高產3-甲基丁醛乳酸乳球菌對切達干酪風味的影響

陳 臣，田同輝，周文雅，于海燕，袁海彬，田懷香

（上海應用技術大學香料香精化妝品學部 上海 201418）

切達干酪是一種內部成熟的硬質干酪[1]，是目前世界上消費量最大的干酪品種，同時也是我國進口最多的干酪品種[2-3]。因其含有大量的酪蛋白和多種人體必需氨基酸、維生素等營養(yǎng)物質且具有濃郁的堅果風味而受到大眾的廣泛歡迎[4-6]。

風味是影響消費者對干酪喜好程度的重要因素[7]。對干酪生產商而言，根據消費者的喜好，關注他們對于干酪的質量和風味的需求至關重要[8]。附屬發(fā)酵劑是可應用于干酪生產并能夠提高干酪風味品質的一類微生物[9-10]，是干酪成熟過程中風味形成的主要貢獻者[1]。不同附屬發(fā)酵劑菌株對干酪的風味影響也有所差異。Drake 等[11]將瑞士乳桿菌WSU19 作為附屬發(fā)酵劑添加到低脂切達干酪中，其橡木香氣與堅果香氣強度相較于未添加該菌株的干酪樣品更高而苦味較低。宋云花等[12]研究發(fā)現(xiàn)，添加附屬發(fā)酵劑菌株——嗜熱鏈球菌H069-B-01 后切達干酪的水果風味強度有所增加。選擇合適的附屬發(fā)酵劑菌株，研究其對切達干酪風味的影響，對干酪風味改良具有重要意義。

雖然氣相色譜-質譜聯(lián)用技術（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）常用于香氣物質檢測，但是存在一定的局限性，例如對于一些含量低的香氣活性物質檢測能力有限，且無法直觀地區(qū)分樣品間的差異。此外，樣品的預處理及檢測時間限制了該技術的應用[13]。基于此，一些新興技術，例如氣相色譜-離子遷移譜（Gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）和電子鼻等已逐步應用于食品風味的檢測[14]。GCIMS 無需對樣品進行預處理且操作簡單、檢測速度快、靈敏度高[15]，已在多種食品的風味檢測中證明了該技術的高效性[16-17]。電子鼻通過模仿人類嗅覺感知達到識別并分類樣品中揮發(fā)性化合物的目的，能夠實現(xiàn)對樣品的快速檢測[18]。GC-MS、GCIMS 與電子鼻技術相結合可綜合各技術的優(yōu)點，從而達到快速、準確區(qū)分樣品間差異的目的[19-20]。

3-甲基丁醛在是切達干酪中提供堅果風味的關鍵香氣化合物之一[5]。本實驗室前期篩選出1 株在氨基酸培養(yǎng)基中具有高產3-甲基丁醛能力的乳酸乳球菌YN2-1（以下簡稱YN2-1）[21]。本研究將YN2-1 作為附屬發(fā)酵劑制備切達干酪，首先采用感官定量描述分析對干酪樣品進行評價，使用GC-MS 檢測添加YN2-1 的切達干酪及未添加該菌的干酪中3-甲基丁醛含量，而后用GC-IMS 檢測各干酪樣品中的揮發(fā)性風味化合物，最后采用電子鼻技術對不同切達干酪樣品進行區(qū)分及驗證，并結合判別因子分析（Discriminant factor analysis，DFA），解析干酪樣品間揮發(fā)性組分的差異，探究乳酸乳球菌YN2-1 對切達干酪風味的影響，為開發(fā)更適合我國消費者口味的原制切達干酪，促進我國干酪產業(yè)發(fā)展提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生鮮牛乳，光明乳業(yè)有限公司；發(fā)酵劑M14，法國丹尼斯克有限公司；凝乳酶MT2200，美國國際香精香料公司；乳酸乳球菌YN2-1，篩選自中國云南的乳扇酸乳清，已證實其具有高產3-甲基丁醛的能力以及良好的耐鹽性和耐酸性，現(xiàn)保存于上海應用技術大學產香菌種質資源庫；內標物2-辛醇（20 mg/L）、標準品3-甲基丁醛（色譜純）及正構烷烴（C6～C30，色譜純），美國Sigma-Aldrich Chemical 公司。

