作記憶過(guò)程中vHPC腦區(qū)的腦因果網(wǎng)絡(luò)以及網(wǎng)絡(luò)特征參量（圖7）。

Fig.7 The comparison of vHPC causal network between iTBS group and control group

如圖7a1所示，矩陣的橫坐標(biāo)與縱坐標(biāo)均表示vHPC植入的電極通道，矩陣中的每個(gè)元素對(duì)應(yīng)從橫軸對(duì)應(yīng)通道到縱軸對(duì)應(yīng)通道的格蘭杰因果連接強(qiáng)度。同時(shí)，在vHPC腦區(qū)的有向網(wǎng)絡(luò)連接中（圖7a2），單向連接用黑色線表示，雙向連接用紅色線表示?？梢钥闯觯诖笫蟮膙HPC腦區(qū)因果網(wǎng)絡(luò)中，iTBS組大鼠vHPC腦區(qū)因果網(wǎng)絡(luò)連接強(qiáng)度明顯強(qiáng)于對(duì)照組，網(wǎng)絡(luò)雙向連接數(shù)量多于對(duì)照組，表明iTBS刺激增強(qiáng)了工作記憶過(guò)程中vHPC腦區(qū)內(nèi)的因果連接性。

同樣進(jìn)一步對(duì)vHPC腦區(qū)網(wǎng)絡(luò)連接強(qiáng)度、連接密度以及全局效率等網(wǎng)絡(luò)特性進(jìn)行對(duì)比分析（圖7b），可以看出，iTBS組大鼠vHPC腦區(qū)因果網(wǎng)絡(luò)的連接強(qiáng)度、連接密度以及全局效率值都明顯高于對(duì)照組大鼠。經(jīng)Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)，兩組之間均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（連接強(qiáng)度：df=119，Z=-3.740b，P=1.84×10-4；連 接 密 度：df=119，Z=-4.139b，P=3.50×10-5；全 局 效 率：df=119，Z=-2.006b，P=0.045），3種網(wǎng)絡(luò)特性值變化趨勢(shì)基本一致，表明iTBS刺激增強(qiáng)了工作記憶過(guò)程中mPFC腦區(qū)內(nèi)的因果連接強(qiáng)度，使連接數(shù)量增多，連接密度增大，并進(jìn)一步提高了vHPC腦區(qū)內(nèi)的信息傳遞效率，此結(jié)果與上述mPFC腦區(qū)因果網(wǎng)絡(luò)結(jié)果變化較為一致。

2.5 磁刺激對(duì)前額葉與海馬跨腦區(qū)因果網(wǎng)絡(luò)連接的影響

按照同樣的方法，進(jìn)一步構(gòu)建分析了對(duì)照組和刺激組大鼠在工作記憶過(guò)程中vHPC與mPFC腦區(qū)的雙向的跨腦區(qū)因果網(wǎng)絡(luò)（圖8）。

如圖8a1和8b1所示，網(wǎng)絡(luò)矩陣的橫坐標(biāo)與縱坐標(biāo)分別表示mPFC和vHPC植入的電極通道，矩陣中的每個(gè)元素對(duì)應(yīng)從橫軸對(duì)應(yīng)通道到縱軸對(duì)應(yīng)通道的格蘭杰因果連接強(qiáng)度。同時(shí)，在mPFC與vHPC的有向網(wǎng)絡(luò)連接中（圖8a2，b2），單向連接分別用藍(lán)色線和紅色線表示?？梢钥闯?，在大鼠vHPC與mPFC的跨腦區(qū)網(wǎng)絡(luò)中，vHPC-mPFC網(wǎng)絡(luò)矩陣的因果連接數(shù)量更多，連接強(qiáng)度更大，同時(shí)與對(duì)照組相比，iTBS組的vHPC-mPFC和mPFCvHPC網(wǎng)絡(luò)矩陣的因果連接數(shù)量和連接強(qiáng)度都有所增大。經(jīng)Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)，刺激組與對(duì)照組之間均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，vHPC-mPFC網(wǎng)絡(luò)（連接強(qiáng)度：df=119，Z=-2.079b，P=0.038；連接密度：df=119，Z=-2.263b，P=0.024）；mPFC-vHPC網(wǎng)絡(luò)（連接強(qiáng)度：df=119，Z=-3.198b，P=0.001；連接密度：df=119，Z=-3.312b，P=0.001）。結(jié)果表明，在工作記憶過(guò)程中，從vHPC到mPFC有更多的信息傳遞，并且iTBS刺激增強(qiáng)了工作記憶過(guò)程中vHPC-mPFC的因果連接性，從vHPC到mPFC的因果連接更加明顯，提高了vHPC-mPFC兩個(gè)腦區(qū)的信息交互。

Fig.8 The comparison of vHPC and mPFC cross-brain network between iTBS group and control group

2.6 磁刺激對(duì)前額葉與海馬跨腦區(qū)因果網(wǎng)絡(luò)連接特性的影響

在vHPC與mPFC的跨腦區(qū)因果網(wǎng)絡(luò)基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分析了對(duì)照組和刺激組大鼠在工作記憶過(guò)程中vHPC與mPFC腦區(qū)的度連接分布和信息流向（圖9）。

