探討黃芪甲苷對(duì)橋本甲狀腺炎大鼠甲狀腺細(xì)胞凋亡及RhoA/ROCK2通路的影響①

劉光霞 陳 芳 高 偉 王曉雅 盧亞敏 侯 瞻 趙連春

（河北省人民醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科 ，石家莊050051）

橋本甲狀腺炎（hashimoto thyroiditis，HT）是一種慢性炎癥性疾病，屬于自身免疫性疾病范疇，患者免疫系統(tǒng)異常激活，引發(fā)大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)甲狀腺組織，導(dǎo)致甲狀腺細(xì)胞凋亡，造成甲狀腺功能減退［1-2］。免疫細(xì)胞的活化，可促使炎癥細(xì)胞因子過(guò)量表達(dá)釋放，引發(fā)強(qiáng)烈的免疫炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致甲狀腺組織損傷，是HT 的主要致病機(jī)制。因此，調(diào)控免疫控制炎癥是防治HT 的關(guān)鍵［3-4］。黃芪甲苷是中藥黃芪的重要活性成分，可抑制核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu) 域 樣 受 體 蛋 白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體活化，降低促炎因子IL-1β及TNF-α表達(dá)，減輕炎癥，改善關(guān)節(jié)軟骨損傷，還可抑制絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)激活，減少脂多糖誘導(dǎo)的炎癥相關(guān)因子產(chǎn)生，發(fā)揮顯著的抗炎作用，因而可推測(cè)黃芪甲苷可能通過(guò)抑制炎癥治療HT［5-6］。Ras 同源基因家族成員A（Ras homolog gene family member A，RhoA）/Rho 相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶2（Rho-associated coiled-coil containing kinase 2，ROCK2）是重要的炎癥調(diào)控信號(hào)，參與介導(dǎo)腦卒中、阿爾茨海默病等炎癥性疾病的發(fā)生及進(jìn)展過(guò)程，抑制RhoA/ROCK 信號(hào)，可顯著減少缺血再灌注誘導(dǎo)的促炎因子合成分泌，阻礙炎癥發(fā)生發(fā)展，降低氧化應(yīng)激水平，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，改善認(rèn)知功能，發(fā)揮明顯的神經(jīng)保護(hù)作用［7-9］，因而RhoA/ROCK 信號(hào)能作為重要的HT 潛在治療靶點(diǎn)。本文通過(guò)構(gòu)建HT 大鼠模型，基于RhoA/ROCK2通路探討黃芪甲苷對(duì)其甲狀腺細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD 雄性大鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0011，SPF 級(jí)，體質(zhì)量180～220 g，嚴(yán)格參照動(dòng)物飼養(yǎng)規(guī)范分籠飼養(yǎng)于以嶺醫(yī)藥研究院動(dòng)物房，溫度：22～25 ℃，濕度：47%～55%，光照：12 h/12 h 明暗循環(huán)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)河北省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審批（202160）。

1.1.2 主要試劑及儀器 黃芪甲苷（純度≥98%，84687-43-4）購(gòu)自南京春秋生物工程有限公司；Rhosin（HY-12646）購(gòu)自美國(guó)Med Chem Express 公司；甲狀腺球蛋白（源于豬，QA052105）、無(wú)水碘化鈉（AQ032244）購(gòu)自安徽酷爾生物工程有限公司；弗氏不完全佐劑（F5506）、弗氏完全佐劑（F5881）購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；抗甲狀腺過(guò)氧化物酶抗體（TPOAb）ELISA 試劑盒（m1048720）、抗甲狀腺球蛋白抗體（TGAb） ELISA 試劑盒（m1003044）購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；原位末端標(biāo)記法（TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（E607172-0001）、蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染 色 試 劑 盒（E607318-0200）、二 喹 啉 甲 酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒（C503021-0500）、大 鼠 IL-17 ELISA 試 劑 盒（D731078-0096）、放射免疫沉淀測(cè)定（radio-immune precipitation assay，RIPA）裂解液（C500005-0050）購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司；大鼠IL-1β 測(cè)試盒（H002）、大鼠IL-6測(cè)試盒（H007）購(gòu)自南京建成生物工程研究所有限公司；兔源anti-RhoA 抗體（ab187027）、羊抗兔二抗（ab150077）、兔源anti-甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）一 抗（ab181602）、兔 源anti-ROCK2 抗體（ab125025）購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司；ECL發(fā)光試劑盒（PE0010）購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司。

