天然染料質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)的建立與應(yīng)用

壽晨超, 娜仁高娃, 高素蕓, 劉 劍,3, 趙 豐,3

(1. 浙江理工大學(xué) 紡織科學(xué)與工程學(xué)院(國(guó)際絲綢學(xué)院), 浙江 杭州 310018; 2. 巴音郭楞蒙古自治州博物館,新疆 庫(kù)爾勒市 841001; 3. 中國(guó)絲綢博物館 紡織品文物保護(hù)國(guó)家文物局重點(diǎn)科研基地, 浙江 杭州 310012)

天然染料是從植物、動(dòng)物等天然原料中提取的可用于紡織品著色的色素,其使用在我國(guó)具有十分悠久的歷史,《詩(shī)經(jīng)》《齊民要術(shù)》《天工開(kāi)物》等古代文獻(xiàn)中均有記載從植物中萃取染料,并對(duì)紡織品進(jìn)行染色加工[1]。常見(jiàn)的天然染料種類(lèi)主要有吲哚類(lèi)、蒽醌類(lèi)、萘醌類(lèi)、黃酮類(lèi)、生物堿類(lèi)和姜黃素類(lèi)等。

通過(guò)鑒定紡織品文物中的天然染料,可了解其化學(xué)屬性、植物來(lái)源、產(chǎn)地甚至紡織品文物年代等信息,為保護(hù)紡織品文物顏色、避免染料降解提供科學(xué)依據(jù);此外,隨著現(xiàn)代人們對(duì)綠色發(fā)展的理念越來(lái)越重視,篩選出優(yōu)質(zhì)天然染料應(yīng)用于現(xiàn)代印染業(yè),符合可持續(xù)發(fā)展需求。目前,用于古代紡織品染料鑒定的技術(shù)包括高效液相色譜技術(shù)(HPLC)[2]、光纖反射光譜技術(shù)(FORS)[3]、三維熒光光譜技術(shù) (3D-EEM)[4]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-MS)[5]、表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)(SERS)[6]等。其中高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-MS)是最常用的檢測(cè)技術(shù),其具有強(qiáng)大的化合物分離和分子結(jié)構(gòu)分析能力,是鑒別紡織品上天然染料的重要方法之一。然而,面對(duì)大量的紡織品文物,在使用光譜或者色譜等分析技術(shù)時(shí),僅依靠人工已無(wú)法快速鑒別染料化合物[7]。近年來(lái),質(zhì)譜庫(kù)檢索技術(shù)逐漸成為研究者們關(guān)注的熱點(diǎn),可做為一種快速有效的鑒定方法。質(zhì)譜檢索軟件在對(duì)未知化合物進(jìn)行分析時(shí),可將其質(zhì)譜與數(shù)據(jù)庫(kù)中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)譜相比對(duì),用質(zhì)譜的匹配度來(lái)衡量相似性,作為定性參考。國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者根據(jù)其實(shí)驗(yàn)室自身?xiàng)l件和檢測(cè)分析目的,在農(nóng)藥[8]、中醫(yī)藥[9]、海洋寡糖[10]、人體代謝產(chǎn)物[11-12]等領(lǐng)域已建立了不同規(guī)模的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù),實(shí)現(xiàn)了實(shí)際樣品中未知質(zhì)譜的快速鑒別。在天然染料研究領(lǐng)域,Guo等[13]利用UPLC-MS/MS技術(shù)初步建立了用于篩選和鑒定紅色天然染料化合物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù),對(duì)紅色紡織品文物進(jìn)行了染料鑒定,然而其建立的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)在天然染料品種和數(shù)量上有待進(jìn)一步補(bǔ)充。

目前,可供天然產(chǎn)物質(zhì)譜檢索匹配的數(shù)據(jù)庫(kù)有美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究院質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù) (NIST)、代謝物質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù) (Metlin)、有機(jī)化合物質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù) (SDBS)、 全球天然產(chǎn)物社區(qū)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù) (GNPS)等[14]。其中NIST數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索軟件具有檢索結(jié)果準(zhǔn)確率高和檢索速度快的優(yōu)點(diǎn)[15]。本文通過(guò)對(duì)68種染料標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行HPLC-MS分析,利用該譜庫(kù)軟件建立天然染料的多級(jí)參考質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù),成功匹配了2件古代紡織品文物上的染料成分,并鑒別了染料的植物來(lái)源。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

