美洲大蠊小肽預(yù)處理對H2O2誘導(dǎo)人卵巢顆粒細(xì)胞氧化應(yīng)激及凋亡的抑制作用

孫蕊仙，唐運(yùn)萍，楊禮蓮，伏蓉，王婧羽，隋世燕

1 大理大學(xué) 云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南大理 671000；2 大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院

氧化應(yīng)激是由體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡引發(fā)的，也是導(dǎo)致衰老和疾病發(fā)生的一個重要因素。研究認(rèn)為，氧化應(yīng)激會導(dǎo)致女性內(nèi)分泌功能失調(diào)、卵母細(xì)胞數(shù)量減少，引起卵巢儲備功能下降［1］。氧化應(yīng)激在女性不孕癥的發(fā)生中起著關(guān)鍵作用，尤其是與年齡相關(guān)的生育能力下降有關(guān)［2］。因此，建立人卵巢顆粒細(xì)胞的氧化損傷模型對于研究卵巢老化及生殖功能減退相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制，以及篩選新型抗氧化劑具有重要意義。美洲大蠊原產(chǎn)于南美洲，屬于蜚蠊類，俗稱“蟑螂”。美洲大蠊小肽是從美洲大蠊蟲體中提取并經(jīng)分離純化后得到的，是一種以小分子肽類為主（占94.44%）的精提物［3］。鄒俊波等［4］研究發(fā)現(xiàn)，美洲大蠊小肽可通過降低氧自由基及一氧化氮自由基的含量預(yù)防急性胃潰瘍的發(fā)生，說明其具有抗氧化作用。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，美洲大蠊小肽具有抑制H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷及凋亡的作用［5］，但對其是否有預(yù)防作用尚不清楚。2023年3月—7月，本研究對H2O2誘導(dǎo)的人卵巢顆粒細(xì)胞（KGN細(xì)胞）氧化應(yīng)激模型給予不同濃度美洲大蠊小肽預(yù)處理，觀察其對細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的抑制作用。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、藥物與試劑 細(xì)胞：KGN 細(xì)胞由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部動物生理與生化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室贈予。藥物：美洲大蠊小肽由大理大學(xué)美洲大蠊研究團(tuán)隊提供。主要試劑：3% H2O2購自美國Sigma公司，CCK-8試劑購自大連美侖生物技術(shù)有限公司，活性氧（ROS）、一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞活力檢測的最佳實(shí)驗(yàn)條件確定

1.2.1 CCK-8 溶液配置所需的胎牛血清比例確定 取對數(shù)生長期的KGN細(xì)胞，加入不同濃度（0、150、200、250 μmol/L）H2O2作用2、4、6 h時，分別采用添加15%胎牛血清的培養(yǎng)液、無血清培養(yǎng)液配制CCK-8溶液，采用CCK-8法檢測細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示，當(dāng)使用添加15%胎牛血清的培養(yǎng)液配制CCK-8溶液時，0、150、200、250 μmol/L H2O2作用KGN 細(xì)胞2、4、6 h 時的細(xì)胞存活率無明顯下降趨勢反而升高，見表1；當(dāng)使用無血清培養(yǎng)液配制CCK-8溶液時，與0 μmol/L H2O2作用KGN 細(xì)胞相同時間比較，150、200、250 μmol/L H2O2作用KGN細(xì)胞2、4、6 h時的細(xì)胞存活率均降低，且250 μmol/L H2O2作用6 h后的KGN細(xì)胞存活率降低最明顯（P均＜0.05），見表2。提示15%胎牛血清會對CCK-8溶液檢測細(xì)胞存活率的結(jié)果造成影響，后續(xù)使用無血清培養(yǎng)基配制CCK-8溶液，同時選擇濃度為250 μmol/L的H2O2作用6 h進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

表1 添加15%胎牛血清培養(yǎng)液配制CCK-8溶液檢測得到不同濃度H2O2作用后的細(xì)胞存活率比較（）

表1 添加15%胎牛血清培養(yǎng)液配制CCK-8溶液檢測得到不同濃度H2O2作用后的細(xì)胞存活率比較（）

注：與0 μmol/L H2O2作用相同時間點(diǎn)比較，*P＜0.05；與同濃度H2O2上一時間點(diǎn)比較，#P＜0.05。

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表2 無血清培養(yǎng)液配制CCK-8溶液檢測得到的不同濃度H2O2作用后的細(xì)胞存活率比較（）

