非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因大豆中色氨酸含量分析

摘 要：目的：對(duì)大豆中色氨酸分析的堿水解方法進(jìn)行研究，比較非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因大豆中色氨酸的含量。方法：樣品用氫氧化鋰溶液水解提取，樣液經(jīng)中和定容、過(guò)膜后，用超高效液相-熒光檢測(cè)器測(cè)定，外標(biāo)法定量。結(jié)果：應(yīng)用氫氧化鋰對(duì)大豆樣品進(jìn)行堿水解，方法的回收率為90%～93%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5.0%。非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因大豆樣品的色氨酸分析，轉(zhuǎn)基因大豆的色氨酸含量均不低于非轉(zhuǎn)基因大豆，其中的色氨酸可以滿足人體健康需要。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確快速、重現(xiàn)性好，適用于大豆中色氨酸含量分析的檢測(cè)要求。

關(guān)鍵詞：色氨酸；大豆；轉(zhuǎn)基因；非轉(zhuǎn)基因

大豆富含優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，是豆類作物中營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的植物[1]。色氨酸作為人體必需的氨基酸之一，參與機(jī)體多項(xiàng)代謝和合成的網(wǎng)絡(luò)通路，其來(lái)源主要靠食物提供，色氨酸在代謝過(guò)程中與碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪、維生素和微量元素等各種營(yíng)養(yǎng)素之間有十分密切的關(guān)系，充足的色氨酸供給是人類健康所需 [2]。培育優(yōu)良品質(zhì)的大豆品種對(duì)我國(guó)食物營(yíng)養(yǎng)和食品安全工作有著重要意義，轉(zhuǎn)基因大豆自問(wèn)世之日起，其安全評(píng)價(jià)便廣受專家學(xué)者和廣大群眾關(guān)注[3]。世界衛(wèi)生組織（WHO）、聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）、經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（OECD）等多家國(guó)際權(quán)威相關(guān)組織先后對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的必要性和安全評(píng)價(jià)工作進(jìn)行了大量的研究探討，在多家機(jī)構(gòu)和相關(guān)研究組織推動(dòng)、科研團(tuán)隊(duì)的努力下，抗蟲(chóng)、抗病等轉(zhuǎn)基因大豆的研究取得一定進(jìn)展[4-6]。

氨基酸分析在大豆的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)評(píng)價(jià)方面起著重要作用，色氨酸不同于其他氨基酸，它是堿性環(huán)境下穩(wěn)定存在的氨基酸，在經(jīng)典的酸水解的前處理過(guò)程中會(huì)被破壞，故不能在酸水解法中被同時(shí)檢測(cè)分析，準(zhǔn)確、高效地檢測(cè)大豆色氨酸含量是大豆品質(zhì)分析的重要研究方向。色氨酸具有紫外吸收和熒光發(fā)射特性，故不需要衍生可通過(guò)紫外檢測(cè)器或熒光檢測(cè)器直接進(jìn)行檢測(cè)。在參考國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的基礎(chǔ)上[7-9]，超高效液相-熒光檢測(cè)器法具有準(zhǔn)確可靠、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，我們采用該方法對(duì)大豆中色氨酸含量檢測(cè)進(jìn)行研究。本試驗(yàn)對(duì)其色氨酸前處理過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)比較選用配有熒光檢測(cè)器的超高效液相色譜儀進(jìn)行分析，建立了準(zhǔn)確快速的大豆中色氨酸含量檢測(cè)方法，并對(duì)來(lái)自三亞、石家莊、北京3個(gè)不同試驗(yàn)基地的非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因大豆樣品進(jìn)行測(cè)定，比較其所含的色氨酸含量，為評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因大豆中的色氨酸含量提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品：大豆樣品編號(hào)1～6，粉碎備用（用四分法縮減）。其中1、2、3號(hào)（中黃10-A，B，C）為非轉(zhuǎn)基因大豆，4、5、6號(hào)（ZH10-6-A，B，C）為轉(zhuǎn)基因大豆，A、B、C代表北京、石家莊、三亞3個(gè)不同的種植基地。 ZH10-6的大豆是中黃10的大豆品種通過(guò)轉(zhuǎn)入耐除草劑G2-epsps、gat價(jià)基因獲得。G2-epsps基因可以編碼不被草甘膦抑制的EPSP酶，植物本身的EPSP酶對(duì)草甘膦非常敏感，在草甘膦處理下，植物由于不能合成芳香族氨基酸致死，通過(guò)編碼修飾，在草甘膦存在的環(huán)境中，轉(zhuǎn)入基因表達(dá)后能在植物體內(nèi)執(zhí)行植物免受草甘膦的破害的功能。另一個(gè)gat基因表達(dá)后可以在大豆植物體內(nèi)降解草甘膦農(nóng)藥。

