基于TRM70303發(fā)酵產(chǎn)物硫藤黃菌素的乳油制備

宋迎,何沐昕,張阿郎,劉蕊琪,王麗君,夏占峰

(塔里木大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地,新疆 阿拉爾 843300)

2022年新疆棉花種植面積約2.496 9×106hm2,產(chǎn)量5.391×106t,占全國的90.2%[1]。棉花已成為新疆農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的支柱,而棉花黃萎病自傳入我國以來,發(fā)病率日益增加,每年造成棉區(qū)經(jīng)濟(jì)損失1.5×109～2.0×109元。棉花黃萎病是危害棉花生產(chǎn)的主要病害之一,經(jīng)調(diào)查,新茬地塊發(fā)病率較低,重茬地塊發(fā)病率較高;長勢強(qiáng)的棉田發(fā)病率較低,長勢弱的棉田發(fā)病率較高。根據(jù)歷年棉田生產(chǎn)經(jīng)驗可知,黃萎病對棉花的產(chǎn)量和品質(zhì)影響很大,一般減產(chǎn)10%～30%,發(fā)病率嚴(yán)重的地塊減產(chǎn)可達(dá) 80%以上,甚至絕收[2]。引起棉花黃萎病的大麗輪枝菌是一種土壤傳播的病原體,抵抗惡劣環(huán)境的能力很強(qiáng),可以存活 10 a以上,因此,黃萎病歷來被視為棉花的“毒瘤”。對這類病害的可持續(xù)控制是植物保護(hù)領(lǐng)域的世界性難題,也是我國農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的重大戰(zhàn)略需求。

隨著國家“鄉(xiāng)村振興”戰(zhàn)略的落地生根,國家對農(nóng)業(yè)的投入力度增大,《“十四五”全國種植業(yè)發(fā)展規(guī)劃》中提到,建設(shè)高品質(zhì)棉花種植帶,實施化肥農(nóng)藥綠色增效行動[3],推廣高效低風(fēng)險生物農(nóng)藥[4],集成推廣農(nóng)業(yè)防治、生物防治等綠色防控模式,構(gòu)建綠色種植制度[5]。目前常規(guī)選育出的棉花品種對棉花黃萎病的控制效果尚不理想,且尚無殺菌劑可高效防治棉花黃萎病。因此利用拮抗微生物及其產(chǎn)生的活性產(chǎn)物來抑制或消滅有害生物是生物防治的主要發(fā)展方向,具有對環(huán)境友好、選擇性強(qiáng)、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)勢,發(fā)展前景廣闊。

二硫吡咯酮類(DTPs)化合物是一類結(jié)構(gòu)獨特的天然抗生素,具有雜環(huán)戊二烯(4H-1,2-二硫-4,3-b-吡咯-5-酮)母核。硫藤黃菌素是DTPs 化合物最著名的代表,表現(xiàn)出廣譜的抗生素活性、強(qiáng)大的抗血管生成作用和抗癌細(xì)胞活性[6]。二硫吡咯酮類抗生素對多種微生物,包括革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌以及寄生蟲等都有很好的殺、滅活性,但由于其因溶解性較差,硫藤黃菌素及其衍生物目前還沒有作為農(nóng)用和醫(yī)用抗生素商業(yè)使用。

本研究以塔里木盆地放線菌Streptomycessp.TRM70303分離的活性次生代謝產(chǎn)物硫藤黃菌素為研究原料,篩選溶劑與乳化劑的組合優(yōu)化制備乳油,以期研制出一種對棉花黃萎病具有抑菌活性的生物源農(nóng)藥[7]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試藥劑與試劑

原藥:硫藤黃菌素,從放線菌Streptomycessp.TRM70303發(fā)酵產(chǎn)物中分離提取。

溶劑:二甲基亞砜(DMSO)和無水乙醇(EA)均為分析純,天津鑫宇精細(xì)化工有限公司;甲醇(MT)、甲苯(TL)及二甲苯(XY)均為分析純,天津北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司。