1.2 儀器與設備

氣相色譜-質譜聯(lián)用儀（GC-MS 7890-5975），美國Agilent 科技有限公司；Flavour Spec氣相色譜-離子遷移色譜聯(lián)用儀，德國G.A.S 公司；HERACLES II 快速氣相色譜型電子鼻，法國Alpha MOS 公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取頭，美國Supelco 公司；DC1741 型干酪小型制備機，上海承歡輕工機械有限公司；PT-20C 型微型殺菌機，上海沃迪智能裝備股份有限公司；EMS-10S 型恒溫水浴鍋，常州市人和儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 附屬發(fā)酵劑的制備 將乳酸乳球菌YN2-1在脫脂乳培養(yǎng)基中連續(xù)3 次傳代活化后離心（5 000 r/min，4 ℃，10 min），去除上清液，菌泥用滅菌生理鹽水洗滌并離心（5 000 r/min，4 ℃，10 min）2 次。隨后，用滅菌生理鹽水調整菌液濃度為1.0×109CFU/mL，置于4 ℃冰箱保藏待用（為保證菌體存活率，菌液準備過程與牛乳接菌發(fā)酵步驟緊密銜接）。

1.3.2 切達干酪的制備 取生鮮牛乳150 L，灌入殺菌機進行巴氏殺菌（75 ℃，15 s）。將巴氏殺菌后的牛乳冷卻至31 ℃后導入干酪罐中，加入發(fā)酵劑M14（1%，質量分數）及附屬發(fā)酵劑（菌液濃度1×109CFU/mL，加入量0.8%，體積分數），30 ℃熟化30 min，待牛乳pH 值下降約0.4 時加入凝乳酶MT2200（1.5%，質量分數）進行凝乳，該過程持續(xù)40 min 后切割凝乳，然后以1 ℃/5 min 的升溫速率將牛乳溫度升至38 ℃，達到預定溫度后排乳清操作，在此過程中溫度始終保持38 ℃。隨著酸度的上升，凝乳凝結成塊，將其切割成邊長30 cm 的方塊，堆釀處理，每隔15 min 翻轉1 次。將堆疊的凝乳塊切成1 cm3的方塊，均勻地將食鹽（2.5%，質量分數）撒到凝乳塊上，翻拌均勻后入模型壓榨成型，真空包裝，于10 ℃冰箱中成熟（該溫度有利于加快干酪的成熟）[22-24]。分別在成熟0，60 d 和120 d 時取樣，樣品編號為YN 0 d、YN 60 d、YN 120 d。以不添加附屬發(fā)酵劑且成熟相同時間的切達干酪為對照組，編號為KB 0 d、KB 60 d、KB 120 d。

1.3.3 感官評價 采用定量描述感官評價法對切達干酪樣品進行感官分析。評價小組由12 名成員組成，包括6 名男性和6 名女性成員，平均年齡24 歲。感官評價在標準感官實驗室進行。試驗前依據ISO 4121 標準對所有評價人員進行專業(yè)感官培訓。分別取6 個切達干酪樣品各20 g 于棕色不透明玻璃瓶中，60 ℃水浴加熱30 min，用3 位隨機數字編碼后以隨機順序呈遞給感官評價人員進行感官品評。結合已有的研究基礎[7，25]以及感官評價人員的感官描述，經感官小組成員討論后篩選本實驗所用切達干酪樣品的10 個感官描述詞及其相應的香氣參考物（見表1），并要求感官評價人員對切達干酪樣品香氣的喜好度進行打分。評價結果采用9 分制（1 分：極微弱/極討厭；3 分：弱/比較討厭；5 分：中等/既不討厭也不喜歡；7 分：強/比較喜歡；9 分：極強/極喜歡）。每個樣品重復評價3 次，記錄每位評價人員的評分結果，最后取平均值即香氣強度值。

表1 感官評價描述詞及其定義或相應參考物Table 1 Sensory evaluation descriptors and their definitions or corresponding references

1.3.4 氣相色譜-質譜聯(lián)用分析 采用頂空固相微萃取結合氣-質譜聯(lián)用的方法分析不同切達干酪樣品中的香氣成分。稱取3.0 g 研碎的干酪樣品于20 mL 頂空瓶中，加入內標物（2-辛醇，20 mg/L）100 μL。用聚四氟乙烯硅膠墊密封后于60 ℃水浴條件下平衡5 min，將萃取頭（50/30 μm，DVB/CAR/PDMS）插入頂空瓶中萃取30 min，等待進樣。

