變應(yīng)性鼻炎患者血清miR-Let-7e、sCD48水平變化及其與病情的關(guān)系

欒鎬彤，李琦

1 南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院（第二臨床醫(yī)學(xué)院）耳鼻喉科，廣州 510280；2 廣州市第一人民醫(yī)院耳鼻喉科；3 南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院（第一臨床醫(yī)學(xué)院）耳鼻咽喉頭頸外科

變應(yīng)性鼻炎（AR）全球發(fā)病率為10%～40%，臨床表現(xiàn)為清水樣鼻涕、鼻癢及鼻塞等，中重度患者常反復(fù)發(fā)作，誘發(fā)哮喘、中耳炎等疾病，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量［1-2］。微小核糖核酸Let-7e（miR-Let-7e）編碼基因位于19q13.41，無蛋白編碼功能，能夠調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子α（TNF-α）等炎癥因子表達(dá)，參與機(jī)體炎癥反應(yīng)及腫瘤發(fā)生等過程［3-4］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRLet-7e能夠通過靶向抑制Fas配體表達(dá)，維持Ⅰ型和Ⅱ型輔助性T淋巴細(xì)胞平衡，在AR發(fā)生中發(fā)揮抑制效應(yīng)，是潛在的AR 生物標(biāo)志物［5］。可溶性CD48（sCD48）是免疫球蛋白樣受體CD2 亞家族成員，是膜結(jié)合型CD48 的可溶性形式，參與淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的激活和分化過程［6］。研究發(fā)現(xiàn)，間歇性AR 患者血清sCD48 水平升高，是間歇性AR 早期診斷的血清生物學(xué)標(biāo)志物［7］。本研究觀察了AR 患者血清miR-Let-7e、sCD48 水平變化，并分析二者與患者病情嚴(yán)重程度的關(guān)系，為AR 的診斷及病情判斷提供依據(jù)。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 納入標(biāo)準(zhǔn)：①AR 診斷標(biāo)準(zhǔn)符合中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志編輯委員會鼻科組2015年制定的《中國變應(yīng)性鼻炎診斷和治療指南》［8］；②既往未進(jìn)行AR 相關(guān)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并鼻中隔偏曲、鼻腔鼻竇占位；②處于鼻炎、鼻竇炎急性加重期及哮喘急性加重期。選取2020 年2 月—2023年2月廣州市第一人民醫(yī)院收治并符合上述標(biāo)準(zhǔn)的AR 患者102 例作為觀察組，其中男54 例、女48 例，年齡（36.58 ± 5.13）歲，發(fā)作時(shí)間呈間歇性42例、持續(xù)性60 例，變應(yīng)原呈季節(jié)性44 例、常年性58 例，變應(yīng)性鼻炎評分（SFAR 評分）≥7 分64 例、＜7 分38 例，病情嚴(yán)重程度［8］為輕度36例、中度34例、重度32例，免疫球蛋白E（IgE）陽性69 例。選取同期體檢健康志愿者60 例作為對照組，其中男33 例、女27 例，年齡（35.97 ± 6.13）歲。兩組性別、年齡均具有可比性（P均＞0.05）。本研究通過醫(yī)院倫理委員會審核（AF/SQ-01-007），患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 血清miR-Let-7e檢測 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。抽取觀察組治療前及對照組入組后的清晨空腹靜脈血5 mL，室溫靜置1 h，3 000 r/min 離心10 min，取上層血清。采用TRIzol法提取血清總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系10 μL：模板1 μL，2×SYBR Green Premix 5 μL，正反向引物各1 μL，無酶水2 μL。PCR反應(yīng)過程：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，變性退火延伸共40個(gè)循環(huán)。miR-Let-7e上游引物：5'-AAAGCAAATCATCGGACGACC-3'，下游引物：5'-GTACAACACATTGTTTCCTCGGA-3'；內(nèi)參U6上游引物：5'-AGTAAGCCCTTGCTGTCAGTG-3'，下游引物：5'-CCTGGGTCTGATAATGCTGGG-3'。采用2-ΔΔCt法計(jì)算血清miR-Let-7e相對表達(dá)量。