HPLC級(jí)乙腈和甲醇(德國(guó)Merck公司);LC-MS級(jí)甲酸(美國(guó)Thermo Fisher公司);HPLC級(jí)吡啶(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司);98%草酸(美國(guó)Acros有機(jī)試劑公司)。18.2 MΩ超純水(由法國(guó)Millipore公司Millipore reference 純水儀系統(tǒng)制備)。68種染料標(biāo)準(zhǔn)品,主要購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司、上海源葉生物科技有限公司、美國(guó)Sigma-Aldrich公司等,純度均在90%以上,其成分如表1所示。

表1 主要天然染料化合物標(biāo)準(zhǔn)品列表

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及條件

采用 HPLC-MS技術(shù)分析古代絲織品上的染料。其中LC20AD液相色譜系統(tǒng)(日本Shimadzu公司)由二元高壓梯度泵、二極管陣列檢測(cè)器和自動(dòng)進(jìn)樣器組成。質(zhì)譜檢測(cè)器為L(zhǎng)TQ-XL線(xiàn)性離子阱質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo Fisher公司),采用Shim-pack XR-ODS C18反相色譜柱(日本Shimadzu公司)進(jìn)行染料色素分離。

通過(guò)前期研究及相關(guān)文獻(xiàn)確定對(duì)天然染料的檢測(cè)分析條件[5,15],高效液相色譜洗脫液A和 B分別為0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈溶液,流速為0.30 mL/min。質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集和處理由Xcalibur 2.1軟件完成,質(zhì)荷比m/z范圍為100～1 000。質(zhì)譜參數(shù)如下:離子噴霧電壓分別為3 kV(正離子模式)和2.5 kV(負(fù)離子模式);毛細(xì)管溫度為350 ℃;氮?dú)庥米髑蕷夂洼o氣,壓力分別為241.32、 103.42 kPa;毛細(xì)管電壓分別為35 V(正離子模式)和-40 V(負(fù)離子模式)。

數(shù)據(jù)采集和處理軟件:1) Xcalibur 2.1軟件(由美國(guó)Thermo Fisher Scientific開(kāi)發(fā)的質(zhì)譜分析軟件),用于管理、處理和分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)。2)NIST MS Search 2.3軟件(由美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究院開(kāi)發(fā)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)搜索軟件),用于快速準(zhǔn)確地識(shí)別和鑒定未知化合物[14]。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制

將染料標(biāo)準(zhǔn)品超聲波溶解于甲醇/水混合溶劑中,配制成質(zhì)量濃度為20～400 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。分析時(shí),取適量5～10種同類(lèi)別標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液混合,用氮?dú)飧稍锖?以甲醇與水質(zhì)量比為1∶1溶解至10 mg/L,移取溶液30 μL至微量進(jìn)樣瓶,進(jìn)樣15 μL。

1.3.2 文物樣品制備

本文分析的2件古代絲織品分別來(lái)自于巴州博物館收藏的漢晉時(shí)期紅藍(lán)黃三色香囊(BZ:39)和中國(guó)絲綢博物館收藏的17世紀(jì)法國(guó)彩條花卉紋提花緞(2016-18-3)。取樣品紗線(xiàn)0.2～0.6 mg,采用吡啶、水與草酸質(zhì)量比為95∶95∶10萃取紗線(xiàn)上的染料,于85 ℃恒溫萃取30 min,用氮?dú)飧稍锖笾貜?fù)1.3.1節(jié)相應(yīng)實(shí)驗(yàn)步驟。

1.4 古代紡織品中未知染料質(zhì)譜識(shí)別方法

1.4.1 NIST檢索算法

古代紡織品中未知染料質(zhì)譜的鑒定是使用NIST MS Search 2.3軟件進(jìn)行譜庫(kù)檢索實(shí)現(xiàn)的。該軟件的檢索算法是基于點(diǎn)積函數(shù),將質(zhì)譜表示為1個(gè)有序的峰強(qiáng)度行向量,通過(guò)m/z值縮放峰強(qiáng)度值(每個(gè)峰值的豐度的平方根乘以m/z值的平方)。點(diǎn)積質(zhì)譜搜索算法使用余弦相似度法,計(jì)算未知質(zhì)譜向量和庫(kù)參考質(zhì)譜向量之間的角度余弦值來(lái)確定相似度[16]。