色譜柱采用 HP-Innowax（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣為氦氣，流速1 mL/min。升溫程序：在40 ℃下保持4 min，以3 ℃/min 升至100 ℃，保持2 min，以4 ℃/min 升至150 ℃，再以10 ℃/min升至230 ℃，保持5 min。進樣口溫度250 ℃。MS條件：電子轟擊離子源，電離能量70 eV；離子源溫度230 ℃，接口溫度250 ℃，四級桿溫度150 ℃。掃描模式為全掃描，質量掃描范圍m/z 30～450。各樣品均做3 次平行測定。

定性、定量分析：通過與NIST17 譜庫比較，同時根據相同色譜條件下C6～C30 正構烷烴的保留時間計算檢測物質的保留指數（RI），并與文獻[26]報道的RI 值進行比對定性。通過建立不少于5 點的標準曲線（y=1.96x+0.0883，R2=0.99）對3-甲基丁醛進行定量。

1.3.5 氣相離子遷移色譜分析 分別稱取3.0 g切碎的切達干酪樣品，置于20 mL 頂空進樣瓶中，密封，以500 r/min 的孵化轉速在60 ℃條件下孵育10 min，然后，通過1 mL 氣密加熱注射器（85℃）將100 μL 頂空氣體自動注入進氣口。色譜柱型號為MTX-5（柱長15 m，內徑0.53 mm，膜厚1.0 μm，美國RESTEK 公司），柱溫60 ℃，載氣為氮氣（純度≥99.999%）。流量程序設定：初始流速2 mL/min，保持2 min，然后在18 min 內流速線性升至100 mL/min，并保持在100 mL/min，直至30 min 止。IMS 溫度45 ℃，漂移氣體的流速150 mL/min。對每個樣品做3 次平行分析。

1.3.6 電子鼻分析 稱取切達干酪樣品各3.0 g，裝入20 mL 頂空進樣瓶中，置于電子鼻樣品盤，待測。測定條件：采用頂空自動進樣，進樣量5 000 μL，注射速度125 μL/s，孵育溫度70 ℃，孵育時間30 min，捕集阱捕集溫度50 ℃，捕集時間50 s，分流10 mL/min，柱溫箱初始爐溫50 ℃，等溫線250℃，檢測器溫度260 ℃，增益12，偏移量1 000。每個樣品做3 次平行測定。

1.4 數據處理

使用LAV 軟件（laboratory analytical viewer 2.2.1）、Reporter 插件、Gallery Plot 插件和Dynamic PCA 插件以及GC×IMS Library Search 處理GCIMS 數據，采用電子鼻內置程序（Winmuster，version 1.6.2）進行電子鼻數據處理與分析，數據用IBM SPSS Statistics 21.0 軟件進行單因素方差分析（ANOVA），用Duncan's 多重比較評定樣品間的差異性，當P<0.05 時具有顯著性差異。采用Origin Pro 9.0 對試驗數據作圖。

2 結果與分析

2.1 感官評價結果

采用定量描述感官評價法對不同切達干酪樣品的10 種香氣及喜好度進行評價，感官評價結果的雷達圖如圖1 所示。不同切達干酪樣品在喜好度、整體香、奶香味、堅果味、肉湯味、硫味以及酸味屬性上的香氣強度均存在顯著性差異（P<0.05）。香氣喜好度和整體香氣強度最高的兩個切達干酪樣品為YN 60 d 和YN 120 d，表明添加乳酸乳球菌YN2-1 作為附屬發(fā)酵劑可提高人們對切達干酪的喜愛程度。其中成熟120 d 的添加YN2-1 菌株的切達干酪的堅果味和肉湯味顯著高于其它干酪樣品，成熟60 d 的添加YN2-1 的樣品的堅果味香氣強度超過未添加附屬發(fā)酵劑的成熟120 d 的樣品，表明YN2-1 菌株可在切達干酪成熟過程中產生較多具有堅果味香氣的揮發(fā)性化合物。與不添加附屬發(fā)酵劑YN2-1 的切達干酪相比，添加附屬發(fā)酵劑的3 個成熟度的干酪樣品的奶香味均高于前者。此外，隨成熟時間的延長，切達干酪的硫味更加明顯。兩個成熟120 d 的切達干酪樣品的硫味均高于其它組別，這可能是導致感官評價員對YN 120 d 樣品的喜好程度次于YN 60 d 的原因之一。綜上所述，添加YN2-1 的樣品的堅果味、奶香味、肉湯味香氣強度均高于對照組，同時其喜好度得分也較高，表明乳酸乳球菌YN2-1 對切達干酪中優(yōu)良香氣的提升效果明顯。

圖1 不同切達干酪樣品的感官評價雷達圖Fig.1 Sensory evaluation radar chart of different cheddar cheese samples

