兒童腸道真菌研究進(jìn)展

王婷，吳軍華

既有對(duì)人體真菌的研究主要集中在描述健康或疾病狀態(tài)下成人的腸道真菌群落的作用，而對(duì)兒童腸道真菌的研究較少。近年來，18s rDNA 的二代測(cè)序技術(shù)、轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)測(cè)序技術(shù)（ITS）[1]、DNA 指紋技術(shù)[2]等真菌檢測(cè)技術(shù)的發(fā)掘和發(fā)展，進(jìn)一步拓寬了對(duì)生命早期腸道真菌暴露影響的視野。本文基于國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究，對(duì)兒童腸道真菌群落的形成、影響因素、與宿主的相互調(diào)節(jié)方面進(jìn)行綜述。

1 兒童腸道真菌構(gòu)成

1.1 腸道真菌的構(gòu)成 既往研究發(fā)現(xiàn)個(gè)體間腸道真菌菌群的構(gòu)成和豐度差異很大[3-4]，門水平上絕大多數(shù)屬于子囊菌門和擔(dān)子菌門[3-8]，屬水平上包括常見的念珠菌屬、青霉菌屬及曲霉菌屬等[4]。在不同研究中均發(fā)現(xiàn)，念珠菌占有主導(dǎo)地位[3-4,6,9]。也有部分研究得出不同結(jié)論，日本的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)[8]，3 歲前日本兒童腸道排名第一的菌屬為釀酒酵母菌屬（26.8%）。不同研究得出的腸道真菌構(gòu)成有各自特征。

1.2 腸道真菌的變遷 腸道真菌的出現(xiàn)可能可以追溯到胎兒時(shí)期，且隨著胎齡的增大，真菌種類和豐度不斷發(fā)生變化。Willis 等[3]發(fā)現(xiàn)早產(chǎn)和足月的新生兒在出生后數(shù)小時(shí)內(nèi)采集的第一次胎糞樣本中即能發(fā)現(xiàn)真菌DNA 的存在。瑞士的一項(xiàng)縱向研究發(fā)現(xiàn)[9]，念珠菌檢出率于3 日齡后迅速上升，18 個(gè)月時(shí)達(dá)到頂峰，36 個(gè)月時(shí)則較前下降。Gutierrez 等[10]發(fā)現(xiàn)從3 個(gè)月到1 歲，兒童腸道真菌多樣性和豐度都增加。Mishima 等[8]，得出了相反結(jié)論，兒童腸道內(nèi)真菌的豐富度和均勻度隨時(shí)間降低這可能是由于腸道環(huán)境中定植物種的適應(yīng)性選擇。此外，主導(dǎo)真菌屬并非一成不變，Nel 等[7]以2 歲為界比較南非兒童腸道真菌構(gòu)成發(fā)現(xiàn)，念珠菌屬豐度在2 歲以下的兒童中更高，而Cyberlindera 菌屬豐度在2 歲以上的兒童中更高。Gutierrez 等[10]的研究表明，真菌組在3 個(gè)月時(shí)以念珠菌、馬拉色菌和Mycosphaerella 為主，然后在12 個(gè)月時(shí)轉(zhuǎn)向以酵母菌為主。另有研究發(fā)現(xiàn)[3]，在1～5月齡，腸道真菌種群的主要組成從馬拉色菌向白色念珠菌轉(zhuǎn)移。此外，James 等[4]發(fā)現(xiàn)許多真菌是嬰兒特異性的，僅僅一過性的以非常低的豐度出現(xiàn)。以上研究提示，腸道真菌的主導(dǎo)種類和相對(duì)豐度隨時(shí)間不斷變化。

1.3 腸道真菌組成的影響因素

1.3.1 出生胎齡 出生胎齡可能會(huì)影響新生兒腸道真菌的種類和豐度。有研究發(fā)現(xiàn)[3-4]，早產(chǎn)兒腸道真菌定植率更高，種類較為單一，足月兒腸道真菌群落的組成更為均衡。然而早產(chǎn)兒與足月兒腸道菌群的區(qū)別可能冗雜了其他例如抗生素使用、NICU 住院史、有創(chuàng)操作等因素的影響。