乳化劑:農(nóng)乳500#、農(nóng)乳600#、1601、1602、OP-21、BY130、El-20(邢臺鑫藍(lán)星科技有限公司);吐溫20、吐溫40、吐溫80(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)。

大麗輪枝菌(VerticilliumdahliaeACCC 36211),由新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂16 g,蒸餾水1 000 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 硫藤黃菌素抑制大麗輪枝菌活性測定

將硫藤黃菌素設(shè)定5個質(zhì)量濃度,采用菌絲生長速率法測定硫藤黃菌素對大麗輪枝菌皿內(nèi)抑菌活性[8]。首先將不同質(zhì)量的硫藤黃菌素(0.040 0 g、0.020 0 g、0.010 0 g、0.005 0 g、0.002 5 g)用1 mL的DMSO溶解,配制成濃度分別為40.0 mg/mL、20.0 mg/mL、10.0 mg/mL、5.0 mg/mL、2.5 mg/mL的硫藤黃菌素母液,分別將不同濃度的硫藤黃菌素母液與100 mL冷卻滅菌后至40～50 ℃的PDA培養(yǎng)基混合,充分混勻后制成含不同劑量硫藤黃菌素培養(yǎng)基(DMSO終濃度為0.4%),此時硫藤黃菌素的濃度分別為0.400 mg/mL、0.200 mg/mL、0.100 mg/mL、0.050 mg/mL、0.025 mg/mL,分別以不添加硫藤黃菌素而添加同等濃度的DMSO及空白PDA培養(yǎng)基作為對照,每個質(zhì)量濃度需設(shè)3個重復(fù)。待培養(yǎng)基冷卻至室溫后,接種生長旺盛、活力一致,直徑為6 mm的供試大麗輪枝菌菌餅,于(28±1) ℃下培養(yǎng)。采用十字交叉法測量菌落直徑,計算出硫藤黃菌素在不同質(zhì)量濃度下對大麗輪枝菌的生長抑制率和硫藤黃菌素對大麗輪枝菌的生長抑制率。

(1)

式(1)中,D0:對照組大麗輪枝菌生長直徑,mm;D1:處理組大麗輪枝菌生長直徑,mm;D2;供試大麗輪枝菌菌餅直徑,mm。

1.2.2 硫藤黃菌素乳油溶劑的選擇

取5個50 mL PA瓶,稱取1 g硫藤黃菌素,取5種有機(jī)溶劑各1 mL分別加入到5個PA瓶中,在室溫下輕微振蕩促進(jìn)溶解。如果不能全部溶解,再次滴加溶劑后微熱溶解。如果始終無法全部溶解,繼續(xù)加入溶劑重復(fù)上述步驟,當(dāng)溶劑加至300 mL時,如仍不能夠全部溶解,棄去,選擇另一種溶劑進(jìn)行上述試驗[9]?？紤]溶解性與成本因素,篩選出最適試劑作為乳油溶劑。

1.2.3 硫藤黃菌素乳油分散性測定

將99.5 mL蒸餾水置于100 mL的量筒中,并用移液管滴入0.5 mL乳油,觀察其分散狀態(tài)。如能呈云霧狀自動分散,無可視粒子視為優(yōu);如呈絮狀下沉視為合格[10]。

1.2.4 硫藤黃菌素乳油乳化穩(wěn)定性評價方法

參照GB/T 1603—2001中的方法進(jìn)行測定:在250 mL燒杯中,加入100 mL 2～30 ℃標(biāo)準(zhǔn)硬水,用移液管吸取0.5 mL乳油樣品(稀釋200倍),在不斷攪拌的情況下緩緩加入標(biāo)準(zhǔn)硬水中,加完乳油后,繼續(xù)用2～3 r/s的速度攪拌30 s,立即將乳狀液移至清潔、干燥的100 mL量筒中,并將量筒置于恒溫水浴鍋中,在(30±2) ℃范圍內(nèi),靜置1 h,觀察乳狀液的分離情況,如在量筒中無浮油(膏)、沉淀和沉油析出,視為乳液穩(wěn)定性合格[11]。