1.3 血清sCD48 檢測 采用ELISA 法。取“1.2”剩余血清，嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行具體實(shí)驗(yàn)操作，檢測血清sCD48水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS27.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料采用K-S正態(tài)性檢驗(yàn)，呈正態(tài)分布以表示，結(jié)果比較采用方差分析或t檢驗(yàn)，重復(fù)測量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量的方差分析；非正態(tài)分布以M（P25，P75）表示，結(jié)果比較采用秩和檢驗(yàn)。兩變量間的相關(guān)性檢驗(yàn)采用Spearman相關(guān)分析法。以AR患者病情程度為因變量（中重度 = 1、輕度 = 0），以血清miR-Let-7e、sCD48為自變量，進(jìn)行影響中重度AR發(fā)生的多因素Logistic回歸分析。繪制血清miR-Let-7e、sCD48單獨(dú)及聯(lián)合檢測預(yù)測中重度AR的受試者工作特征（ROC）曲線，分析其預(yù)測價(jià)值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清miR-Let-7e、sCD48 水平比較 觀察組血清miR-Let-7e、sCD48 水平分別為2.32 ± 0.57、（4.52 ± 0.68）μg/L，對照組分別為4.69 ± 0.64、（0.42 ± 0.16）μg/L，兩組比較P均＜0.05。

2.2 不同臨床特征的AR 患者血清miR-Let-7e、sCD48水平比較 見表1。

表1 不同臨床特征的AR患者血清miR-Let-7e、sCD48水平比較（）

表1 不同臨床特征的AR患者血清miR-Let-7e、sCD48水平比較（）

注：不同臨床特征比較，*P＜0.05。

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2.3 AR患者血清miR-Let-7e、sCD48與病情嚴(yán)重程度、SFAR 評分、IgE 陽性的關(guān)系 AR 患者血清miRLet-7e 與病情嚴(yán)重程度、SFAR 評分、IgE 陽性均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r分別為-0.612、-0.589、-0.710，P均＜0.05），血清sCD48 與病情嚴(yán)重程度、SFAR 評分、IgE 陽性均呈正相關(guān)關(guān)系（r分別為0.540、0.657、0.721，P均＜0.05）。

2.4 血清miR-Let-7e、sCD48 與中重度AR 發(fā)生的關(guān)系 多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，血清miRLet-7e 升高是影響中重度AR 發(fā)生的獨(dú)立保護(hù)因素，血清sCD48 升高是影響中重度AR 發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（β分別為-0.456、0.581，OR值分別為0.634、1.788，95%CI分別為0.469～0.857、1.289～2.480，P均＜0.05）。見表2。

表2 血清miR-Let-7e、sCD48影響中重度AR發(fā)生的多因素Logistic回歸分析結(jié)果

2.5 血清miR-Let-7e、sCD48對中重度AR發(fā)生的預(yù)測價(jià)值 血清miR-Let-7e、sCD48單獨(dú)與聯(lián)合預(yù)測中重度AR發(fā)生的曲線下面積及95%CI分別為0.798（0.740～0.869）、0.823（0.753～0.879）、0.884（0.813～0.934），敏感度分別為59.3%、62.8%、90.8%，特異度分別為78.3%、80.2%、.75.3%。見表3、OSID碼圖1。

表3 血清miR-Let-7e、sCD48預(yù)測中重度AR發(fā)生的ROC曲線分析結(jié)果

3 討論

AR 是一種由空氣中的過敏原引起，并由IgE 介導(dǎo)的鼻腔過敏性炎癥疾病。我國成人AR 發(fā)病率達(dá)17.6%，并且呈逐漸上升趨勢［9］。中重度AR 發(fā)生時(shí)，可能導(dǎo)致患者睡眠障礙、焦慮抑郁等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量及工作學(xué)習(xí)效率。AR 早期病理特征主要為過敏原特異性IgE 結(jié)合肥大細(xì)胞受體，從而引起組胺釋放，而在AR 晚期以大量炎癥細(xì)胞如嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞的活化及大量炎癥因子釋放為主［10］。深入研究AR 的發(fā)病機(jī)制，尋找能夠評估AR 病情程度的血清標(biāo)志物，對于AR 的早期診治具有重要臨床意義。

