外泌體在膽囊癌中的應(yīng)用及研究進(jìn)展

楊軒昂，金镕，張雷明，應(yīng)東建

膽囊癌（GBC）是膽道系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，早期癥狀缺乏特異性且進(jìn)展迅速，5年生存率低于5%，平均生存期不到6 個(gè)月[1]。因此，研究GBC 的發(fā)病機(jī)制是當(dāng)今醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。近年來(lái)，外泌體在腫瘤中的相關(guān)研究不斷增多，其能夠通過(guò)將蛋白質(zhì)、代謝物和核酸等轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，發(fā)揮細(xì)胞間的通訊作用[2]，也可以通過(guò)多種方式影響腫瘤的發(fā)生和侵襲[3-4]。本文就外泌體在GBC 中的作用進(jìn)行探討和總結(jié)，旨在為GBC 的診斷和治療提供新的思路。

1 外泌體

1.1 基本概念 外泌體是30 ～150 nm 的雙層脂質(zhì)囊泡，表面具有特異性蛋白質(zhì)標(biāo)志物，是腫瘤微環(huán)境中重要的組成部分之一[3]。它是一種細(xì)胞外囊泡亞群，能夠?qū)⑻囟ǖ纳锘钚苑肿訌墓w細(xì)胞轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間的信息傳遞并調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲[3,5-6]。外泌體數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.exocarta.org/）中包含了較多外泌體的研究[7]。

1.2 產(chǎn)生機(jī)制 外泌體的產(chǎn)生主要包括：內(nèi)吞體形成、多泡體形成和外泌體釋放[6]。外泌體的產(chǎn)生始于細(xì)胞的內(nèi)吞作用，將周圍環(huán)境中的物質(zhì)內(nèi)吞到細(xì)胞內(nèi)，形成內(nèi)吞體，之后通過(guò)內(nèi)膜系統(tǒng)和特定蛋白質(zhì)的作用（如ESCRT 復(fù)合物和磷脂酰肌醇激酶[8]），不斷變形和分裂，形成多泡體，隨后移動(dòng)到細(xì)胞膜并與其融合，通過(guò)蛋白質(zhì)（如SNARE 和Rab GTP 酶[5]）的介導(dǎo)，將內(nèi)部分子釋放到細(xì)胞外環(huán)境中。

1.3 在腫瘤中的作用 外泌體在腫瘤中發(fā)揮多種作用。腫瘤微環(huán)境是由細(xì)胞外基質(zhì)、血管、基質(zhì)細(xì)胞和分泌因子動(dòng)態(tài)組成的[9]。研究顯示[6,10-11]，外泌體可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞外基質(zhì)、基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞的表達(dá)，影響腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[2]；也能夠通過(guò)攜帶血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等，刺激腫瘤血管生成，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和侵襲[12]。外泌體通過(guò)多種方式促進(jìn)轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的形成，為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件[3,13]。此外，外泌體還具有免疫抑制作用，通過(guò)抑制T細(xì)胞的活性來(lái)抑制腫瘤免疫應(yīng)答，從而幫助腫瘤逃避免疫系統(tǒng)的清除[3,14]。外泌體還能夠通過(guò)多種機(jī)制誘導(dǎo)腫瘤耐藥[3,6]。

2 外泌體在GBC 中的生物學(xué)作用

2.1 在GBC 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲中的作用 研究發(fā)現(xiàn)，外泌體中的一些生物活性物質(zhì)能夠促進(jìn)GBC 細(xì)胞增殖。Zheng 等[15]發(fā)現(xiàn)，RECK 基因可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡并抑制GBC 的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。同時(shí)，GBC 來(lái)源的外泌體miR-182 能夠在轉(zhuǎn)錄水平抑制RECK 的表達(dá)，從而促進(jìn)GBC 細(xì)胞的增殖和侵襲。Zhang 等[16]認(rèn)為，外泌體中含有l(wèi)ncRNA HOXAAS2，通過(guò)miR-6867-5p 對(duì)YAP1 蛋白的表達(dá)產(chǎn)生影響，從而抑制Hippo 信號(hào)通路，最終促進(jìn)GBC 細(xì)胞的增殖和擴(kuò)散。除此之外，外泌體中攜帶的信號(hào)通路調(diào)節(jié)因子通過(guò)調(diào)節(jié)信號(hào)通路促進(jìn)GBC 的侵襲和轉(zhuǎn)移。例如GBC 來(lái)源的外泌體瘦素可通過(guò)激活STAT3 信號(hào)通路，將巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為更能促進(jìn)癌癥進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的M2 表型，改變腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)GBC細(xì)胞的侵襲和遷移[17]。溫志堅(jiān)等[18]對(duì)外泌體hasmiR-552-3p 進(jìn)行了靶基因預(yù)測(cè)、GO/KEGG 功能富集分析，發(fā)現(xiàn)miR-552-3p 可以通過(guò)FoxO 通路和ErbB 通路促進(jìn)GBC 細(xì)胞的惡性增殖。

2.2 在GBC 細(xì)胞凋亡中的作用 凋亡是正常細(xì)胞生命周期的重要組成部分，也是控制腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵過(guò)程。Qin 等[19]使用RNA 測(cè)序?qū)θ薌BC細(xì)胞進(jìn)行了研究，結(jié)合Western Blotting和qRTPCR，發(fā)現(xiàn)IGF2BP3 促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2 表型極化和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而改變了腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)GBC 的發(fā)生，這與Zhao 等[17]的研究結(jié)果一致。隨后，通過(guò)構(gòu)建IGF2BP3 基因敲除的GBC 小鼠模型，發(fā)現(xiàn)GBC細(xì)胞中p-STAT3 的水平下調(diào)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制GBC 的增殖和轉(zhuǎn)移[19]。