圖9a為大鼠vHPC與mPFC的跨腦區(qū)網(wǎng)絡(luò)度分布，色條表示度連接的大小，顏色越接近紅色表示對(duì)應(yīng)通道的度連接越大；反之，顏色越接近藍(lán)色表示對(duì)應(yīng)通道的度連接越小?？梢钥闯?，vHPC腦區(qū)比mPFC腦區(qū)表現(xiàn)出更大的度連接，最大度連接的節(jié)點(diǎn)通道位于vHPC腦區(qū)，說(shuō)明在vHPC與mPFC的跨腦區(qū)網(wǎng)絡(luò)中，vHPC腦區(qū)里有更重要的網(wǎng)絡(luò)連接節(jié)點(diǎn)，vHPC腦區(qū)為主要責(zé)任腦區(qū)，在工作記憶過(guò)程中負(fù)責(zé)更多的信息整合。同時(shí)，iTBS組大鼠mPFC與vHPC腦區(qū)的整體度連接分布呈現(xiàn)增加趨勢(shì)（圖9b），并且平均度連接值顯著增大（df=119，Z=-2.113b，P=0.035），說(shuō)明iTBS增強(qiáng)了vHPC與mPFC的跨腦區(qū)網(wǎng)絡(luò)連接，提高了vHPC與mPFC兩個(gè)腦區(qū)的信息交互。

Fig.9 The comparison of vHPC and mPFC network node degrees between iTBS group and control group

圖10a為大鼠vHPC與mPFC的跨腦區(qū)網(wǎng)絡(luò)因果流向，色條表示因果流向的大小，顏色越接近紅色表示對(duì)應(yīng)通道的因果流向越大，正值呈現(xiàn)因果流出；反之，顏色越接近藍(lán)色表示對(duì)應(yīng)通道的因果流向越小，負(fù)值為因果流入。從圖10a，b可以看出，vHPC主要表現(xiàn)為因果流出，mPFC主要表現(xiàn)為因果流入，iTBS組大鼠的mPFC與vHPC腦區(qū)的整體因果流向明顯增加，并且平均因果流向值顯著增大（df=119，Z=-3.923b，P=8.8×10-5），說(shuō)明大鼠在工作記憶過(guò)程中從vHPC到mPFC有更多的信息傳遞，并且iTBS增強(qiáng)了從vHPC到mPFC的因果流向性，提高了vHPC-mPFC兩個(gè)腦區(qū)的信息傳遞和交流。

Fig.10 The comparison of vHPC and mPFC network causal flow between iTBS group and control group

3 討 論

本文基于格蘭杰因果關(guān)系算法，對(duì)大鼠執(zhí)行WM任務(wù)中的LFPs信號(hào)因果網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，并引入網(wǎng)絡(luò)連接強(qiáng)度、網(wǎng)絡(luò)連接密度、全局效率以及因果流向等網(wǎng)絡(luò)特性參數(shù)，通過(guò)對(duì)比分析對(duì)照組和刺激組在T迷宮內(nèi)執(zhí)行WM任務(wù)過(guò)程中的行為學(xué)表現(xiàn)及LFPs信號(hào)因果網(wǎng)絡(luò)特性的差異，討論分析了iTBS對(duì)大鼠WM相關(guān)行為及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)特性的影響。

行為學(xué)結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)iTBS刺激的正常成年大鼠比無(wú)磁刺激的正常成年大鼠達(dá)到“學(xué)會(huì)”記憶任務(wù)的平均時(shí)長(zhǎng)天數(shù)顯著縮短（P＜0.05），經(jīng)顱磁刺激對(duì)大鼠的認(rèn)知行為產(chǎn)生了相應(yīng)的影響，提高了大鼠工作記憶能力。行為表現(xiàn)是大腦神經(jīng)活動(dòng)的最終表達(dá)，也是反映磁刺激效應(yīng)的宏觀表現(xiàn)。已有研究表明，iTBS能夠提高健康人類對(duì)照組的認(rèn)知能力［30］，在本文結(jié)果中，iTBS使大鼠在更短的時(shí)間內(nèi)完成了工作記憶任務(wù)，提高了大鼠認(rèn)知記憶能力，與以往的對(duì)iTBS刺激積極影響的研究結(jié)果較為一致，并進(jìn)一步表明了iTBS在提高工作記憶等認(rèn)知功能方面的有效性。