miRNA 是一類長度較小的非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖及先天和后天的適應(yīng)性免疫。miR-Let-7e 是近年來發(fā)現(xiàn)的微小RNA 之一，參與調(diào)節(jié)CD4+T 淋巴細(xì)胞浸潤和Th2 型細(xì)胞因子釋放，與哮喘等過敏性疾病密切相關(guān)［11］。本研究結(jié)果顯示，AR患者血清miR-Let-7e水平降低，這與既往學(xué)者報(bào)道的AR患者及AR小鼠鼻黏膜組織中miR-Let-7e降低的結(jié)果一致［12］。本研究結(jié)果顯示，AR患者血清miR-Let-7e與病情嚴(yán)重程度、SFAR 評分、IgE 均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示miR-Let-7e表達(dá)下調(diào)參與了AR的發(fā)生發(fā)展。分析其原因，miR-Let-7e表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致抗原提呈細(xì)胞中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3的激活，誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞的過度激活，粒單集落刺激因子及白細(xì)胞介素4等促炎因子大量釋放，從而參與加重炎癥反應(yīng)，促進(jìn)AR的發(fā)生發(fā)展［13］。一項(xiàng)關(guān)于AR 動物模型的研究發(fā)現(xiàn)，AR 發(fā)生時(shí)miR-Let-7e表達(dá)下調(diào)，其靶基因Janus 激酶1 和細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)抑制因子4 mRNA穩(wěn)定性增加，二者共同作用促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞釋放組胺、IgE和TNF-α，從而加重AR病情，而過表達(dá)miR-Let-7e能夠抑制AR 小鼠的炎癥水平，抑制AR 疾病進(jìn)展［12］。本研究結(jié)果顯示，血清miR-Let-7e升高是影響中重度AR 發(fā)生的獨(dú)立保護(hù)因素，提示miR-Let-7e 能夠抑制中重度AR 的發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn)，給予miR-Let-7e mimics能夠抑制過敏性氣道炎癥動物模型氣道黏膜上皮細(xì)胞中白細(xì)胞介素13的產(chǎn)生，減少過敏原誘導(dǎo)的氣道黏液產(chǎn)生，抑制氣道的過敏性炎癥［14］。因此，miR-Let-7e 表達(dá)下調(diào)參與了AR 的發(fā)生發(fā)展，是評估AR病情嚴(yán)重程度的血清學(xué)標(biāo)志物。

CD48是一種糖基磷脂酰肌醇蛋白，包括膜受體及分泌型sCD48兩種形式，不僅存在于造血細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞表面，還能夠作為黏附分子結(jié)合中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等，發(fā)揮共刺激效應(yīng)［15］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，過敏性哮喘、鼻炎患者血清sCD48 水平升高，提示sCD48 可能是疾病早期診斷的新型血清生物標(biāo)志物［16-17］。本研究結(jié)果顯示，AR 患者血清sCD48 升高，并與病情嚴(yán)重程度、SFAR評分、IgE陽性呈正相關(guān)關(guān)系，提示sCD48參與了AR的發(fā)生發(fā)展。AR患者血清sCD48水平上調(diào)可能與嗜酸性粒細(xì)胞激活有關(guān)。也有研究證實(shí)，特應(yīng)性皮炎患者皮膚病損組織中sCD48 表達(dá)升高，并且體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示應(yīng)用金黃色葡萄球菌外毒素激活嗜酸性粒細(xì)胞后，嗜酸性粒細(xì)胞分泌sCD48 水平也升高［18］。sCD48 作為一種共刺激分子，參與促進(jìn)免疫細(xì)胞激活。研究表明，sCD48能夠與肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞表面的CD244 受體結(jié)合，促進(jìn)TNF-α、白細(xì)胞介素1 及白細(xì)胞介素4 等促炎細(xì)胞因子的釋放，加重鼻黏膜炎癥反應(yīng)［19］。此外，血清sCD48 水平能夠反映AR 患者CD48 的表達(dá)水平，而CD48 作為肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞的表面活化受體，能夠激活磷脂酰肌醇3-激酶通路，促進(jìn)白三烯、血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)和分泌，從而加重AR患者噴嚏和鼻塞癥狀［20］。本研究結(jié)果顯示，血清miR-Let-7e、sCD48 聯(lián)合預(yù)測中重度AR 的曲線下面積及敏感度均高于單獨(dú)預(yù)測，提示二者聯(lián)合對于AR患者的病情預(yù)測具有重要價(jià)值。

綜上所述，AR 患者血清miR-Let-7e 水平降低、sCD48水平升高，二者與患者病情嚴(yán)重程度有關(guān)，聯(lián)合檢測有助于判斷患者病情。但本研究未對miRLet-7e、sCD48 在AR 發(fā)生發(fā)展中的具體作用機(jī)制進(jìn)行研究，有待今后設(shè)計(jì)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證，以期為AR的臨床治療提供新的靶點(diǎn)。