色氨酸標(biāo)樣，中國(guó)食品藥品檢定研究院；氫氧化鋰和氫氧化鉀（優(yōu)級(jí)純）、乙酸鈉（色譜級(jí)），阿拉丁試劑公司；甲醇和乙酸（色譜級(jí)），MERK公司；配制試劑所用水為MilliQ純水器處理的超純水。

1.2 儀器和設(shè)備

ACQUITY I-CLASS超高效液相色譜儀，美國(guó)Waters；電熱恒溫干燥箱，上海森信。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液 稱取2.0 mg的色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，滴加0.1 moL/L的氫氧化鉀溶液使其溶解，用水定容，得到濃度為200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確吸取一定體積的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，得到濃度分別為5、10、25、50、75、100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 大豆樣品預(yù)處理 稱取粉碎后的均勻樣品約0.10 g于聚四氟乙烯水解管中，管內(nèi)加入4 mol/L氫氧化鋰溶液1.5 mL，輕輕搖動(dòng)混勻，然后充入高純氮?dú)?，將四氟乙烯水解管放?10℃的恒溫干燥箱中，水解20 h，取出后冷卻至室溫。將水解管內(nèi)的水解液轉(zhuǎn)移到25 mL容量瓶?jī)?nèi)，用乙酸鈉（0.008 5 mol/L，pH=4）多次沖洗水解管并定容至25 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后供儀器測(cè)定。

1.3.3 色譜條件 色譜柱ACQUITY BEH C18，50 mm×2.1 mm，1.7 μm；發(fā)射波長(zhǎng)283 nm，激發(fā)波長(zhǎng)343 nm；色譜柱溫度30 ℃；進(jìn)樣體積2 μL；流動(dòng)相：乙酸鈉（0.008 5 mol/L，pH=4）：甲醇=90 ∶10；流速0.2 mL/min。

2 結(jié)果與分析

色氨酸作為人體所需要的必需氨基酸，高效液相色譜法被大多數(shù)研究者認(rèn)為是一種可靠高效測(cè)定色氨酸的方法。GB/T 15400—2018《飼料中色氨酸的測(cè)定》將高效液相色譜法作為飼料中色氨酸的檢測(cè)分析方法[10]。在此基礎(chǔ)上，本研究采用配有熒光檢測(cè)器的超高效液相色譜儀對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆和非轉(zhuǎn)基因大豆中的色氨酸含量進(jìn)行了測(cè)定，方法優(yōu)化結(jié)果如下。

2.1 儀器條件優(yōu)化

2.1.1 色譜條件選擇 應(yīng)用超高效液相色譜儀，比較了二極管陣列檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器的分析效果。二極管陣列檢測(cè)器的最佳波長(zhǎng)為280 nm。熒光檢測(cè)器的發(fā)射波長(zhǎng)為283 nm，激發(fā)波長(zhǎng)為343 nm。 吸取10 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液2 μL，分別應(yīng)用二極管陣列檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器分析。從圖1、圖2可以看出，基線平穩(wěn)，目標(biāo)峰均窄而尖，分離效果較好，二極管陣列檢測(cè)器分析10 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液的信噪比為1 386，熒光檢測(cè)器分析10 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液的信噪比為16 120。熒光檢測(cè)器的響應(yīng)強(qiáng)度明顯優(yōu)于二極管陣列檢測(cè)器，因此本試驗(yàn)選擇熒光檢測(cè)器對(duì)大豆中的色氨酸進(jìn)行分析。在樣品分析中，色氨酸目標(biāo)峰與樣品中的其他雜質(zhì)峰無(wú)干擾，該方法準(zhǔn)確可靠。

2.1.2 方法的精密度 取同一產(chǎn)地、同一批次大豆樣品6份，按上述前處理?xiàng)l件做精密度試驗(yàn)，測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5.0%，表明本檢測(cè)方法重復(fù)性較好。

2.1.3 方法的檢出限與定量限 在上述分析條件下，5～100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，方程Y=7.27e+006 X+6.21e+006，R=0.999 8。結(jié)合大豆樣本稱樣量和定容的體積，以3倍信噪比計(jì)算本方法檢出限（LOD） 0.001 2 g/100 g，10倍信噪比計(jì)算方法定量限（LOQ）0.003 8 g/100 g。