1.3.2 抗生素使用 研究發(fā)現(xiàn)，使用抗生素后腸道內(nèi)真菌相對(duì)豐度升高，且其可能會(huì)增加某些真菌的侵襲機(jī)會(huì)。一項(xiàng)對(duì)健康參與者在服用6 d 抗生素后3 個(gè)月內(nèi)腸道真菌的縱向分析發(fā)現(xiàn)，抗生素使用后非優(yōu)勢(shì)真菌的數(shù)量增加更為顯著，這些變化主要發(fā)生在治療后1 個(gè)月內(nèi)，而觀察后期真菌多樣性又減少，提示部分真菌未能最終定植下來[11]，提示腸道微生態(tài)對(duì)抗生素引起的真菌失調(diào)有糾正作用。Wang 等[12]的一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，新生大鼠接受抗生素治療后，與未經(jīng)治療的大鼠相比，其抗白色念珠菌免疫功能明顯受損。肽聚糖（PGN）是真菌細(xì)胞壁的一個(gè)保守組成部分，PGN亞基可激活cAMP合成，從而觸發(fā)白色念珠菌菌絲生長(zhǎng)，增強(qiáng)白色念珠菌的毒力[13]，-內(nèi)酰胺類抗生素可能會(huì)觸發(fā)大量誘導(dǎo)菌絲的PGN 亞基被釋放，驅(qū)動(dòng)白色念珠菌菌絲生長(zhǎng)，導(dǎo)致腸道屏障的穿透和真菌入侵，進(jìn)一步導(dǎo)致白色念珠菌全身侵襲性感染[13]。頭孢哌酮處理后的小鼠盲腸含量中菌絲的百分比明顯高于未處理小鼠[14]，這一實(shí)驗(yàn)也佐證了上述觀點(diǎn)。

1.3.3 其他 Bliss 等[2]利用DNA 指紋技術(shù)研究極低出生體質(zhì)量?jī)喊咨钪榫乃?、垂直傳播發(fā)現(xiàn)，O 型血的母親、母親年齡較大、導(dǎo)尿管的使用、出生后住院時(shí)間長(zhǎng)及甚至母親的種族都會(huì)增加極低體質(zhì)量新生兒的腸道真菌定植。近期的一項(xiàng)研究[7]發(fā)現(xiàn)，女孩腸道內(nèi)真菌多樣性顯著降低，但這可能是飲食、游戲活動(dòng)、社交、藥物使用或免疫反應(yīng)不同的結(jié)果，并無更多實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步重復(fù)驗(yàn)證這些結(jié)論。

2 兒童腸道真菌的來源

2.1 母體垂直傳播 母體腸道真菌與子代腸道真菌之間可能存在垂直傳播。既往有研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)陰道分娩的子代與剖宮產(chǎn)相比，腸道真菌有增加的趨勢(shì)，這種趨勢(shì)持續(xù)到產(chǎn)后大約一年左右[5]。然而，許多其他研究得出了不同的結(jié)論，即生產(chǎn)方式的不同并不能造成子代腸道真菌定植的差異[3,9]，部分地區(qū)剖宮產(chǎn)會(huì)預(yù)防性使用抗生素可能是產(chǎn)生這些不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的原因之一。Schei 等[6]跟蹤了298 對(duì)從孕36周到出生后2 歲的母親和子女糞便樣本中的腸道菌群，11 種真菌在母代和子代中有重疊，2 歲后子代樣本開始表現(xiàn)出與親代相似的傾向，并且被檢測(cè)到有腸道真菌定植的母親，其子代樣本中存在真菌DNA的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)增加，提示這種腸道真菌“易感性”也在母子代中傳遞。