表2 無血清培養(yǎng)液配制CCK-8溶液檢測得到的不同濃度H2O2作用后的細(xì)胞存活率比較（）

注：與0 μmol/L H2O2作用相同時間點(diǎn)比較，*P＜0.05；與150 μmol/L H2O2作用相同時間點(diǎn)比較，#P＜0.05；與200 μmol/L H2O2作用相同時間點(diǎn)比較，△P＜0.05；與同濃度H2O2上一時間點(diǎn)比較，▲P＜0.05。

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1.2.2 細(xì)胞接種密度確定 將對數(shù)生長期的KGN細(xì)胞分為兩部分，細(xì)胞接種密度分別為0.7 × 104、1 × 104/孔，每一部分分別加入0、250 μmol/L H2O2作用6 h，使用無血清培養(yǎng)液配制CCK-8 溶液，采用CCK-8 法檢測細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示，接種密度為0.7 × 104/孔的KGN 細(xì)胞經(jīng)0、250 μmol/L H2O2作用6 h 后的細(xì)胞存活率分別為100.00% ± 4.50%、62.46% ± 1.98%，接種密度為1 × 104/孔的KGN 細(xì)胞經(jīng)0、250 μmol/L H2O2作用6 h 后的細(xì)胞存活率分別為100.00% ± 4.50%、83.86% ± 4.56%，兩部分加入H2O2后細(xì)胞存活率均下降（P均＜0.05），但細(xì)胞密度為0.7 × 104/孔較1 × 104/孔的細(xì)胞存活率下降更為明顯（P＜0.05）；提示細(xì)胞接種密度為1 × 104個/孔時，CCK-8 法對OD 值的變化不敏感。后續(xù)選擇KGN細(xì)胞的接種密度為0.7 × 104/孔進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞分組及美洲大蠊小肽預(yù)處理 取對數(shù)生長期的KGN 細(xì)胞，分為空白組、H2O2組和美洲大蠊小肽50、100、150 組。五組均使用添加15%胎牛血清和100 IU/mL 青—鏈霉素的DMEM-F12 培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h；H2O2組加入250 μmol/L H2O2作用6 h；美洲大蠊小肽50、100、150 組分別加入50、100、150 μg/mL 美洲大蠊小肽進(jìn)行預(yù)處理，然后加入250 μmol/L H2O2作用6 h。

1.4 細(xì)胞活力觀察 采用CCK-8 法。取對數(shù)生長期的KGN細(xì)胞，以0.7 × 104/孔接種于96孔板，每組設(shè)置6 個平行孔。細(xì)胞融合度為85%～90%時，參照“1.3”進(jìn)行分組處理，美洲大蠊小肽50、100、150組分別預(yù)處理6、12、24 h。各組分組處理后同一時間棄培養(yǎng)液，PBS 洗一遍，根據(jù)試劑盒說明書，每孔加入無血清培養(yǎng)基配比的CCK-8溶液100 μL（CCK-8∶培養(yǎng)液 = 1∶9），在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h，計算細(xì)胞存活率。

1.5 細(xì)胞NO、MDA 和ROS 表達(dá)檢測 取對數(shù)生長期的KCN 細(xì)胞，以5 × 105/孔接種于12孔板，每組設(shè)置6 個平行孔；參照“1.3”進(jìn)行分組處理，美洲大蠊小肽50、100、150 組分別預(yù)處理12 h；加入裂解液裂解細(xì)胞后，使用多功能熒光酶標(biāo)儀測定細(xì)胞NO、MDA表達(dá)。取對數(shù)生長期的KCN細(xì)胞，以5 × 104/孔接種于12 孔板，每組設(shè)置3 個平行孔；參照“1.3”進(jìn)行分組處理，美洲大蠊小肽50、100、150 組分別預(yù)處理12 h；每孔加入DCFH-DA（DCFH-DA∶無血清培養(yǎng)基 = 1∶1 000）500 μL，37 ℃孵育30 min，無血清培養(yǎng)基洗滌3 次后，使用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞熒光強(qiáng)度，以此表示ROS表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS25.0 統(tǒng)計軟件。計量資料采用S-W 正態(tài)性檢驗(yàn)方法，呈正態(tài)分布以表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，重復(fù)測量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量的方差分析；非正態(tài)分布以M（P25，P75）表示，兩組間比較采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組不同時間點(diǎn)細(xì)胞存活率比較 見表3。

