半夏提取物通過(guò)AMPK/FOXO3a 信號(hào)通路對(duì)哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞增殖、凋亡的影響

黃麗萍 郭騰飛 張文青 （東莞職業(yè)技術(shù)學(xué)院衛(wèi)生健康學(xué)院，東莞 523000）

哮喘是一種異質(zhì)性疾病，其特征為氣道嗜酸性炎癥和支氣管組織結(jié)構(gòu)變化，稱為氣道重塑［1］。氣道重塑包括許多過(guò)程，如上皮細(xì)胞破壞增加、氣道平滑肌數(shù)量增多及皮下纖維化加重［2］。因此，氣道平滑肌細(xì)胞（airway smooth muscle cells，ASMCs）凋亡減少可能參與哮喘重塑過(guò)程［3］。半夏提取物（extract of pinellia，EP）是從天南星科植物半夏的干燥塊莖中提取的產(chǎn)物，具有鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘、抗菌、抗炎、抗腫瘤作用［4］。研究報(bào)道，EP 灌胃能夠治療卵白蛋白致敏小鼠變態(tài)反應(yīng)性哮喘，同時(shí)抑制肺組織中TNF-α、IL-4 等炎癥因子分泌［5］。但EP 對(duì)哮喘大鼠ASMCs 增殖、凋亡的影響尚不清楚。因此，本研究主要探討EP 對(duì)哮喘大鼠ASMCs 增殖、凋亡的影響，為哮喘治療提供新方向。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性SD大鼠購(gòu)自廣東至遠(yuǎn)生物醫(yī)藥科技有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2021-0057，均在溫控和光控制環(huán)境中飼養(yǎng)，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均遵循3R原則，經(jīng)東莞職業(yè)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（D210104）。EP 購(gòu)自南京道斯夫生物科技有限公司；AMPK 抑制劑Compound C 購(gòu)自上海意杰生物科技有限公司；MTT 檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒均購(gòu)自碧云天生物有限公司；IL-6、TNF-α ELISA 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海一基生物試劑有限公司；兔源一抗CyclinD1、PCNA、Bax、Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、AMPK、p-AMPK、叉頭框蛋白O3a（FOXO3a）、p-FOXO3a、β-actin 及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗均購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 哮喘模型建立 參照文獻(xiàn)［6］構(gòu)建哮喘模型。大鼠適應(yīng)性培養(yǎng)1周后，第1天和第8天腹腔注射含100 μg 1%卵清蛋白和200 mg氫氧化鋁的溶液1 ml 致敏，第15 天起每天給予大鼠1%卵清蛋白激發(fā)液霧化吸入激發(fā)氣道30 min，1 次/d，持續(xù)4 周，大鼠出現(xiàn)呼吸急促、煩躁不安、腹肌抽搐等癥狀為造模成功。對(duì)照組大鼠用生理鹽水進(jìn)行致敏與霧化。

1.2.2 大鼠ASMCs 培養(yǎng)及鑒定 根據(jù)亓玉心等［7］方法分離大鼠ASMCs，組織貼壁法純化細(xì)胞，將ASMCs 在含20%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。取第5 代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期ASMCs，使用小鼠單克隆抗體α-肌動(dòng)蛋白（α-actin）鑒定ASMCs。藥物處理前24 h，ASMCs 達(dá)到70%匯合時(shí)轉(zhuǎn)移到無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)基中進(jìn)行生長(zhǎng)同步。根據(jù)參考文獻(xiàn)及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將ASMCs 分為對(duì)照組（含正常大鼠血清的培養(yǎng)液）、模型組（含致敏大鼠血清的培養(yǎng)液）、EP 組（含致敏大鼠血清和300 mg/L EP 的培養(yǎng)液）、Compound C 組（含致敏大鼠血清和10 mmol/L Compound C 的培養(yǎng)液）、EP+Compound C 組（含致敏大鼠血清、300 mg/L EP 和10 mmol/L Compound C 的培養(yǎng)液），37 ℃、5%CO2培養(yǎng)48 h后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)［8-9］。

1.2.3 MTT 檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 將2×103個(gè)細(xì)胞接種于96 孔板，孵育48 h，每孔加入20 μl MTT（5 mg/ml），37 ℃孵育4 h，每孔加入150 μl 二甲基亞砜溶解結(jié)晶體。酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處吸光度。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集細(xì)胞并用PBS 洗滌，加入5 μl Annexin V-FITC 和 5 μl PI，室溫避光孵育30 min，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡率（%）=（凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.2.5 ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清中炎癥因子IL-6、TNF-α水平 收集上清，嚴(yán)格按照IL-6、TNF-α ELISA 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作稀釋，加樣，加入酶標(biāo)抗體37 ℃孵育1 h，洗滌，加入顯色劑37 ℃避光孵育15 min，終止反應(yīng)，測(cè)定各孔吸光度，檢測(cè)各組上清中IL-6、TNF-α水平。