1.2.5 硫藤黃菌素乳油貯存穩(wěn)定性測定

熱貯穩(wěn)定性參照 GB/T 19136:(54±2) ℃貯存14 d,同時乳油外觀、乳液穩(wěn)定性、乳化分散性等物理性質(zhì)在貯存前后基本不變或變化不大,滿足各項指標(biāo)要求;乳油的低溫穩(wěn)定性測定參照GB/T 19137:(-20±2) ℃貯存7 d或14 d后進(jìn)行觀察,不分層、無結(jié)晶為合格。

1.2.6 硫藤黃菌素乳油揮發(fā)性測定

取直徑11 cm的定性濾紙一張,用天平稱重后,用滴管在濾紙上均勻滴加1 mL乳油,使其全部濕透,加藥液量以濾紙下端無藥液滴下為宜。加藥后立即稱重,將濾紙懸掛在30 ℃室內(nèi),20 min后再次稱重。計算乳油揮發(fā)率,不超過30%為宜。

(2)

式(2)中,W0:農(nóng)藥乳油揮發(fā)后的濾紙質(zhì)量,g;W1:濾紙質(zhì)量,g;W2:滴上農(nóng)藥乳油后立即稱出的濾紙質(zhì)量,g。

1.2.7 硫藤黃菌素乳油的抑菌活性測定

在96孔板每個孔中加入無菌PDA培養(yǎng)基100 μL。在A、B、C三排的第一孔加100 μL配好的硫藤黃菌素乳油(乳油初始濃度為1 024 μg/mL),然后對藥物進(jìn)行二倍稀釋。即第一孔中加入藥液后用移液器充分吹打混勻,然后吸取100 μL加入第二孔再充分混勻,照此重復(fù)直至此排最后一孔,吸取100 μL棄去。在D、E、F三排的第一孔加100 μL配好的乙蒜素乳油(濃度為1 024 μg/mL),然后對藥物進(jìn)行二倍稀釋[12]。此時每孔藥物濃度從左到右依次為512.00 μg/mL、256.00 μg/mL、128.00 μg/mL、64.00 μg/mL、32.00 μg/mL、16.00 μg/mL、8.00 μg/mL、4.00 μg/mL、2.00 μg/mL、1.00 μg/mL、0.50 μg/mL、0.25 μg/mL。并在每一孔中加入稀釋好的大麗輪枝菌菌液100 μL(約含1×107CFU/mL)[13]。這樣就形成測定一個藥物MIC值的三次重復(fù)(A、B、C三排)。此時每孔藥物濃度從左到右依次為256.000 μg/mL、128.000 μg/mL、64.000 μg/mL、32.000 μg/mL、16.000 μg/mL、8.000 μg/mL、4.000 μg/mL、2.000 μg/mL、1.000 μg/mL、0.500 μg/mL、0.250 μg/mL、0.125 μg/mL。在同一塊96孔板上的G排做陰性對照(僅加空白培養(yǎng)基,不加菌液),在H排做陽性對照(加菌液,不加藥液),將96孔板放入28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d。

2 結(jié)果與分析

2.1 硫藤黃菌素對大麗輪枝菌的拮抗效果

不同濃度的硫藤黃菌素抑制大麗輪枝菌活性測定結(jié)果如表1所示,通過硫藤黃菌素對大麗輪枝菌的抑菌活性試驗得出,在相同質(zhì)量的培養(yǎng)基中,加入硫藤黃菌素濃度越大對大麗輪枝菌的抑菌活性越顯著[14]。且DMSO對大麗輪枝菌的抑菌效果并不顯著。

表1 硫藤黃菌素抑制大麗輪枝菌活性測定結(jié)果

由表1分析可知,未添加硫藤黃菌素的DMSO的抑菌率為1.7%,且與硫藤黃菌素乳油的抑菌結(jié)果并無顯著性差異,說明DMSO對大麗輪枝菌并無明顯活性,其余添加不同濃度的硫藤黃菌素對大麗輪枝菌的抑菌作用都具有顯著性差異,所以硫藤黃菌素乳油對大麗輪枝菌的抑菌作用主要來自于硫藤黃菌素。