M200 PRO 酶標(biāo)儀購(gòu)自TECAN 公司（瑞士）；EM UC7 超薄切片機(jī)、EG1150 分體式包埋機(jī)購(gòu)自Leica公司（德國(guó)）；HPIAS 1000彩色病理圖文分析系統(tǒng)購(gòu)自武漢同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)千屏影像工程公司（中國(guó)）；Axiovert 200 光學(xué)顯微鏡購(gòu)自ZEISS 公司（德國(guó)）；1658033 垂直電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)購(gòu)自Bio-Rad 公司（美國(guó)）；GIS-500 型凝膠成像儀購(gòu)自杭州米歐儀器有限公司（中國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 制備HT 模型大鼠及分組給藥 參照文獻(xiàn)［10］方法并加以改良制備HT 模型：將甲狀腺球蛋白溶于0.9%NaCl 溶液，并將其與等體積完全弗氏佐劑混合，置于玻璃杯中，以小型攪拌機(jī)充分?jǐn)嚢枞榛笾瞥捎桶苿虿环€(wěn)定性用時(shí)制備，所得油包水制劑中甲狀腺球蛋白濃度為2 mg/ml，于大鼠足墊和尾根皮下注射100 μg甲狀腺球蛋白（50 μl油包水制劑）進(jìn)行初次免疫，1 周后加強(qiáng)免疫，即第2 周將甲狀腺球蛋白溶液與等體積不完全弗氏佐劑混合，制成油包水制劑，使甲狀腺球蛋白濃度為2 mg/ml，以 同 樣 方 法 注 射100 μg 甲 狀 腺 球 蛋 白（50 μl 油包水制劑），每周注射1 次，連續(xù)注射6 次，第2 周至第7 周，大鼠以高碘水（0.64 g/L 碘化鈉）喂養(yǎng)，在第8周檢測(cè)大鼠血清TGAb、TPOAb水平，當(dāng)血清TGAb、TPOAb 含量上升，提示模型制備成功，隨機(jī)分為模型組、黃芪甲苷組、Rhosin 組、黃芪甲苷+Rhosin組，每組12只，另選出12只SD大鼠，正常飲水，并以同樣方法皮下注射等劑量生理鹽水，作為對(duì)照組。

將黃芪甲苷與Rhosin 溶于0.9%NaCl 溶液，制得8 mg/ml 黃芪甲苷藥液（混懸液）、4 mg/ml Rhosin藥液（混懸液）［11-12］，黃芪甲苷+Rhosin 組大鼠以10 ml/kg劑量灌胃黃芪甲苷藥液，同時(shí)以10 ml/kg劑量腹腔注射Rhosin藥液；黃芪甲苷組大鼠以10 ml/kg劑量灌胃黃芪甲苷藥液，同時(shí)以10 ml/kg 劑量腹腔注射0.9%NaCl 溶液；Rhosin 組大鼠以10 ml/kg 劑量灌胃0.9%NaCl溶液，同時(shí)以10 ml/kg劑量腹腔注射Rhosin 藥液；對(duì)照組、模型組大鼠以10 ml/kg 劑量灌胃0.9%NaCl 溶液，同時(shí)以10 ml/kg 劑量腹腔注射0.9%NaCl溶液，每天給藥干預(yù)1次，持續(xù)21 d。

1.2.2 收集標(biāo)本 藥物干預(yù)結(jié)束后24 h，將大鼠置于乙醚中麻醉，切開(kāi)頸部，以2 ml 注射器刺入頸總動(dòng)脈，吸出1.6 ml血液，轉(zhuǎn)入離心管，4 ℃離心10 min，將上清置于-80 ℃?zhèn)溆?。處死大鼠，剝離出甲狀腺，剪下約0.4 g 組織置于液氮備用。剩余甲狀腺組織漂洗后，以?xún)x器脫水后，置于二甲苯中透明，再以EG1150 分體式包埋機(jī)及EM UC7 超薄切片機(jī)依次進(jìn)行包埋、切片。

1.2.3 檢測(cè)大鼠甲狀腺組織病理形態(tài)、甲狀腺細(xì)胞凋亡率 將1.2.2中完整的組織切片置于二甲苯中脫蠟，在水化后分別選出3 張切片做HE、TUNEL染色，經(jīng)同樣方法脫水、透明后，置于光學(xué)顯微鏡下觀察著色情況，觀察甲狀腺組織病理形態(tài)，采用HPIAS 1000 彩色病理圖文分析軟件得出甲狀腺細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 檢測(cè)大鼠血清TGAb、TPOAb、IL-6、IL-17、IL-1β 含量 取出1.2.2 制備的血清，置于冰水浴中解凍，采用ELISA 實(shí)驗(yàn)測(cè)定各組大鼠血清TGAb、TPOAb、IL-6、IL-17、IL-1β 含量，具體步驟按照其各自試劑盒說(shuō)明書(shū)指導(dǎo)進(jìn)行：包被微孔板后封閉，依次加入待測(cè)樣品和酶標(biāo)抗體孵育，接著加入底物液顯色后終止反應(yīng)，以酶標(biāo)儀測(cè)出各孔吸光度后計(jì)算各因子含量。

