小麥白粉菌環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測技術(shù)體系的建立與應(yīng)用

向禮波 袁斌 薛敏峰 史文琦 曾凡松 楊立軍 龔雙軍

關(guān)鍵詞：小麥白粉菌；環(huán)介導(dǎo)等溫擴增；靈敏度；特異性；快速檢測

白粉病是一種真菌病害，影響近10000種被子植物，其中包括許多具有重要經(jīng)濟意義的栽培植物，如觀賞植物，果樹和谷物。大多數(shù)白粉病是由子囊菌亞門Ascomycota白粉菌屬Erysiphe真菌所引起，包括大約820種。谷物類白粉病是由禾布氏白粉菌Blurn.eria gra-rninis引起的，僅在禾本科的雜草和栽培谷物中發(fā)現(xiàn)。經(jīng)濟上最重要的是小麥和大麥的白粉病，小麥白粉病在世界許多降雨量大的海洋或半大陸性氣候地區(qū)造成重大產(chǎn)量損失。病害防治的主要措施是種植抗性品種和施用殺菌劑。小麥白粉病屬于氣傳性病害，對小麥生產(chǎn)的威脅主要來自于春季流行區(qū)，因此，在早春季節(jié)對菌源進行檢測是開展病害預(yù)警的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也可為化學(xué)防治提供科學(xué)依據(jù)。目前生產(chǎn)上主要通過孢子捕捉器和植保人員田間隨機調(diào)查對白粉病進行監(jiān)測，但該方法費時且起不到早期預(yù)警作用，因此，在生產(chǎn)中急需一種實用、操作簡便且快速準(zhǔn)確的小麥白粉病菌早期檢測方法。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（loop mediated isothermal am-plification，LAMP）技術(shù)是Notomi等2000年開發(fā)的一種恒溫核酸擴增技術(shù)。該方法針對目的基因序列的特異性區(qū)域設(shè)計一對外部引物和一對內(nèi)部引物，在具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶催化作用下，在15～60min內(nèi)能夠產(chǎn)生大量多環(huán)花椰菜結(jié)構(gòu)的DNA片段混合物。該技術(shù)憑借著靈敏度高、不需要特殊和昂貴的儀器、直接在反應(yīng)體系中加入染料根據(jù)顏色的變化檢測等優(yōu)點而備受關(guān)注。目前該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于各類病原微生物、食品微生物和轉(zhuǎn)基因成分的檢測。

國內(nèi)外已開發(fā)出多種檢測白粉菌的分子方法。Mori等以核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internaltranscribed spacer，ITS）為靶標(biāo)序列設(shè)計引物將白粉菌屬分成5個譜系。Zeng等用小麥白粉菌的ITS序列開發(fā)出小麥白粉菌的常規(guī)PCR、巢式PCR檢測體系，并用不同地區(qū)采集的小麥白粉病樣驗證開發(fā)的PCR檢測體系，發(fā)現(xiàn)巢式PCR的靈敏度高于常規(guī)PCR。Zheng等利用小麥白粉菌ITS序列篩選出特異性引物Bgt-F/Bgt-R并建立了實時熒光PCR檢測體系，檢測的靈敏度為0.1pg，比常規(guī)PCR高100倍，并且從接種ld的發(fā)病葉片中成功檢測出小麥白粉菌。以上這些已開發(fā)的分子檢測方法均是基于PCR建立的變溫核酸擴增技術(shù)，儀器昂貴、操作繁復(fù)、耗時較長，不適合在基層植保站應(yīng)用和推廣。而針對小麥白粉菌的LAMP檢測技術(shù)目前尚未見報道。本研究擬以小麥白粉菌基因組中特有效應(yīng)子基因BGT96224V316-LO-CUS1725（GenBank： VCU40465.1）為靶標(biāo)序列，篩選合適的LAMP引物，并建立小麥白粉菌的LAMP檢測技術(shù)，旨在為準(zhǔn)確、簡便的小麥白粉病早期監(jiān)測提供技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1供試材料

本研究中所用的菌株包括10株中國小麥白粉菌，分別來自陜西（5-83，6-69）、湖北（11-61，11-99）、安徽（17-18，17-40）、江蘇（21-2，24-4）、新疆（49-1，50-2）和1株瑞士小麥白粉菌（96224），共計1 1株。小麥白粉菌均采用小麥離體葉段方法進行保存和擴繁。另有7種其他白粉菌（表1），分別采集于當(dāng)?shù)厣L季節(jié)發(fā)病的不同寄主植物，帶回實驗室用原寄主植物進行菌株擴繁。1株可培養(yǎng)病原真菌油菜菌核菌（表1），該菌株的活化培養(yǎng)采用PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200g/L，葡萄糖18g/L，瓊脂18g/L）。