2.2 水平傳播 在生命最早期的2 ～3年里，人類腸道微生物群是高度動(dòng)態(tài)的，受許多因素例如食物、所處環(huán)境的水平傳播[15]。

2.2.1 食物 作為新生兒首先接觸的食物，母乳可能參與了早期兒童腸道菌群的建立和成型。以往的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)母乳中含有細(xì)菌[16]，近年來越來越多的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，真菌也同樣可能存在于母乳中[17-18]。而嬰兒口腔及腸道中的真菌究竟來源于母乳還是母親皮膚，還需要進(jìn)一步了解環(huán)境對(duì)真菌群落影響[17]。限制性馬拉色菌作為兒童、成人皮膚真菌的重要組成部分，也一般被認(rèn)為是來自于母體或醫(yī)護(hù)人員的水平傳播[4]。在攝入富含釀酒酵母菌的食物如面包后，其在嬰兒腸道中的數(shù)量劇增[6]，提示食物是腸道真菌水平傳播的主要來源。

2.2.2 環(huán)境 出生后的環(huán)境也是腸道真菌的重要來源之一。Heisel 等[19]發(fā)現(xiàn)白色念珠菌、副念珠菌和釀酒酵母是構(gòu)成NICU 病房和母乳中菌群的最主要真菌，而它們的相對(duì)豐度是驅(qū)動(dòng)早產(chǎn)兒腸道真菌群落結(jié)構(gòu)形成的主要因素。另一項(xiàng)對(duì)早產(chǎn)兒及其NICU病房采樣的研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)被安置在同一NICU病房的嬰兒所擁有的微生物類群在物種水平上相似[20]，提示新生兒最初接觸的環(huán)境菌群可能會(huì)對(duì)嬰幼兒腸道真菌的種群造成影響。

3 腸道真菌與宿主免疫的相互影響

3.1 腸道屏障對(duì)真菌入侵的抵抗作用 腸道屏障在抵抗真菌侵襲性感染中發(fā)揮了重要作用，主要包括微生物屏障、腸道的免疫反應(yīng)、黏液屏障以及腸道上皮間的緊密連接，本文重點(diǎn)闡述微生物屏障、腸道的免疫反應(yīng)作用機(jī)制。

3.1.1 微生物屏障 腸道中的共生厭氧細(xì)菌，特別是梭狀芽胞桿菌和擬桿菌通過產(chǎn)生低氧誘導(dǎo)因子-1a（HIF-1a）和抗菌肽LL-37 拮抗白色念珠菌的定植[21]。某些細(xì)菌的產(chǎn)物能直接對(duì)真菌造成抵抗和抑制作用。糞腸球菌能產(chǎn)生一種活性肽，即EntV 的前體，能抑制白色念珠菌絲的形成[22]。Bacteroides eggerthii、Odoribacter splanchnicus 等菌種產(chǎn)生的丙酸、鳥氨酸和苯甲酸是白色念珠菌生長(zhǎng)的有效抑制劑[11]。除此之外變形鏈球菌還通過產(chǎn)生短鏈脂肪酸靶向攻擊HWP1（一種表達(dá)菌絲形成的特異性基因）來防止菌絲形成[23]，從而降低白色念珠菌的侵襲力。

3.1.2 腸道的先天性免疫和適應(yīng)性免疫 腸道的先天性免疫以及適應(yīng)性免疫是腸道對(duì)真菌抵抗作用的重要組成部分，真菌觸發(fā)的這些免疫反應(yīng)主要通過信號(hào)傳導(dǎo)通路來實(shí)現(xiàn)。腸道上皮細(xì)胞的先天免疫可被模式識(shí)別受體（PRR）-病原體相關(guān)分子模式（PAMP）相互作用激活[23]。巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞（DC細(xì)胞)、單核細(xì)胞等髓樣細(xì)胞介導(dǎo)了這一先天免疫。PRR主要分為四個(gè)主要家族：Toll樣受體（TLR）、C 型凝集素受體（CLR）、核苷酸寡聚化結(jié)構(gòu)域（NOD）樣受體（NLR）和RigI 解旋酶受體（RLR）[23]。不同的PRR 可識(shí)別細(xì)胞不同結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞壁的葡聚糖[24]、甘露聚糖成分[23]，或直接識(shí)別真菌DNA[25]從而激活不同PAMP，如CARD9-Syk 途徑的活化可激活CARD9 基因表達(dá)多種腸道抗真菌抗體[26]。