前額葉和海馬腦區(qū)是工作記憶的主要責(zé)任腦區(qū)，其中vHPC在記憶的形成和鞏固中發(fā)揮重要作用，mPFC也與記憶的鞏固和提取尤其相關(guān)，工作記憶的功能實(shí)現(xiàn)跟mPFC與vHPC腦區(qū)各自發(fā)揮作用都息息相關(guān)，磁刺激對(duì)mPFC與vHPC腦區(qū)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的影響也會(huì)因此影響到工作記憶過(guò)程中。越來(lái)越多的研究表明，mPFC與vHPC腦區(qū)的神經(jīng)同步活動(dòng)是工作記憶的重要機(jī)制［31-32］。本文利用格蘭杰因果方法，研究了iTBS對(duì)mPFC和vHPC腦區(qū)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)影響，結(jié)果表明，iTBS增強(qiáng)了mPFC和vHPC腦區(qū)內(nèi)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)連接，提高了網(wǎng)絡(luò)連接密度和傳遞效率，提高了mPFC與vHPC腦區(qū)的神經(jīng)同步活動(dòng)，并且mPFC和vHPC腦區(qū)的增強(qiáng)效果具有一致性。同時(shí)mPFC和vHPC在生理結(jié)構(gòu)上存在直接通路的神經(jīng)投射連接，主要起自vHPC腦區(qū)到mPFC腦區(qū)［33］，vHPC-mPFC回路是海馬和前額葉之間存在功能聯(lián)系的解剖學(xué)基礎(chǔ)，磁刺激對(duì)mPFC及vHPC的增強(qiáng)一致性，也證實(shí)了兩個(gè)腦區(qū)結(jié)構(gòu)和功能上的網(wǎng)絡(luò)連接信息交互。

由于記憶的復(fù)雜性，其功能無(wú)法由單獨(dú)腦區(qū)獨(dú)立完成，工作記憶的形成依賴于大腦不同腦區(qū)結(jié)構(gòu)或功能上的網(wǎng)絡(luò)連接，并且前額葉皮層與海馬腦區(qū)之間的網(wǎng)絡(luò)連接是工作記憶功能執(zhí)行的關(guān)鍵［34］，前額葉和海馬通過(guò)分工合作共同完成認(rèn)知活動(dòng)任務(wù)［35-36］。以往的研究表明，與工作記憶相關(guān)的神經(jīng)活動(dòng)主要從海馬轉(zhuǎn)移到前額葉，工作記憶相關(guān)的大腦處理信息隨神經(jīng)活動(dòng)在腦區(qū)之間發(fā)生傳遞［19］。本文的研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了以往的研究，在本文中，從vHPC到mPFC的因果連接網(wǎng)絡(luò)更強(qiáng)，連接數(shù)量更多，并且網(wǎng)絡(luò)因果流向也表現(xiàn)為vHPC流出、mPFC流入。本文iTBS的作用結(jié)果表明，iTBS增強(qiáng)了從vHPC到mPFC的網(wǎng)絡(luò)連接、節(jié)點(diǎn)度和因果流向，使更多的大腦信息從vHPC流向mPFC，增強(qiáng)了vHPC與mPFC之間的協(xié)同交互。而且vHPC與mPFC腦區(qū)相關(guān)神經(jīng)元的信息功能影響了大鼠工作記憶的行為表現(xiàn)，從而導(dǎo)致了大鼠工作記憶能力的提升，本文中iTBS影響神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的變化與行為學(xué)結(jié)果呈現(xiàn)一致性。因此，iTBS可以通過(guò)提高vHPC與mPFC之間神經(jīng)信息的網(wǎng)絡(luò)協(xié)同作用來(lái)提高大鼠的工作記憶行為表現(xiàn)。

此外有研究表明，vHPC與mPFC的theta和gamma振蕩同步是工作記憶中信息傳遞的關(guān)鍵［31］，同時(shí)記憶的形成、鞏固與檢索過(guò)程都依賴于特征神經(jīng)振蕩在PFC和HPC腦區(qū)間的同步作用，本文從時(shí)域網(wǎng)絡(luò)研究中發(fā)現(xiàn)從vHPC到mPFC的腦網(wǎng)絡(luò)連接可能是工作記憶的潛在編碼機(jī)制之一，因此theta和gamma頻段的網(wǎng)絡(luò)同步也是今后研究iTBS調(diào)控大腦認(rèn)知功能關(guān)注的重點(diǎn)，iTBS對(duì)于vHPC與mPFC的網(wǎng)絡(luò)同步效應(yīng)可能影響到了記憶形成或檢索的不同階段，iTBS對(duì)于工作記憶發(fā)展過(guò)程中theta和gamma頻段網(wǎng)絡(luò)同步的影響有待進(jìn)一步的詳細(xì)剖析，以期望更深層的挖掘出iTBS的神經(jīng)調(diào)控機(jī)制。

4 結(jié) 論

本文結(jié)果表明，iTBS模式經(jīng)顱磁刺激對(duì)大腦神經(jīng)活動(dòng)及行為表現(xiàn)均有顯著的積極影響，iTBS磁刺激可以促進(jìn)大鼠在工作記憶任務(wù)的行為表現(xiàn)，并且能夠增強(qiáng)大鼠vHPC-mPFC腦區(qū)的網(wǎng)絡(luò)連接，提高信息交互和傳遞效率，改善大鼠工作記憶能力。iTBS的神經(jīng)調(diào)控機(jī)制可能是通過(guò)增強(qiáng)vHPC與mPFC之間的網(wǎng)絡(luò)連接來(lái)提高工作記憶能力。本文有助于對(duì)iTBS刺激神經(jīng)調(diào)控機(jī)制的理解，在iTBS刺激對(duì)工作記憶障礙表征的神經(jīng)疾病治療和臨床應(yīng)用方面具有重要意義。