1.2.6 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá) RIPA 裂解緩沖液提取總蛋白，BCA 法檢測(cè)蛋白濃度，電泳、轉(zhuǎn)膜、封 閉，加 入 一 抗CyclinD1（1∶2 000）、PCNA（1∶2 000）、Bax（1∶2 000）、Caspase-3（1∶1 000）、Cleaved-Caspase-3（1∶1 000）、p-AMPK（1∶2 000）、AMPK（1∶1 000）、p-FOXO3a（1∶2 000）、FOXO3a（1∶1 000）、β-actin（1∶1 000） 4 ℃孵育過(guò)夜，加入HRP 偶聯(lián)的羊抗兔二抗37 ℃孵育2 h，ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒觀察蛋白顯色情況，Image J 軟件分析目的蛋白灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Graph Pad Prism 6.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)均表示為±s。單因素方差分析用于多組間比較，進(jìn)一步兩組間比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠ASMCs 培養(yǎng)及鑒定 ASMCs 生長(zhǎng)至85%匯合時(shí)，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，且平行生長(zhǎng)，呈現(xiàn)明顯的“蜂窩狀”生長(zhǎng)（圖1A）。免疫熒光染色顯示，98%細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)綠色熒光的肌絲，α-actin 呈陽(yáng)性表達(dá)，證明所培養(yǎng)細(xì)胞為ASMCs（圖1B）。

圖1 大鼠ASMCs的培養(yǎng)（A）及鑒定（B）Fig.1 Culture （A） and identification （B） of ASMCs in rats

2.2 各組細(xì)胞增殖活性比較 與對(duì)照組比較，模型組OD490升高（P<0.05）；與模型組比較，EP組OD490降低，Compound C 組OD490升高（P<0.05）；與EP 組比較，EP+Compound C組OD490升高（P<0.05，表1）。

表1 各組細(xì)胞增殖活性比較（±s，n=6）Tab.1 Comparison of proliferation activities of cells in each group （±s， n=6）

表1 各組細(xì)胞增殖活性比較（±s，n=6）Tab.1 Comparison of proliferation activities of cells in each group （±s， n=6）

Note：Compared with control group， 1）P<0.05； compared with model group， 2）P<0.05； compared with EP group， 3）P<0.05.

OD490 0.35±0.02 0.82±0.071）0.52±0.042）1.14±0.092）0.78±0.053）Groups Control Model EP Compound C EP+Compound C

2.3 各組細(xì)胞凋亡率比較 與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞凋亡率降低（P<0.05）；與模型組比較，EP 組細(xì)胞凋亡率升高，Compound C 組細(xì)胞凋亡率降低（P<0.05）；與EP 組比較，EP+Compound C 組細(xì)胞凋亡率降低（P<0.05，圖2、表2）。

表2 各組細(xì)胞凋亡率比較（±s，n=6）Tab.2 Comparison of apoptosis rates of cells in each group （±s，n=6）

表2 各組細(xì)胞凋亡率比較（±s，n=6）Tab.2 Comparison of apoptosis rates of cells in each group （±s，n=6）

Note：Compared with control group， 1）P<0.05； compared with model group， 2）P<0.05； compared with EP group， 3）P<0.05.

Apoptosis rate/%18.86±2.21 6.27±1.381）14.35±1.672）2.35±0.682）8.62±1.233）Groups Control Model EP Compound C EP+Compound C

2.4 各組細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，模型組CyclinD1、PCNA 蛋白表達(dá)顯著升高，Bax、Caspase-3、Cleaved-Caspase-3 蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05）；與模型組比較，EP 組CyclinD1、PCNA 蛋白表達(dá)顯著降低，Bax、Caspase-3、Cleaved-Caspase-3 蛋白表達(dá)顯著升高，而Compound C 組CyclinD1、PCNA 蛋白表達(dá)顯著升高，Bax、Caspase-3、Cleaved-Caspase-3 蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05）；與EP 組比較，EP+Compound C 組CyclinD1、PCNA 蛋白表達(dá)顯著升高，Bax、Caspase-3、Cleaved-Caspase-3 蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05，圖3、表3）。

表3 各組細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較（±s，n=6）Tab.3 Comparison of expressions of proliferation-related proteins and apoptosis-related proteins in each group （±s，n=6）

Note：Compared with control group， 1）P<0.05； compared with model group， 2）P<0.05； compared with EP group， 3）P<0.05.