1.2DNA的提取

在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)油菜菌核菌至菌絲長滿培養(yǎng)皿，刮取菌絲至2mL的離心管中，液氮速凍后于全自動組織研磨儀研磨60s，使用基因組DNA提取試劑盒（D3195-01，Omega Bio-Tek公司）提取真菌基因組DNA。小麥白粉菌和其他7種白粉菌的樣品收集方法如下：首先選取嚴(yán)重發(fā)病的葉片，在超凈臺中輕輕敲打葉片將抖落的孢子收集到2mL離心管中，再向管中加入7粒直徑為5mm的玻璃珠（Sigma公司，貨號18406）。DNA的提取參照龔雙軍等的方法進行。

1.3LAMP引物設(shè)計與合成

根據(jù)NCBI中報道的瑞士小麥白粉菌菌株96224基因組序列，依靠基因序列比對分析，選取BGT96224V316_LOCUS1725 （GenBank：

VCU40465.1）為靶標(biāo)序列，利用Primer Explore 5在線軟件（http：∥primerexplorer.

jp/lampv5 e/index.

html）設(shè)計引物（表2）。

1.4LAMP反應(yīng)體系的特異性檢測

為檢測LAMP方法的特異性，分別以9種供試病原菌的gDNA為模板，以1.3篩選到的引物進行LAMP反應(yīng)，以滅菌超純水為空白對照。LAMP反應(yīng)體系Betain、40 U BstDNA聚合酶，模板gDNA 1uL，滅菌超純水補足25uL，混勻后于65℃水浴鍋中反應(yīng)60 min，80℃2 min進行酶滅活處理，然后向反應(yīng)體系中加入1肛L鈣黃綠素。使用紫外照射裝置（350～370nm）從反應(yīng)試管側(cè)面進行觀察。綠色熒光為陽性反應(yīng)，未發(fā)熒光為陰性反應(yīng)。

1.5LAMP反應(yīng)體系的靈敏度檢測

對提取的小麥白粉菌菌株96224基因組DNA，進行10倍梯度稀釋，得到3fg/uL～3ng/uL的DNA，進行LAMP引物的靈敏度試驗，以滅菌超純水為空白對照。觀察反應(yīng)體系顏色的變化，方法同1.4。

1.6發(fā)病小麥葉片中病原菌的LAMP檢測

為測定LAMP方法對發(fā)病葉片中小麥白粉菌的檢測效果，以滅菌超純水為空白對照，以未接種小麥葉片為陰性對照。進行如下試驗設(shè)置：剪取感病品種‘Chanceller’第一葉中間部分3cm長，葉片正面朝上放在含苯并咪唑（50mg/L）的瓊脂保鮮培養(yǎng)基上，在超凈臺上收集預(yù)先繁殖好的新鮮分生孢子到無菌5mL的離心管中，參考史文琦等的方法進行接種，調(diào)整白粉菌菌株96224接種濃度為10～20個/mL，然后將培養(yǎng)皿置于17℃，L∥D=18h∥6h光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在接種后2、4、8、12、24、48、96．120h和144h取樣進行檢測。使用植物基因組DNA提取試劑盒（D3485-01，Omega Bio-Tek公司）提取小麥組織gDNA，將其作為模板進行LAMP反應(yīng)。方法同1.4。

2結(jié)果與分析

2.1LAMP引物的設(shè)計與篩選

以小麥白粉菌菌株96224的DNA為模板，用設(shè)計的3套引物進行引物篩選，結(jié)果如圖1所示，只有引物Bgt-LAMP-1能夠擴增出明顯的梯狀條帶，其他引物均無條帶出現(xiàn)。加入鈣黃綠素?zé)晒馊疽汉?，引物Bgt-LAMP-1反應(yīng)液為綠色，其他引物的反應(yīng)液為橙色，說明只有Bgt-LAMP-1可以用于后續(xù)特異性和靈敏性試驗。

2.2LAMP反應(yīng)體系的特異性

為了驗證LAMP反應(yīng)引物的特異性，對供試的11株小麥白粉菌菌株和8株對照菌株進行LAMP檢測。在紫外燈照射下，陽性反應(yīng)均為綠色熒光，陰性反應(yīng)和空白對照均不發(fā)熒光。11株小麥白粉菌菌株的檢測結(jié)果均為陽性，檢出率為100%，而8株對照菌株無論是專性寄生菌還是腐生菌的檢測結(jié)果均為陰性，沒有出現(xiàn)綠色熒光（圖2）。