表3 各組不同時間點(diǎn)細(xì)胞存活率比較（）

表3 各組不同時間點(diǎn)細(xì)胞存活率比較（）

注：與空白組同時間點(diǎn)比較，*P＜0.05；與H2O2組同時間點(diǎn)比較，#P＜0.05；與同組預(yù)處理6 h比較，△P＜0.05。

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2.2 各組細(xì)胞NO、MDA 及ROS 表達(dá)比較 見表4及OSID碼圖1。

表4 各組細(xì)胞NO、MDA、ROS表達(dá)比較（）

表4 各組細(xì)胞NO、MDA、ROS表達(dá)比較（）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與H2O2組比較，#P＜0.05。

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3 討論

氧化應(yīng)激參與了多種卵巢生理功能的調(diào)節(jié)，是導(dǎo)致卵巢細(xì)胞凋亡及卵巢功能衰退的主要原因之一。因此，減輕卵巢氧化應(yīng)激和炎癥對維持卵巢功能非常重要。H2O2極易透過細(xì)胞膜導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)的氧化損傷或誘發(fā)細(xì)胞凋亡。研究表明，利用H2O2誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的細(xì)胞發(fā)生氧化損傷并引起細(xì)胞凋亡是一種建立細(xì)胞氧化應(yīng)激的有效方法［6］。H2O2可通過引起氧化應(yīng)激使細(xì)胞內(nèi)ROS 生成增多，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［7-8］。研究認(rèn)為，低劑量的H2O2可通過調(diào)節(jié)線粒體功能而發(fā)揮抗炎作用，但隨著H2O2濃度的升高，其破壞作用增強(qiáng)，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡甚至死亡［9］。因此，確定H2O2的最佳作用濃度及時間對于建立可靠的氧化損傷細(xì)胞模型具有重要意義，才可以在該細(xì)胞模型上研究卵巢早衰的發(fā)病機(jī)制以及篩選新型抗氧化劑。研究顯示，50% ～ 80%的細(xì)胞存活率均可以促使H2O2造模成功［13-14］。本研究采用CCK-8 法檢測細(xì)胞存活率的結(jié)果顯示，當(dāng)使用添加15%胎牛血清的培養(yǎng)液配制CCK-8 溶液時，不同濃度H2O2作用KGN 細(xì)胞后的細(xì)胞存活率無明顯下降趨勢反而升高，這提示胎牛血清會對CCK-8 溶液的細(xì)胞活力檢測結(jié)果造成影響，后續(xù)需使用無血清培養(yǎng)基配制CCK-8 溶液；而當(dāng)使用無血清培養(yǎng)液配制CCK-8 溶液時，150、200、250 μmol/L H2O2作用KGN細(xì)胞2、4、6 h 時的細(xì)胞存活率均降低，且250 μmol/L H2O2作用6 h 后的KGN 細(xì)胞存活率降低最明顯，這提示H2O2的最佳作用條件為250 μmol/L作用6 h。

研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞接種密度不合適會影響細(xì)胞增殖及毒性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，適宜的細(xì)胞接種密度可以促進(jìn)細(xì)胞間接觸的形成，從而維持合適的細(xì)胞表型［10］。管瑩等［11］研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞生長達(dá)到飽和密度后，細(xì)胞間會發(fā)生接觸抑制，導(dǎo)致細(xì)胞增殖減慢、生長停止，從而進(jìn)入平臺期，出現(xiàn)假陽性結(jié)果。劉飛祥等［12］研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞密度過高或過低時，CCK-8法對細(xì)胞數(shù)量翻倍時的OD值變化不敏感，響應(yīng)量變化較小。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞接種密度為1 × 104/孔時，可能由于細(xì)胞密度太大，提前進(jìn)入平臺期而出現(xiàn)假陽性結(jié)果，或者因細(xì)胞密度過高時CCK-8法對OD值的變化不敏感，響應(yīng)量變化較小，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確，而接種密度為0.7 × 104/孔時就沒有這種情況。因此，我們在進(jìn)行CCK-8檢測時需將細(xì)胞接種密度控制為0.7 × 104/孔。