Cleaved-Caspase-3/β-actin 1.07±0.11 0.42±0.031）0.79±0.062）0.21±0.012）0.54±0.043）Groups Control Model EP Compound C EP+Compound C CyclinD1/β-actin 0.41±0.02 0.88±0.071）0.57±0.042）1.15±0.122）0.84±0.053）PCNA/β-actin 0.52±0.03 0.93±0.081）0.66±0.042）1.22±0.082）0.89±0.063）Bax/β-actin 0.69±0.04 0.28±0.021）0.54±0.052）0.12±0.012）0.36±0.023）Caspase-3/β-actin 1.36±0.21 0.69±0.071）1.08±0.122）0.37±0.032）0.81±0.063）

圖3 Western blot 檢測(cè)各組細(xì)胞CyclinD1、PCNA、Bax、Caspase-3、Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)Fig.3 CyclinD1， PCNA， Bax， Caspase-3 and Cleaved-Caspase-3 protein expressions in each group detected by Western blot

2.5 各組細(xì)胞上清中炎癥因子IL-6、TNF-α 水平比較 與對(duì)照組比較，模型組IL-6、TNF-α 水平顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，EP 組IL-6、TNF-α 水平顯著降低，Compound C組IL-6、TNF-α水平顯著升高（P<0.05）；與EP 組比較，EP+Compound C 組IL-6、TNF-α水平顯著升高（P<0.05，表4）。

表4 各組細(xì)胞上清炎癥因子IL-6、TNF-α 水平比較（±s，n=6，pg/ml）Tab.4 Comparison of IL-6 and TNF-α levels in cell supernatants of each group （±s，n=6，pg/ml）

表4 各組細(xì)胞上清炎癥因子IL-6、TNF-α 水平比較（±s，n=6，pg/ml）Tab.4 Comparison of IL-6 and TNF-α levels in cell supernatants of each group （±s，n=6，pg/ml）

Note：Compared with control group， 1）P<0.05； compared with model group， 2）P<0.05； compared with EP group， 3）P<0.05.

TNF-α 62.35±4.41 255.14±18.321）93.36±7.182）327.73±29.242）187.42±15.623）Groups Control Model EP Compound C EP+Compound C IL-6 186.67±16.67 329.42±30.371）215.55±21.022）467.73±42.212）269.94±18.793）

2.6 各組細(xì)胞AMPK/FOXO3a 通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，模型組p-AMPK/AMPK、p-FOXO3a/FOXO3a水平顯著降低（P<0.05）；與模型組比較，EP 組p-AMPK/AMPK、p-FOXO3a/FOXO3a水 平 顯 著 升 高，Compound C 組p-AMPK/AMPK、p-FOXO3a/FOXO3a 水平顯著降低（P<0.05）；與EP組比較，EP+Compound C組p-AMPK/AMPK、p-FOXO-3a/FOXO3a水平顯著降低（P<0.05，圖4、表5）。

表5 各組細(xì)胞AMPK/FOXO3a 通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較（±s，n=6）Tab.5 Comparison of AMPK/FOXO3a pathway related protein expressions in each group （±s，n=6）

表5 各組細(xì)胞AMPK/FOXO3a 通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較（±s，n=6）Tab.5 Comparison of AMPK/FOXO3a pathway related protein expressions in each group （±s，n=6）

Note：Compared with control group， 1）P<0.05； compared with model group， 2）P<0.05； compared with EP group， 3）P<0.05.

p-FOXO3a/FOXO3a 0.93±0.08 0.38±0.021）0.74±0.062）0.16±0.012）0.37±0.023）Groups Control Model EP Compound C EP+Compound C p-AMPK/AMPK 1.08±0.11 0.42±0.031）0.84±0.062）0.23±0.012）0.54±0.033）

圖4 Western blot 檢測(cè)各組細(xì)胞AMPK/FOXO3a 通路相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.4 Western blot analysis of AMPK/FOXO3a pathway related protein expressions in each group