2.2 水解方法對(duì)氨基酸檢測(cè)結(jié)果的影響

2.2.1 堿水解液的確定 本試驗(yàn)前處理過(guò)程中比較了3種不同的堿水解試劑，分別是含1個(gè)結(jié)晶水的氫氧化鋰溶液（4 mol/L）、不含結(jié)晶水的氫氧化鋰溶液（4 mol/L）、不含結(jié)晶水的氫氧化鈉溶液（5 mol/L），分別將其作為提取液對(duì)樣品進(jìn)行添加回收試驗(yàn)。應(yīng)用含1個(gè)結(jié)晶水的氫氧化鋰溶液的樣本回收率為80%～82%。應(yīng)用不含結(jié)晶水的氫氧化鋰溶液的水解效果較好，樣本添加回收率為90%～93%。應(yīng)用不含結(jié)晶水的氫氧化鈉溶液回收率相對(duì)較低，為61%～64%。本試驗(yàn)還比較了不同純度的氫氧化鋰對(duì)水解效果的影響，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，純度越高水解效果越好（表1）。通過(guò)比較，本試驗(yàn)使用了99.9%純度的不含結(jié)晶水的氫氧化鋰配置4 mol/L的溶解作為堿提取液。

2.2.2 水解時(shí)間的確定 水解18、20、22、24 h對(duì)大豆樣本水解效果的影響如圖3所示，隨著水解時(shí)間的增加，水解效果逐漸提高，水解20 h和22 h的測(cè)定結(jié)果沒(méi)有明顯差異，優(yōu)于24 h，考慮110℃高溫水解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)造成色氨酸的損失，為了節(jié)省時(shí)間及降低水解過(guò)程中的目標(biāo)物降解，最終確定水解時(shí)間為20 h。

2.2.3 水解管材質(zhì)的確定 因強(qiáng)堿溶液不能放置在玻璃容器中，本試驗(yàn)比較了聚四氟乙烯和聚丙烯材質(zhì)的2種水解管的水解效果，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)聚四氟乙烯的密封性、耐腐蝕性優(yōu)于聚丙烯水解管，所以本試驗(yàn)選用聚四氟乙烯材質(zhì)的水解管。

2.3 樣品檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)超高效液相色譜儀對(duì)3個(gè)試驗(yàn)基地的非轉(zhuǎn)基因大豆和轉(zhuǎn)基因大豆樣品中的色氨酸進(jìn)行分析及比較，2組樣本的均值比較采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，統(tǒng)計(jì)分析使用IBM SPSS 26.0軟件（表2）。轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因大豆中色氨酸差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。轉(zhuǎn)基因大豆中色氨酸含量不低于非轉(zhuǎn)基因大豆中的含量，不同產(chǎn)地培植出來(lái)大豆的色氨酸含量不存在顯著性差異。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)大豆色氨酸分析的堿水解方法和液相儀器條件進(jìn)行研究，應(yīng)用高純度氫氧化鋰作為堿水解液進(jìn)行20 h水解，中和定容、過(guò)濾后使用配有熒光檢測(cè)器的超高效液相色譜儀進(jìn)行分析檢測(cè)，分析步驟相對(duì)簡(jiǎn)單，重現(xiàn)性良好，回收率較高。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物試驗(yàn)基地的非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因大豆樣品中的色氨酸進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因大豆中的色氨酸含量穩(wěn)定，且色氨酸含量不存在顯著性差異，其中的色氨酸可以滿足人體健康需要。

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Tryptophan Content Analysis of Non-transgenic and Transgenic Soybeans

LIU Ting-ting，LI Yan，XU Ze-chao，ZHUO Qin

（National Institute for Nutrition and Health，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 100050，China）

Abstract：ObjectiveTo establish a new method for the determination of the content of tryptophan in soybeans with the Ultra Performance Liquid Chromatography （UPLC） in order to compare the contents of tryptophan in non-transgenic and transgenic soybeans. MethodThe sample was extracted via the alkaline hydrolysis method with a lithium hydroxide solution. The sample solution went through the processes of constant volume，neutralization and transmembraning before it was measured with UPLC，then the external standard method was used for quantitative analysis." ResultThis experiment that lithium hydroxide was used for alkaline hydrolysis of soybean samples was proved to be effective. The recovery rate was 90%—93% in this method. In the tryptophan analysis of non-transgenic and transgenic soybean samples，the content of tryptophan in transgenic soybean was not lower than that of non-transgenic soybean，and the rich tryptophan can meet the needs of human health. ConclusionThe method is accurate，rapid and reproducible，which is suitable for the detection requirements of tryptophan content analysis in soybeans.

Keywords： tryptophan; soybean; transgenic; non-transgenic

基金項(xiàng)目：轉(zhuǎn)基因生物新品種培育國(guó)家科技重大專項(xiàng)課題“轉(zhuǎn)基因生物的食用和飼用安全評(píng)價(jià)技術(shù)”（項(xiàng)目編號(hào)：2016ZX08011-005）；“耐除草劑轉(zhuǎn)基因大豆ZH10-6食用安全性評(píng)價(jià)”（項(xiàng)目編號(hào)：2019ZX08013002-006）。

作者簡(jiǎn)介：劉婷婷（1985— ），女，碩士，副研究員，研究方向：營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生。

通信作者：卓 勤（1969— ），女，博士，研究員，研究方向：營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生。