1.2.5 檢測(cè)各組大鼠甲狀腺組織RhoA/ROCK2 通路蛋白表達(dá) 取出1.2.2 液氮中的甲狀腺組織，加入RIPA 裂解液，勻漿后4 ℃離心20 min，采用試劑盒通過(guò)BCA 法測(cè)出上清中總蛋白濃度，調(diào)至各組濃度相等后，100 ℃煮沸變性，取20 μl 各組樣品液以電泳將蛋白分離開(kāi)，濕轉(zhuǎn)將其移至硝酸纖維素膜上，通過(guò)孵育5%脫脂奶粉封閉后，將目的蛋白R(shí)hoA、ROCK2、GAPDH 自膜上裁下，孵育一抗、洗膜、孵育二抗、洗膜、顯色、拍照，通過(guò)Quantity One軟件定量各蛋白條帶灰度值，獲得各組蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清TGAb、TPOAb 水平檢測(cè)結(jié)果與對(duì)照組相比，模型組大鼠血清TGAb、TPOAb 水平明顯升高（P<0.05）；與模型組相比，黃芪甲苷組、Rhosin 組大鼠血清TGAb、TPOAb 水平均降低（P<0.05）；與黃芪甲苷組、Rhosin組分別相比，黃芪甲苷+Rhosin 組大鼠血清TGAb、TPOAb 水平均降低（P<0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清TGAb、TPOAb水平（±s，n=12）Tab.1 Serum TGAb and TPOAb levels of rats in each group （±s， n=12）

表1 各組大鼠血清TGAb、TPOAb水平（±s，n=12）Tab.1 Serum TGAb and TPOAb levels of rats in each group （±s， n=12）

Note：Compared with control group， 1）P<0.05； compared with model group， 2）P<0.05； compared with Astragaloside Ⅳ group， 3）P<0.05； compared with Rhosin group， 4）P<0.05.

TPOAb/（U·ml-1）4.58±0.86 15.29±2.731）9.31±2.192）9.37±2.252）4.63±1.023）4）Groups Control Model Astragaloside ⅣRhosin Astragaloside Ⅳ+Rhosin TGAb/（U·ml-1）5.63±1.02 18.47±3.311）12.03±2.082）12.10±2.052）5.69±1.303）4）

2.2 各組大鼠甲狀腺組織病理形態(tài)檢測(cè)結(jié)果 對(duì)照組大鼠甲狀腺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，完好，無(wú)損傷；模型組大鼠甲狀腺濾泡結(jié)構(gòu)異常，部分萎縮或消失，排列紊亂，周?chē)嬖谘装Y細(xì)胞浸潤(rùn)，甲狀腺組織有明顯病理?yè)p傷；黃芪甲苷組、Rhosin組大鼠甲狀腺組織上述病理?yè)p傷均減輕；黃芪甲苷+Rhosin 組大鼠甲狀腺組織上述病理?yè)p傷減輕程度強(qiáng)于黃芪甲苷組、Rhosin組。見(jiàn)圖1。

圖1 HE染色觀察各組大鼠甲狀腺組織病理形態(tài)（×200）Fig.1 Pathological morphology of thyroid tissue of rats in each group was observed by HE staining （×200）

2.3 各組大鼠甲狀腺細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果 與對(duì)照組相比，模型組大鼠甲狀腺細(xì)胞凋亡率明顯升高（P<0.05）；與模型組相比，黃芪甲苷組、Rhosin 組大鼠甲狀腺細(xì)胞凋亡率均降低（P<0.05）；與黃芪甲苷組、Rhosin 組分別相比，黃芪甲苷+Rhosin 組大鼠甲狀腺細(xì)胞凋亡率均降低（P<0.05）。見(jiàn)圖2、表2。

圖2 TUNEL染色檢測(cè)各組大鼠甲狀腺細(xì)胞凋亡（×200）Fig.2 Apoptosis of thyroid cells in each group was detected by TUNEL staining （×200）

表2 各組大鼠甲狀腺細(xì)胞凋亡率（±s，n=12）Tab.2 Apoptosis rate of thyroid cells in each group （±s，n=12）

表2 各組大鼠甲狀腺細(xì)胞凋亡率（±s，n=12）Tab.2 Apoptosis rate of thyroid cells in each group （±s，n=12）

Note：Compared with control group， 1）P<0.05； compared with Model group， 2）P<0.05； compared with Astragaloside Ⅳ group， 3）P<0.05； compared with Rhosin group， 4）P<0.05.