NIST檢索結(jié)果中有正向檢索匹配度(Match)、 反向檢索匹配度(R.Match)和匹配概率(Prob)3個(gè)值。正向檢索匹配度為將參考庫(kù)的峰與未知譜對(duì)照,計(jì)算是否存在與未知譜相同的峰。反向檢索匹配度為將未知譜的峰與參考庫(kù)對(duì)照,計(jì)算參考譜中的各質(zhì)量峰是否出現(xiàn)在未知譜中。在NIST檢索結(jié)果中最大匹配度為999,無(wú)質(zhì)譜峰匹配時(shí)為0。900及以上為優(yōu)秀匹配;800～900為良好匹配;700～800為中等匹配;低于600為較差匹配。其中Prob的值是假設(shè)此化合物存在數(shù)據(jù)庫(kù)中,根據(jù)命中列表中鄰近命中的差別得出[16]。

1.4.2 檢索參數(shù)設(shè)置

根據(jù)其它文獻(xiàn)的實(shí)驗(yàn)方法,通過(guò)調(diào)節(jié)質(zhì)譜搜索類(lèi)型、準(zhǔn)分子離子和子離子質(zhì)量容差等搜索參數(shù),確定最佳的譜庫(kù)檢索參數(shù)[11]。本文采用Simple和 MS/MS 混合搜索方法,準(zhǔn)分子離子和子離子質(zhì)量搜索參數(shù)分別設(shè)置1.6、0.8m/z的容差,忽略準(zhǔn)分子離子附近峰設(shè)置為1.6m/z,選擇主譜庫(kù)(Mainlib)和自建譜庫(kù)(NaturalDye)作為檢索譜庫(kù)。

2 結(jié)果與分析

在HPLC-MS分析紡織品中染料組分時(shí),采用多級(jí)質(zhì)譜,可以獲得化合物豐富的碎片離子信息,從而能夠推測(cè)染料的分子結(jié)構(gòu)。天然染料質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)的建立,為紡織品文物的染料鑒別提供了一種快速準(zhǔn)確的方法。

2.1 天然染料質(zhì)譜庫(kù)的建立

利用線(xiàn)性離子阱質(zhì)譜儀采集天然染料的標(biāo)準(zhǔn)品多級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù),基于Xcalibur 2.1軟件和NIST MS Search 2.3軟件建立包含68種天然染料化合物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù),相關(guān)信息見(jiàn)表2。

表2 天然染料質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)的相關(guān)數(shù)據(jù)

圖1示出標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集過(guò)程。首先在Xcalibur 2.1軟件中選中1個(gè)色譜峰,導(dǎo)出染料化合物的二級(jí)質(zhì)譜至NIST MS Search 2.3軟件,當(dāng)化合物的二級(jí)質(zhì)譜碎片信息較少時(shí)需要導(dǎo)出其三級(jí)質(zhì)譜。隨后將化合物的其它信息,如名稱(chēng)、分子式、分子質(zhì)量、別名、檢測(cè)離子模式、保留時(shí)間、化學(xué)結(jié)構(gòu)式輸入到自建譜庫(kù)中,質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)存儲(chǔ)結(jié)構(gòu)如圖2所示。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集過(guò)程

圖2 質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)存儲(chǔ)結(jié)構(gòu)

以茜素為例,在圖1導(dǎo)出第3個(gè)色譜峰的二級(jí)質(zhì)譜信息,其相關(guān)的參數(shù)為:CAS登記號(hào)72-48-0,英文名Alizarin,分子式C14H8O4,相對(duì)分子質(zhì)量240,檢測(cè)離子模式為負(fù)離子模式,保留時(shí)間為13.30 min,一級(jí)質(zhì)譜的準(zhǔn)分子離子為239,二級(jí)質(zhì)譜中相對(duì)強(qiáng)度最大的前10個(gè)子離子為m/z211(999)、m/z239(374)、m/z167(288)、m/z210(244)、m/z212(140)、m/z195(103)、m/z219(89)、m/z199(56)、m/z240(35)、m/z168(29)。

2.2 天然染料化合物的碎裂機(jī)制

為鑒定染料分子的結(jié)構(gòu),需獲取MS/MS 碎裂的機(jī)制。天然染料中常見(jiàn)的色素多屬于蒽醌類(lèi)、黃酮類(lèi)和生物堿類(lèi)化合物,本文主要分析這3種代表性化合物的碎裂機(jī)制。