2.2 硫藤黃菌素乳油的制備

2.2.1 溶劑的篩選

制備硫藤黃菌素乳油中溶劑的篩選需注意2個指標(biāo),即所篩選得到的溶劑加入硫藤黃菌素是否穩(wěn)定和硫藤黃菌素是否能夠在溶劑中充分溶解[15]。

不同溶劑對硫藤黃菌素的溶解性如表2所示。經(jīng)檢測,DMSO對硫藤黃菌素的溶解性最好,TL、XY、MT、EA對硫藤黃菌素的溶解性較差,不適合作為其溶劑。根據(jù)該試驗結(jié)果,選取溶解性最好的DMSO作為制備乳油的最佳溶劑,用來溶解原藥硫藤黃菌素。

表2 硫藤黃菌素在5種不同溶劑中的溶解性測試結(jié)果

2.2.2 不同種乳化劑對硫藤黃菌素乳油的影響

在室溫下,選取農(nóng)乳500#、農(nóng)乳600#、1601、1602、OP-21、BY130、El-20、吐溫20、吐溫40、吐溫80共10種不同乳化劑與溶解性最好的溶劑進(jìn)行乳油的乳化分散性與穩(wěn)定性測試。通過觀察制備的乳油樣品的外觀以及其滴入標(biāo)準(zhǔn)硬水中的乳化情況來判斷所制備乳油的乳化分散性以及穩(wěn)定性。其中硫藤黃菌素乳油按照原藥1.0 g/mL、乳化劑0.8 g/mL、1.2 g/mL、1.5 g/mL,溶劑DMSO補(bǔ)足至1 mL的配方來進(jìn)行配制。

以硫藤黃菌素作為原藥來配制乳油,在含有硫藤黃菌素的溶劑中分別加入不同質(zhì)量的10種乳化劑制得的乳油基本符合乳油一般性能,乳油外觀均呈現(xiàn)半透明狀態(tài)(圖1)。

利用農(nóng)乳500#制備的乳油分散性較強(qiáng),其余9種乳化劑制備出的乳油分散性較差,即在滴入水中未能呈云霧狀分散(圖2)。10種乳化劑制得的乳油穩(wěn)定性均為合格(圖3)。將其倒入平皿中,28 ℃下靜置1 h能保持乳液穩(wěn)定(圖4)。靜置24 h后仍為透明,未見上層浮油和底部沉淀(圖5)。1號(農(nóng)乳500#)從乳油外觀、乳化分散性及穩(wěn)定性方面都完全符合乳油的要求。在1號乳油中添加1.2 g/mL和1.5 g/mL農(nóng)乳500#能使乳油達(dá)到最優(yōu)效果,如表3所示。

圖2 不同種乳油分散性效果

圖3 不同種乳油攪拌后穩(wěn)定性效果

圖4 不同種乳油靜置1 h后狀態(tài)

圖5 不同種乳油靜置24 h后狀態(tài)

表3 乳油乳化分散性及穩(wěn)定性測試結(jié)果

2.2.3 熱貯穩(wěn)定性及低溫穩(wěn)定性結(jié)果分析

通過對乳化分散性和穩(wěn)定性測試為“優(yōu)”的乳油樣品進(jìn)行熱貯穩(wěn)定性和低溫穩(wěn)定性試驗,熱貯乳油無結(jié)晶(圖6a);在標(biāo)準(zhǔn)硬水中呈云霧狀分散(圖6e);乳油在水中攪拌后呈鵝黃色半透明液體(圖6g);室溫下放置24 h后上無浮油下無沉淀(圖6c),所有指標(biāo)均為合格,冷貯乳油恢復(fù)室溫后無結(jié)晶(圖6b);在標(biāo)準(zhǔn)硬水中呈云霧狀分散(圖6f);乳油在水中攪拌后呈鵝黃色半透明液體狀(圖6h);室溫下放置24 h后上無浮油下無沉淀(圖6d),所有指標(biāo)均為合格,達(dá)到了制作乳油的一般標(biāo)準(zhǔn)。

a:乳油熱貯14 d形態(tài);b:乳油冷貯14 d恢復(fù)室溫后形態(tài);c:熱貯乳油放置24 h后狀態(tài);d:冷貯乳油放置24 h后狀態(tài);e:熱貯后乳油分散性;f:冷貯后乳油分散性;g:熱貯乳油攪拌后狀態(tài);h:冷貯乳油攪拌后狀態(tài)。