Apoptosis rate/%1.05±0.27 38.94±5.231）19.52±4.842）19.66±4.652）1.31±0.323）4）Groups Control Model Astragaloside ⅣRhosin Astragaloside Ⅳ+Rhosin

2.4 各組大鼠血清炎癥因子IL-6、IL-17、IL-1β 含量檢測(cè)結(jié)果 與對(duì)照組相比，模型組大鼠血清炎癥因子IL-6、IL-17、IL-1β 含量明顯升高（P<0.05）；與模型組相比，黃芪甲苷組、Rhosin組大鼠血清炎癥因子IL-6、IL-17、IL-1β 含量均降低（P<0.05）；與黃芪甲苷組、Rhosin 組分別相比，黃芪甲苷+Rhosin 組大鼠血清炎癥因子IL-6、IL-17、IL-1β 含量均降低（P<0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血清炎癥因子IL-6、IL-17、IL-1β 含量（±s，n=12）Tab.3 Serum contents of inflammatory factors IL-6，IL-17 and IL-1β of rats in each group （±s， n=12）

表3 各組大鼠血清炎癥因子IL-6、IL-17、IL-1β 含量（±s，n=12）Tab.3 Serum contents of inflammatory factors IL-6，IL-17 and IL-1β of rats in each group （±s， n=12）

Note：Compared with control group， 1）P<0.05； compared with Model group， 2）P<0.05； compared with Astragaloside Ⅳ group， 3）P<0.05； compared with Rhosin group， 4）P<0.05.

Groups Control Model Astragaloside ⅣRhosin Astragaloside Ⅳ+Rhosin IL-6/（pg·ml-1）54.33±5.62 185.04±23.121）120.02±18.402）120.29±20.562）IL-17/（pg·ml-1）9.75±1.06 41.39±4.181）21.31±3.342）21.42±3.422）IL-1β/（ng·ml-1）0.22±0.03 1.04±0.141）0.67±0.112）0.69±0.132）55.02±7.493）4）10.02±1.133）4）0.24±0.063）4）

2.5 各組大鼠甲狀腺組織RhoA/ROCK2 通路蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果 與對(duì)照組相比，模型組大鼠甲狀腺組織RhoA、ROCK2蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.05）；與模型組相比，黃芪甲苷組、Rhosin組大鼠甲狀腺組織RhoA、ROCK2 蛋白表達(dá)均降低（P<0.05）；與黃芪甲苷組、Rhosin 組分別相比，黃芪甲苷+Rhosin 組大鼠甲狀腺組織RhoA、ROCK2 蛋白表達(dá)均降低（P<0.05）。見(jiàn)圖3、表4。

圖3 Western blot 檢測(cè)各組大鼠甲狀腺組織RhoA/ROCK2通路蛋白表達(dá)Fig.3 Expressions of RhoA/ROCK2 pathway protein in thyroid tissues of rats in each group detected by Western blot

表4 各組大鼠甲狀腺組織RhoA/ROCK2 通路相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)（±s，n=12）Tab.4 Relative expressions of RhoA/ROCK2 pathway related proteins in thyroid tissue of rats in each group （±s， n=12）

表4 各組大鼠甲狀腺組織RhoA/ROCK2 通路相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)（±s，n=12）Tab.4 Relative expressions of RhoA/ROCK2 pathway related proteins in thyroid tissue of rats in each group （±s， n=12）

Note：Compared with control group， 1）P<0.05； compared with Model group， 2）P<0.05； compared with Astragaloside Ⅳ group， 3）P<0.05； compared with Rhosin group， 4）P<0.05.