2.3LAMP反應(yīng)體系的靈敏度

如圖3所示，以提取的小麥白粉菌96224基因組DNA為模板，10倍梯度稀釋，進行LAMP反應(yīng)。在紫外光照射下，陽性反應(yīng)均為綠色熒光，陰性反應(yīng)和空白對照均不發(fā)熒光。LAMP能檢測到濃度為300fg/uL的DNA。

2.4LAMP反應(yīng)體系對小麥發(fā)病組織的檢測結(jié)果

提取接種小麥白粉菌2、4、8、12、24、48、96、120h和144h的小麥組織gDNA，進行LAMP反應(yīng)后加入鈣黃綠素，在紫外燈照射下，接種4h及以上的小麥發(fā)病組織的LAMP反應(yīng)為呈綠色的陽性反應(yīng)（圖4）；說明該反應(yīng)體系可準(zhǔn)確從發(fā)病小麥葉片中檢測到小麥白粉菌，可檢測到小麥白粉菌的最早時間為侵染4h。

3結(jié)論與討論

本研究以小麥白粉菌專有的效應(yīng)子基因BGT96224V316-LOCUS1725（Bgt-2014）篩選出Bgt-LAMP-1引物對并建立了小麥白粉菌LAMP檢測技術(shù)。所建立的體系特異性好，能與其他8種專性寄生菌有效區(qū)分，靈敏度達到300fg/UL，在接種后4h即可檢測出小麥白粉菌，而正常肉眼觀察到白粉病的癥狀一般在7d左右，所以該方法為田間白粉病菌的早期監(jiān)測提供手段，為病害的防治提供科學(xué)依據(jù)。

預(yù)測預(yù)報技術(shù)是準(zhǔn)確防控小麥白粉病，減少農(nóng)藥使用和精準(zhǔn)施用的關(guān)鍵。因此，開展小麥白粉病預(yù)測預(yù)報研究，對于科學(xué)防治小麥白粉病具有重要意義。分子檢測技術(shù)是預(yù)測預(yù)報的重要手段之一，可為精準(zhǔn)的預(yù)測預(yù)報提供分子技術(shù)方案。目前已成功建立了普通PCR、巢式PCR和熒光定量PCR檢測小麥白粉病的方法，尚沒有文獻報道有關(guān)LAMP技術(shù)在小麥白粉病上的研究。LAMP檢測方法多數(shù)是以真菌通用ITS序列作為靶標(biāo)，筆者前期根據(jù)小麥白粉病菌ITS序列設(shè)計的1對內(nèi)引物和1對外引物建立的小麥白粉病菌LAMP檢測體系，不僅能夠檢測到小麥白粉病菌DNA基因組，同樣也能夠檢測到大麥、黃瓜和草莓等其他植物白粉病菌DNA基因組，特異性較差。而且ITS已被證明不足以區(qū)分白粉菌的種，而一些持家基因，如肌動蛋白（actin）基因，鈣調(diào)蛋白（calmodulin）基因，微小染色體維持蛋白（minichro-mosome maintenance）基因等，在解決這一問題上被證明具有重要的應(yīng)用價值。本研究使用以小麥白粉菌特有的效應(yīng)子基因BGT96224V316-LOCUS1725（Bgt-2014）全長序列設(shè)計篩選出Bgt-LAMP-1引物對，特異性較好，可用于建立小麥白粉病菌LAMP檢測體系。本研究的LAMP技術(shù)從接種小麥白粉菌2h的小麥葉片中未能檢測到陽性結(jié)果，分析原因可能是接種后2h這一階段仍是接種的分生孢子，接種孢子濃度過低所以檢測不到；小麥白粉菌分生孢子萌發(fā)需要4h左右，此時形成初生芽管并緩慢伸長，小麥葉片中小麥白粉菌的生物量增多達到檢測限，所以接種后4h可以檢測到。

本研究建立的小麥白粉菌LAMP檢測方法雖然簡便快速，但仍然很難用于田間地頭的現(xiàn)場檢測，主要是核酸提取過程需要特殊的儀器，例如必須使用離心機，并且步驟較多，所需時間較長。下一步將從DNA提取方面優(yōu)化該檢測方法。目前正在嘗試使用Chelex-IOO提取小麥葉片的DNA，該方法加入堿提取液研磨后直接吸取上清液用于擴增反應(yīng)，不使用離心機且提取時間僅為60min；目前使用的核酸染料鈣黃綠素是一種自發(fā)光熒光染料，在日光下可以自然發(fā)出黃綠熒光，方便觀察結(jié)果。經(jīng)過以上的優(yōu)化后，小麥白粉菌LAMP檢測方法將更加簡便快速，使基層的植保工作者能夠直接在田間地頭開展工作。