2.3 在GBC 細(xì)胞周期調(diào)控中的作用 細(xì)胞周期的紊亂是腫瘤細(xì)胞惡性增殖的特征之一。Su 等[20]發(fā)現(xiàn)lncRNA STEAP3-AS1 和MAD2L1 在GBC 中上調(diào)，而hsa-miR-192-5p 下調(diào)，在此過(guò)程中細(xì)胞周期、M 期和細(xì)胞周期檢查點(diǎn)等細(xì)胞周期相關(guān)通路被激活，這表明lncRNASTEAP3-AS1 可能作為外泌體來(lái)源的hsamiR-192-5p 的分子海綿，通過(guò)影響GBC 中MAD2L1的表達(dá)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程，影響GBC 的增殖。

3 外泌體在GBC 中的生物標(biāo)志物作用

外泌體中的蛋白質(zhì)、miRNA、lncRNA 等可作為GBC 新的生物學(xué)診斷標(biāo)志物，也可作為GBC 分期和預(yù)后的潛在預(yù)測(cè)指標(biāo)[21]。

3.1 外泌體中的蛋白質(zhì)作為GBC 生物標(biāo)志物GBC 和正常細(xì)胞分泌的外泌體蛋白差異顯著，可作為GBC 生物標(biāo)志物。Urban 等[22]使用PCR 分析發(fā)現(xiàn)GBC 患者血清細(xì)胞外囊泡（EV）中的CD44v6 水平顯著高于健康人群，具有作為GBC生物標(biāo)記物的潛力。Priya 等[23]對(duì)GBC 患者血漿衍生的EV 中的蛋白質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，其中HP、PKM、LTF等蛋白質(zhì)與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和TGF- 信號(hào)通路相關(guān)。研究人員使用ELISA 進(jìn)一步驗(yàn)證，HP 水平在GBC 患者膽汁外泌體中顯著增加，或許HP 與其他蛋白質(zhì)相結(jié)合可作為檢測(cè)GBC 的生物標(biāo)志物組合。

3.2 外泌體中的RNA 作為GBC 的生物標(biāo)志物Yang 等[24]通過(guò)高通量RNA-seq 鑒定GBC 和慢性膽囊炎患者的血漿外泌體 miRNA 表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-552-3p、miR-581、miR-4433a-3p 顯著上調(diào)，而miR-496 和miR-203b-3p 顯著下調(diào)，該組合在GBC診斷的ROC 曲線下面積為0.905，高于同一批樣本CA199 和CEA 值。該組合還與多種臨床病理特征顯著相關(guān)，包括腫瘤直徑、分化、轉(zhuǎn)移和TNM 分期，并與GBC患者的總生存期和無(wú)病生存期呈負(fù)相關(guān)，可作為GBC 的診斷及預(yù)后標(biāo)志物。Han 等利[25]用PCR發(fā)現(xiàn)血液中外泌體分泌的miR-221 與膽系惡性腫瘤（BTC）相關(guān)；Gu 等[26]采用RNA-seq 發(fā)現(xiàn)GBC患者血漿提取的外泌體所攜帶的6 種piRNA（piR-2660989、piR-10506469、piR-20548188、piR-10822895、piR-hsa-23209 和piR-18044111）表達(dá)水平較健康人群高；另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)III 期GBC 患者的外泌體中 miR-182-5p、miR-191-5p 和miR-192-5p 的表達(dá)水平最高，這些差異性表達(dá)為GBC 的診斷帶來(lái)潛在應(yīng)用價(jià)值[27]。

3.3 外泌體在GBC 分期和預(yù)后評(píng)估中的應(yīng)用 杜飛等[28]研究表明外泌體PD-L1 濃度與BTC 的T 分期存在顯著正相關(guān)，高表達(dá)PD-L1 的外泌體抑制了淋巴細(xì)胞的增殖，從而增強(qiáng)腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲能力。此外，有研究發(fā)現(xiàn)外泌體中piR-14090389 與GBC的發(fā)生發(fā)展具有顯著的相關(guān)性，提示其可作為預(yù)測(cè)GBC 分期的潛在生物標(biāo)志物[26]。Yoshida 等[29]檢測(cè)BTC 和膽系良性疾病患者膽汁中的miRNA 表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-451a 和miR-3619-3p 顯著升高，說(shuō)明它們的表達(dá)水平具有診斷 BTC 的價(jià)值。其中miR-3619-3p 在BTC 的晚期普遍呈高水平表達(dá)，與BTC 的預(yù)后具有相關(guān)性。

4 總結(jié)與展望

GBC是一種常見(jiàn)的高度惡性腫瘤，預(yù)后極差[1]。外泌體在GBC 的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和治療等方面都具有重要作用。通過(guò)研究外泌體在GBC 中的作用機(jī)制，可以開(kāi)發(fā)更有效的治療方法，包括干擾外泌體的釋放、調(diào)控外泌體組成和功能等[2,30-31]。此外，外泌體還可以作為治療載體，一方面輸送特定免疫相關(guān)內(nèi)容物到腫瘤細(xì)胞，直接殺傷腫瘤[32]；另一方面利用特定的外泌體激活機(jī)體免疫反應(yīng)，增強(qiáng)藥物治療效果，為生物免疫治療提供新方向[33]。然而目前關(guān)于外泌體在GBC中的研究尚處于早期階段，面臨著許多挑戰(zhàn)。例如，外泌體的制備和純化技術(shù)需改進(jìn)，以提高外泌體的純度和產(chǎn)量。此外，將外泌體作為GBC治療的有效手段也是一個(gè)待解決的問(wèn)題。未來(lái)，隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，外泌體研究將深入發(fā)展，為GBC的診斷和治療帶來(lái)新的突破。

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