ROCK2/GAPDH 0.18±0.04 1.79±0.321）0.96±0.142）0.98±0.182）0.20±0.063）4）Groups Control Model Astragaloside ⅣRhosin Astragaloside Ⅳ+Rhosin RhoA/GAPDH 0.43±0.07 1.65±0.211）1.02±0.172）1.04±0.162）0.45±0.113）4）

3 討論

HT 以TPOAb、TGAb 表達(dá)升高為主要特征，近年來(lái)，隨著飲食結(jié)構(gòu)的變化，發(fā)病率有一定升高，且起病隱匿，容易誤診，目前尚無(wú)有效的治愈手段，免疫療法、甲狀腺激素、糖皮質(zhì)激素等是臨床主要治療藥物，但長(zhǎng)期應(yīng)用副作用明顯，因而探尋更安全有效的藥物對(duì)HT 的臨床治療意義重大［13-14］。本文以高碘飲水聯(lián)合皮下注射甲狀腺球蛋白的方法誘導(dǎo)HT 大鼠模型，結(jié)果顯示，造模大鼠免疫系統(tǒng)異常激活，血清炎癥因子IL-6、IL-17及IL-1β 含量明顯升高，引發(fā)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，損傷甲狀腺組織，導(dǎo)致甲狀腺細(xì)胞凋亡、甲狀腺濾泡結(jié)構(gòu)異常、部分萎縮或消失、排列紊亂、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)甲狀腺組織、促使TGAb、TPOAb水平升高，揭示HT模型構(gòu)建成功。

免疫炎癥反應(yīng)引發(fā)的甲狀腺組織損傷及甲狀腺細(xì)胞凋亡是HT 的主要病理基礎(chǔ)，抑制炎癥發(fā)生及進(jìn)展是防治HT 的有效策略［15-16］。黃芪甲苷是一種天然的抗炎化合物，可抑制炎癥因子IL-1β 和IL-17 表達(dá)釋放，阻止炎癥產(chǎn)生及進(jìn)展，改善系膜增生性腎小球腎炎小鼠腎功能，還可通過(guò)抑制炎癥提高腸道黏膜屏障功能，進(jìn)而改善潰瘍性結(jié)腸炎大鼠癥狀［17-18］，本文以黃芪甲苷處理HT 大鼠，可降低血清炎癥細(xì)胞因子IL-6、IL-17及IL-1β 合成分泌，抑制炎癥，減少甲狀腺細(xì)胞凋亡，減輕甲狀腺組織炎癥損傷，表明黃芪甲苷可抑制甲狀腺細(xì)胞凋亡，改善HT 大鼠甲狀腺組織病理?yè)p傷，揭示黃芪甲苷對(duì)HT大鼠具有較好的治療功效，在HT 的臨床治療中具有很好的發(fā)展前景。

Rho/ROCK 信號(hào)參與調(diào)控細(xì)胞損傷、凋亡及免疫炎癥等多種病理生理過(guò)程，下調(diào)RhoA、ROCK2 表達(dá)，可降低IL-1β、TNF-α、IL-6 和IL-8 等炎癥細(xì)胞因子表達(dá)，阻礙炎癥發(fā)生發(fā)展，抑制細(xì)胞凋亡，減輕阿爾茨海默病大鼠腦組織損傷，延緩其病情進(jìn)展［19-20］，因而抑制Rho/ROCK 信號(hào)激活可能是黃芪甲苷治療HT 的作用機(jī)制。本文結(jié)果顯示，HT 模型大鼠甲狀腺組織RhoA 與ROCK2蛋白表達(dá)水平升高，RhoA 抑制劑降低HT 大鼠甲狀腺組織RhoA 與ROCK2 蛋白表達(dá)，可減輕其甲狀腺組織損傷，抑制炎癥，降低甲狀腺細(xì)胞凋亡率，表明Rho/ROCK 信號(hào)參與介導(dǎo)HT的致病過(guò)程，本研究結(jié)果顯示黃芪甲苷可降低HT大鼠甲狀腺組織RhoA 與ROCK2 蛋白表達(dá)水平，且與Rhosin 聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，可增強(qiáng)黃芪甲苷對(duì)HT 大鼠的治療作用，表明黃芪甲苷抑制甲狀腺細(xì)胞凋亡，改善HT 大鼠甲狀腺組織炎癥損傷，可能是通過(guò)下調(diào)RhoA/ROCK2通路表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，黃芪甲苷可能通過(guò)抑制RhoA、ROCK2 蛋白表達(dá)，阻礙免疫炎癥產(chǎn)生及進(jìn)展，減輕HT 大鼠甲狀腺組織損傷，降低甲狀腺細(xì)胞凋亡率，改善大鼠臨床癥狀，抑制RhoA/ROCK2 激活可能是其藥理機(jī)制，為黃芪甲苷在HT 臨床治療上的應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)，但本文對(duì)其藥理機(jī)制的探討還存在一定不足，后續(xù)會(huì)通過(guò)恢復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行對(duì)照驗(yàn)證，進(jìn)而深入闡述黃芪甲苷治療HT的作用機(jī)制。