蒽醌類(lèi)染料化合物是典型的紅色染料來(lái)源,質(zhì)譜庫(kù)中記錄的幾種蒽醌類(lèi)化合物具有相似的結(jié)構(gòu)和碎裂方式。以茜素(Alizarin)為例[13](如圖3、4所示),主要有茜素準(zhǔn)分子離子[M-H]-(m/z239)及中性丟失形成的[M-H-CO]-(m/z211)、[M-H-CO2]-(m/z195)和[M-H-CO2-CO]-(m/z167)碎片離子。

圖3 茜素裂解規(guī)律

圖4 茜素的二級(jí)質(zhì)譜圖

黃酮類(lèi)化合物是指2個(gè)具有酚羥基的芳環(huán)(A和B)通過(guò)三碳鏈連結(jié)而成的一系列C6—C3—C6化合物,是天然染料中品種最豐富的化合物種類(lèi)。在多級(jí)質(zhì)譜負(fù)離子模式下,易形成黃酮苷和苷元的準(zhǔn)分子離子峰,在二級(jí)質(zhì)譜中苷元會(huì)進(jìn)一步裂解,產(chǎn)生一系列的特征性碎片離子,來(lái)源于中性丟失和環(huán)的逆狄爾斯-阿爾德裂解反應(yīng)[17]。

以槲皮素為例[18],圖5、6分別示出槲皮素裂解規(guī)律和二級(jí)質(zhì)譜圖?？梢钥闯?在槲皮素準(zhǔn)分子離子[M-H]-(m/z301)中存在[M-H-CO]-(m/z273)、[M-H-CO2]-(m/z257)以及 [M-H-CO2-CO]-(m/z229)碎片。槲皮素[M-H]-體系的 C 環(huán)容易發(fā)生開(kāi)裂,丟失 CO形成碎片m/z257;還可在 C環(huán)跨環(huán)開(kāi)裂產(chǎn)生m/z179、151、107 離子。

圖5 槲皮素裂解規(guī)律

圖6 槲皮素的二級(jí)質(zhì)譜圖

以木犀草素為例[19-20],圖7、8分別示出木犀草素裂解規(guī)律和二級(jí)質(zhì)譜圖。可以看出,準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-(m/z285) 產(chǎn)生豐富的碎片離子,其裂解規(guī)律為m/z285 中性丟失形成[M-H-H2O]-(m/z267)、[M-H-CO]-(m/z257)、[M-H-C2H2O]-(m/z243)、[M-H- CO2]-(m/z241)和[M-H-C3O2]-(m/z217)碎片離子,以及[M-H-CO]-(m/z257)繼續(xù)脫去C5H6O得到m/z175,[M-H-C2H2O]-(m/z243)繼續(xù)脫去CO2得到m/z199。此外,[M-H]-準(zhǔn)分子離子較易發(fā)生逆狄爾斯-阿德?tīng)柗磻?yīng)(RDA)裂解生成2個(gè)碎片離子m/z151和m/z133。

圖7 木犀草素裂解規(guī)律

圖8 木犀草素的二級(jí)質(zhì)譜圖

在常見(jiàn)的天然染料中,小檗堿、巴馬汀和藥根堿這3種原小檗堿類(lèi)化合物是生物堿類(lèi)染色植物的主要成分,且它們的裂解規(guī)律也十分相似。以小檗堿為例[21-22],圖9示出其裂解規(guī)律和二級(jí)質(zhì)譜圖?？梢钥闯?小檗堿[M+H]+(m/z336)準(zhǔn)分子離子中性丟失形成[M+H-CH3]+·(m/z321)碎片離子,進(jìn)一步脫去CH3·形成m/z308碎片,或脫去H·形成[M+H-CH3-H]+·(m/z320)碎片,接著再脫去1個(gè)CO形成m/z292碎片。

圖9 小檗堿裂解規(guī)律及二級(jí)質(zhì)譜圖

2.3 天然染料質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)的應(yīng)用

本文采用HPLC-MS對(duì)2件紡織品文物進(jìn)行染料檢測(cè),利用上述建立的天然染料質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行質(zhì)譜比對(duì),鑒定染料化合物。