2.2.4 硫藤黃菌素乳油揮發(fā)性試驗結(jié)果評價

通過硫藤黃菌素乳油揮發(fā)性試驗,測得硫藤黃菌素乳油揮發(fā)率為1.8%,符合乳油揮發(fā)性標(biāo)準(zhǔn),硫藤黃菌素乳油揮發(fā)性測試結(jié)果如表4所示。

表4 硫藤黃菌素乳油揮發(fā)性測試結(jié)果

2.2.5 硫藤黃菌素乳油對大麗輪枝菌最小抑菌活性

硫藤黃菌素乳油的抑菌活性測定結(jié)果(圖7),可得硫藤黃菌素最小抑菌濃度為2.000 μg/mL,乙蒜素乳油的最小抑菌濃度為8.000 μg/mL,說明硫藤黃菌素乳油與市面上的化學(xué)合成乳油乙蒜素對比,對大麗輪枝菌具有較好的抑菌活性。

圖7 硫藤黃菌素乳油對大麗輪枝菌抑菌活性(MIC)測試

3 討論

為了便于保存和使用活性藥物成分,通常需要加工成合適的劑型,如粉劑、乳油、膏劑等。目前農(nóng)用藥物的發(fā)展方向為高效、安全、多功能,盡量少用有機(jī)溶劑以節(jié)約成本和降低毒性[16]。硫藤黃菌素原藥水溶性不好,DMSO對其具有較好的溶解性,DMSO毒性相對較小,在醫(yī)藥工業(yè)中可以直接用作某些藥物的原料及載體,本研究采用DMSO作為原藥的溶劑具有較好的安全性。

合成殺菌劑一直是植物病原真菌的主要防治手段。然而,它們會對人類、動物和環(huán)境造成危害,并在植物病原真菌中產(chǎn)生抗性。在過去的幾十年中,使用微生物作為植物病原真菌的生物防治劑已成為合成殺菌劑的替代方法。從陸地、海洋、濕地等環(huán)境中分離的放線菌已被用于植物病原真菌的生物防治。目前需要尋找不同分離來源新的放線菌次級代謝產(chǎn)物。然而,關(guān)于那些作為農(nóng)業(yè)生物防治劑與其他環(huán)境隔離的物質(zhì)的信息較少。因此,本研究通過分離出的具有抗真菌活性的放線菌,得出其次級代謝產(chǎn)物,將其制備成生物制劑。以期對植物病害具有防治作用。盡管放線菌具有作為植物病原真菌生物防治劑的潛力,但對來自海洋、鹽堿地和濕地環(huán)境的放線菌的研究很少,這些放線菌作為生物防治劑的潛力與來自陸地環(huán)境的分離株具有同等或更大的潛力。

在后續(xù)的研究中,可以采用結(jié)構(gòu)修飾方法提高硫藤黃菌素的水溶性,例如糖基化修飾方法可提高天然化合物的溶解性[17],也可以采用向非核心結(jié)構(gòu)區(qū)域引入羧基或氨基等極性基團(tuán)的方法提高溶解性[18]。

4 結(jié)論

硫藤黃菌素對大麗輪枝菌表現(xiàn)出顯著的抑菌活性。通過比較不同乳化劑、溶劑、熱貯穩(wěn)定性及低溫穩(wěn)定性對硫藤黃菌素制備乳油制劑的影響,最終篩選出硫藤黃菌素原藥最適溶劑為DMSO,最適乳化劑為農(nóng)乳500#(1.2 g/mL),確定了基于原藥硫藤黃菌素制備乳油的最佳配方。硫藤黃菌素乳油最佳配方為硫藤黃菌素10%(1.0 g/mL),農(nóng)乳500#12%(1.2 g/mL),DMSO補(bǔ)足至100%。