3 討論

哮喘是一種呼吸道炎癥性疾病，可能由接觸過(guò)敏原或其他環(huán)境刺激物引起，導(dǎo)致支氣管收縮、喘息和呼吸急促［10］。哮喘的主要病理特征為氣道重塑，而ASMCs 作為氣道重塑的主要成分，可通過(guò)自身膨脹和增殖直接參與氣道壁增厚，還通過(guò)表型轉(zhuǎn)化、遷移功能改變、炎癥因子和細(xì)胞外基質(zhì)分泌促進(jìn)氣道重塑［11-12］。據(jù)報(bào)道TNF-α、IL-6等炎癥因子介導(dǎo)哮喘氣道炎癥過(guò)程［13-14］；ASMCs 異常增殖為哮喘氣道重塑發(fā)生奠定了基礎(chǔ)［15］。本研究利用含致敏大鼠血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)ASMCs，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組TNF-α、IL-6 水平顯著升高，細(xì)胞增殖活性升高，凋亡率降低，再次證實(shí)哮喘模型大鼠構(gòu)建成功。增殖標(biāo)志基因PCNA、CyclinD1 可反映細(xì)胞增殖能力強(qiáng)弱，其表達(dá)與增殖能力呈正相關(guān)［16-17］；Bax、Cleaved-Caspase-3是重要的促細(xì)胞凋亡基因［18］。炎癥進(jìn)展與細(xì)胞凋亡關(guān)系重大，細(xì)胞凋亡率升高意味細(xì)胞數(shù)量減少，卻增加細(xì)胞內(nèi)Cleaved-Caspase-3 表達(dá)，而Cleaved-Caspase-3 表達(dá)升高活化Bcl-2 家族蛋白，從而使促炎細(xì)胞分泌增強(qiáng)，抑制炎癥發(fā)生［19］。因此，本課題組推測(cè)TNF-α、IL-6 水平降低可能與凋亡增強(qiáng)導(dǎo)致的細(xì)胞數(shù)量減少及相關(guān)蛋白失調(diào)有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞PCNA、CyclinD1 蛋白表達(dá)及TNF-α、IL-6 水平升高，而B(niǎo)ax、Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)降低，再次證明模型組細(xì)胞增殖與凋亡異常，也驗(yàn)證了本研究前期推測(cè)。

中醫(yī)藥已廣泛用于各種疾病治療并顯示出良好療效。半夏主要含類黃酮、甾醇、糖苷和不飽和脂肪酸等活性成分，研究報(bào)道，半夏通過(guò)下調(diào)MMP2和IL-4表達(dá)改善卵清蛋白誘發(fā)的哮喘［20］；EP 可通過(guò)上調(diào)AQP5 表達(dá)減輕肺水腫，通過(guò)抑制炎癥因子TNF-α 表達(dá)實(shí)現(xiàn)［21］。EP 對(duì)哮喘大鼠ASMCs 增殖、凋亡的影響尚不清楚。本研究顯示，與模型組比較，EP 組細(xì)胞TNF-α、IL-6 水平、增殖活性降低，凋亡率升高，提示EP 可抑制哮喘大鼠ASMCs 炎癥反應(yīng)及增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

AMPK/FOXO3a 在細(xì)胞增殖、凋亡中發(fā)揮重要調(diào)控作用。如澳洲茄堿通過(guò)激活A(yù)MPK/FOXO3a 軸抑制急性單核細(xì)胞白血病增殖［22］；黃芩清熱除痹膠囊含藥血清通過(guò)激活A(yù)MPK 直接磷酸化FOXO3a 增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性，改善類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者氧化應(yīng)激狀態(tài)［23］；AMPK 通過(guò)磷酸化其下游靶標(biāo)FOXO3a 抑制哮喘炎癥反應(yīng)［24］。本研究顯示，模型組細(xì)胞p-AMPK/AMPK、p-FOXO3a/FOXO3a水平顯著降低，而EP 干預(yù)后細(xì)胞p-AMPK/AMPK、p-FOXO3a/FOXO3a水平顯著升高，提示EP 可能通過(guò)激活A(yù)MPK/FOXO3a 通路抑制哮喘大鼠ASMCs 增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。為驗(yàn)證該推測(cè)，本研究利用AMPK 抑制劑Compound C 進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，Compound C 組 細(xì) 胞p-AMPK/AMPK、p-FOXO3a/FOXO3a 水平顯著降低，細(xì)胞增殖活性及炎癥因子TNF-α、IL-6 水平顯著升高，細(xì)胞凋亡受抑制；與EP組比較，EP+Compound C 組細(xì)胞上述指標(biāo)呈相同趨勢(shì)，證明推測(cè)正確，即EP 可能通過(guò)激活A(yù)MPK/FOXO3a 通路抑制哮喘大鼠ASMCs 增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上，EP 可能通過(guò)激活A(yù)MPK/FOXO3a 通路抑制哮喘大鼠ASMCs 增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。但EP 可能通過(guò)調(diào)控其他通路發(fā)揮對(duì)哮喘大鼠ASMCs 的增殖抑制及凋亡促進(jìn)作用，有待進(jìn)一步探究。