圖10(a)示出巴州紅黃藍(lán)三色香囊的紅色絲線(xiàn)樣品碎片。在染料鑒定中,首先將圖10(b)色譜峰1(保留時(shí)間為13.38 min)對(duì)應(yīng)的二級(jí)質(zhì)譜導(dǎo)出至NIST MS Search 2.3軟件,如圖10(c)所示點(diǎn)擊“Library Search”按鈕進(jìn)行質(zhì)譜庫(kù)檢索,檢索結(jié)果顯示色譜峰1的質(zhì)譜與數(shù)據(jù)庫(kù)中茜素質(zhì)譜的匹配度最高,正向檢索匹配度(Match)為884,反向檢索匹配度(R. Match)為892,匹配概率(Prob)為98.1%。色譜峰2(保留時(shí)間為14.44 min)的質(zhì)譜與茜紫素質(zhì)譜的匹配度同樣優(yōu)秀,3個(gè)匹配項(xiàng)數(shù)據(jù)Match值為906,R.Match值為911,Prob值為98.6%。結(jié)合未知化合物和標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間比對(duì),證實(shí)了茜素和茜紫素的存在,說(shuō)明紅色織物碎片由西茜草(rubia tinctorum)染色。

注:圖(c)、(d)中橫坐標(biāo)為質(zhì)荷比,縱坐標(biāo)為相對(duì)豐度。

圖11示出巴州紅黃藍(lán)三色香囊中黃色絲線(xiàn)碎片文物樣品鑒定結(jié)果。在對(duì)香囊淡黃色織物碎片的染料鑒定中,質(zhì)譜庫(kù)檢索結(jié)果顯示色譜峰1(保留時(shí)間為8.47 min)和色譜峰2(保留時(shí)間為9.21 min)對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜分別與數(shù)據(jù)庫(kù)中藥根堿和小檗堿的質(zhì)譜相匹配。檢索結(jié)果顯示3個(gè)匹配項(xiàng)數(shù)據(jù)Match值為917、R.Match值為917、Prob值為98.8%和 Match值為843、R.Match值為844、Prob值為99.0%。結(jié)合未知化合物和標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間對(duì)比,確認(rèn)織物碎片中含有這2種物質(zhì),均為小檗屬植物(berberis spp.)的主要色素成分。

注:圖(c)、(d)中橫坐標(biāo)為質(zhì)荷比,縱坐標(biāo)為相對(duì)豐度。

圖12示出法國(guó)彩條花卉紋提花緞中黃色絲線(xiàn)文物樣品鑒定結(jié)果。在對(duì)黃色絲線(xiàn)的染料鑒定中,通過(guò)質(zhì)譜庫(kù)檢索,色譜峰1(保留時(shí)間為10.51 min)

注:圖(c)、(d)中橫坐標(biāo)為質(zhì)荷比,縱坐標(biāo)為相對(duì)豐度。

對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜與數(shù)據(jù)庫(kù)中木犀草素的質(zhì)譜相匹配,3個(gè)匹配項(xiàng)數(shù)據(jù)Match值為829,R.Match值為840, Prob值為98.7%。色譜峰2(保留時(shí)間為11.56 min)對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜與芹菜素的質(zhì)譜相匹配,3個(gè)匹配項(xiàng)數(shù)據(jù)Match值為802,R.Match值為804,Prob值為98.2%。推測(cè)黃色絲線(xiàn)由木犀草(reseda luteola)染色。

3 結(jié) 論

采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析了68種天然染料化合物,建立了常見(jiàn)天然染料的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù),應(yīng)用該數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定了2件古代紡織品中的天然染料化合物。巴州紅黃藍(lán)三色香囊中的紅色碎片含有茜素和茜紫素,經(jīng)分析為西茜草染色;黃色碎片含有小檗堿和藥根堿,經(jīng)分析為小檗屬植物染色。法國(guó)彩條花卉紋提花緞黃色紗線(xiàn)中含有木犀草素和芹菜素,經(jīng)分析為木犀草染色。

本文建立的天然染料質(zhì)譜庫(kù)可在正負(fù)離子檢測(cè)模式下工作,且在實(shí)際文物樣品的檢索結(jié)果中正反向檢索匹配度均達(dá)到800以上,匹配率達(dá)95%以上,實(shí)現(xiàn)了紡織品文物染料的快速準(zhǔn)確鑒別,減少了對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的依賴(lài),降低了實(shí)驗(yàn)室的運(yùn)行成本,證明了質(zhì)譜庫(kù)檢索技術(shù)應(yīng)用于天然染料鑒定的可行性和潛力。但是,目前建立的天然染料質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)中染料品種有待擴(kuò)充,且不能良好匹配不同品牌儀器產(chǎn)生的質(zhì)譜數(shù)據(jù),下一步可結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)繼續(xù)開(kāi)發(fā)檢索算法,提高譜庫(kù)的兼容性和可用性。