H2O2是一種穩(wěn)定性相對較好，能夠跨膜運(yùn)轉(zhuǎn)的ROS分子。細(xì)胞存活率和細(xì)胞內(nèi)ROS水平是評估氧化應(yīng)激細(xì)胞模型是否建立成功的關(guān)鍵指標(biāo)，最佳的造模條件既要極大程度減輕細(xì)胞損傷又要使ROS水平顯著升高。當(dāng)機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)能力減弱或遭受炎癥等因素刺激時，ROS含量或活性增強(qiáng)，破壞氧化與抗氧化防御系統(tǒng)之間的平衡，導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生，從而促進(jìn)Caspase-3表達(dá)，激活線粒體凋亡通路，造成氧化應(yīng)激和組織損傷［15］。MDA作為體內(nèi)脂質(zhì)過氧化物的最終代謝產(chǎn)物，是評價機(jī)體氧化應(yīng)激損傷的重要指標(biāo)之一。有研究發(fā)現(xiàn)，ROS水平過高會引起細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激，進(jìn)而降低女性的生殖壽命［16］。李艷青等［17］研究發(fā)現(xiàn)，多囊卵巢綜合征（PCOS）大鼠血清及卵巢組織中MDA表達(dá)均升高，Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)升高。周綿莉等［18］研究二仙湯對早發(fā)性卵巢功能不全小鼠氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡的影響時發(fā)現(xiàn)，小鼠血清ROS、MDA表達(dá)水平升高，Caspase-3、Bax及細(xì)胞凋亡上調(diào)。本研究結(jié)果顯示，H2O2組細(xì)胞NO、MDA、ROS表達(dá)均高于空白組，細(xì)胞存活率低于空白組，提示氧化應(yīng)激細(xì)胞模型建立成功。

美洲大蠊提取物是用不同溶劑溶解美洲大蠊蟲體內(nèi)相應(yīng)化學(xué)成分后，經(jīng)提取分離得到的純化物或混合物，具有抗氧化、抗心衰、抗肝纖維化等廣泛的藥理作用［19］。研究發(fā)現(xiàn)，美洲大蠊提取物可以抑制H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡，從而減輕炎癥反應(yīng)［20］。鄒俊波等［4］研究顯示，美洲大蠊醇提物對大鼠機(jī)體和卵巢具有一定的抗氧化應(yīng)激功能。孔彩華［21］研究顯示，美洲大蠊小肽能夠抑制H2O2誘導(dǎo)的豬卵巢顆粒細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，預(yù)處理6 h的美洲大蠊小肽50、100、150組細(xì)胞存活率與H2O2組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，預(yù)處理12、24 h的美洲大蠊小肽50、100、150組細(xì)胞存活率均高于H2O2組及同組預(yù)處理6 h；同時，預(yù)處理12 h 的美洲大蠊小肽50、100、150 組細(xì)胞MDA、NO、ROS表達(dá)均低于H2O2組，且美洲大蠊小肽50、100、150組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；這提示美洲大蠊小肽對H2O2誘導(dǎo)的KGN細(xì)胞氧化應(yīng)激有很好的預(yù)防作用，同時結(jié)合成本和實(shí)際情況，提示美洲大蠊小肽的最佳作用條件為50 μg/mL作用12 h。

綜上所述，美洲大蠊小肽能夠預(yù)防H2O2誘導(dǎo)的KGN 細(xì)胞氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡，以50 μg/mL 作用12 h為最佳作用條件。本實(shí)驗(yàn)不僅摸索出CCK-8法檢測KGN 細(xì)胞活力的最佳實(shí)驗(yàn)條件，同時也發(fā)現(xiàn)了美洲大蠊小肽預(yù)防H2O2誘導(dǎo)KGN 細(xì)胞氧化應(yīng)激及凋亡的最佳作用條件，為后續(xù)探索美洲大蠊小肽的作用機(jī)理提供數(shù)據(jù)支持。