除了上述的先天性免疫外，真菌細(xì)胞壁內(nèi)的一些其他成分同樣激活了宿主的適應(yīng)性免疫。真菌細(xì)胞壁成分通過觸發(fā)信號(hào)通路誘導(dǎo)上皮細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞的抗菌肽（AMPs）產(chǎn)生[24]、參與控制抗菌防御和組織修復(fù)相關(guān)的基因表達(dá)、促進(jìn)中性粒細(xì)胞募集[23]。

3.2 腸道真菌對(duì)宿主免疫的影響

3.2.1 免疫訓(xùn)練 免疫訓(xùn)練是指先天免疫系統(tǒng)在初次接觸微生物后對(duì)再次刺激的反應(yīng)性增強(qiáng)[27]。有研究發(fā)現(xiàn)，白色念珠菌在接受抗生素治療的小鼠胃腸道中連續(xù)傳代，迭代出毒力較弱的菌株，這些菌株可以通過訓(xùn)練免疫來保護(hù)宿主免受各種病原體的感染[28]。不同刺激在不同細(xì)胞中引起的相似或不同的代謝變化表明免疫訓(xùn)練存在不止一種機(jī)制[28]。

-葡聚糖是最廣為人知的保護(hù)性先天免疫記憶的誘導(dǎo)劑[29]。Naglik等[25]發(fā)現(xiàn)，-葡聚糖通過Dectin-1和非經(jīng)典絲氨酸-蘇氨酸激酶（Raf-1）途徑免疫訓(xùn)練從而改變單核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組，誘導(dǎo)或抑制TNF-a、IL-6 和IL-18 等重要細(xì)胞因子基因的表達(dá)，引發(fā)更為激烈的真菌免疫。幾丁質(zhì)，作為真菌細(xì)胞壁中的另一成分，也參與免疫訓(xùn)練。其能夠通過不同PRR在產(chǎn)生IL-6 和TNF- 等細(xì)胞因子方面誘導(dǎo)強(qiáng)大的免疫訓(xùn)練[27]。

3.2.2 腸道真菌幫助兒童腸道免疫系統(tǒng)的建立和成型 腸道真菌可促進(jìn)視黃醇脫氫酶樹突狀細(xì)胞（RALDH+DC）將腸系膜及外周淋巴結(jié)的淋巴細(xì)胞招募至腸固有層[30]。在共生真菌的驅(qū)動(dòng)下，CD45+CD103+RALDH+T 細(xì)胞在出生后遷移到外周淋巴結(jié)，這些細(xì)胞帶來的大量的視黃醇可調(diào)節(jié)新生兒內(nèi)皮細(xì)胞上的地址素變化，地址素是一種選擇蛋白的寡糖配體，與指導(dǎo)淋巴歸巢有關(guān)[30]。腸道真菌還能幫助建立腸道的免疫耐受機(jī)制。腸道真菌抗原特異性擴(kuò)增人調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）是抑制健康個(gè)體過度免疫激活的有效機(jī)制[31]。

3.3 腸道真菌對(duì)宿主的保護(hù)作用 與腸道細(xì)菌相似，一些實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，腸道真菌在腸道中的定植對(duì)宿主產(chǎn)生一定的保護(hù)作用。Jiang 等[32]發(fā)現(xiàn)非致死劑量白色念珠菌單定植有效地逆轉(zhuǎn)了無細(xì)菌小鼠對(duì)致命甲型流感病毒感染易感性，這種保護(hù)作用與腸道細(xì)菌產(chǎn)生的保護(hù)作用相當(dāng)，提示共生真菌可以通過保護(hù)黏膜組織免受損傷，并積極校準(zhǔn)循環(huán)免疫細(xì)胞的反應(yīng)性。布拉氏酵母菌可促進(jìn)腸道總IgA 的產(chǎn)生，包括對(duì)艱難梭菌毒素的特異性IgA[33]。Quintin 等[29]發(fā)現(xiàn)-葡聚糖預(yù)處理可以保護(hù)經(jīng)免疫抑制處理的小鼠免受金黃色葡萄球菌的全身感染。但這些保護(hù)作用的具體發(fā)生機(jī)制還需更深入和更大量的研究來推斷、闡述和證實(shí)。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突