2.2 GC-MS 分析結果

為探究添加YN2-1 菌株對切達干酪中3-甲基丁醛含量的影響，采用GC-MS 分析不同切達干酪樣品中的3-甲基丁醛，確定3-甲基丁醛在不同切達干酪樣品中的含量，結果見表2。其中KB 0 d和YN 0 d 2 個樣干酪品未經發(fā)酵和成熟，干酪中的3-甲基丁醛尚未由氨基酸轉化而成或含量極低，從而導致3-甲基丁醛未達到儀器的檢出限。根據檢測結果，成熟60 d 時添加YN2-1 的樣品（YN 60 d）中3-甲基丁醛含量是未添加該菌株樣品（KB 60 d）的3 倍以上，這表明添加YN2-1 菌株可有效提高切達干酪中3-甲基丁醛含量。3-甲基丁醛通常在成熟干酪中貢獻堅果香氣或巧克力香氣[27]，該結果可以解釋圖1 中樣品YN 60 d 的堅果風味香氣強度得分較高的原因。由于醛類化合物在干酪中隨成熟時間的延長而轉化為醇類以及相應的酸類[3]，因此在KB 120 d 中未檢出3-甲基丁醛，這也是YN 120 d 中3-甲基丁醛含量低于YN 60 d 的原因，此研究結果與切達奶酪相關研究報道[3，27]一致。

表2 不同切達干酪樣品中3-甲基丁醛含量Table 2 3-Methylbutyraldehyde content in different cheddar cheese samples

2.3 GC-IMS 分析結果

2.3.1 不同切達干酪樣品的氣相離子遷移譜圖分析 為探究添加YN2-1 對切達奶酪中除3-甲基丁醛外的其它揮發(fā)性風味化合物的影響，采用GC-IMS 對不同奶酪樣品進行風味分析。不同切達干酪樣品中揮發(fā)性化合物的GC-IMS 三維譜圖見圖2a，不同切達干酪樣品中的揮發(fā)性化合物種類和峰值強度均有所不同。為比較不同干酪樣品間的差異，結合二維俯視對比圖來分析樣品間的揮發(fā)性化合物見圖2b，以成熟0 d 的未添加附屬發(fā)酵劑干酪作參比，若某物質的濃度高于參比樣品，則為紅色，顏色越深該物質含量越高；低于參比，則為藍色；顏色越深該物質含量低于參比樣品越多。在相同成熟時間條件下，添加附屬發(fā)酵劑——乳酸乳球菌YN2-1 的切達干酪中部分揮發(fā)性化合物的含量高于未添加YN2-1 的干酪。隨著成熟時間的延長，干酪中揮發(fā)性化合物的種類及含量也有所變化，其中成熟120 d 的添加YN2-1 菌株的切達干酪揮發(fā)性化合物的種類最多且含量最高。

圖2 不同切達干酪樣品中揮發(fā)性有機物的GC-IMS 三維譜圖（a）及二維（b）對比圖Fig.2 GC-IMS 3D（a）spectra and 2D（b）comparison of volatile organic compounds in different cheddar cheese samples

2.3.2 不同切達干酪樣品揮發(fā)性化合物分析 采用IMS 數據庫和GC×IMS Library Search 內置的NIST 數據庫，根據保留時間、離子遷移時間和保留指數對不同切達干酪樣品中揮發(fā)性化合物進行分析。在6 個干酪樣品中共檢出揮發(fā)性化合物62種（含二聚體），其中酮類物質15 種、醛類物質11種、醇類物質12 種、酸類物質5 種、酯類物質9種、吡嗪類物質3 種、含硫化合物2 種、未知物質5 種。通過不同切達干酪樣品中揮發(fā)性化合物的指紋圖譜分析（圖3）可直觀呈現(xiàn)各揮發(fā)性化合物在不同樣品中的差異（顏色越深、越紅，該物質的含量越高）。結合表3 和圖3 分析，發(fā)現(xiàn)在添加YN2-1 的干酪樣品中檢測到的揮發(fā)性化合物種類多，且隨成熟時間的延長各樣品中揮發(fā)性化合物的種類也增加，同時其含量也有所變化。此外，不同成熟時間的YN2-1 干酪與空白對照組的揮發(fā)性化合物均存在顯著差異，成熟60 d 和120 d 時差異尤為明顯。

圖3 不同切達干酪樣品種揮發(fā)性物質的GC-IMS 指紋圖譜Fig.3 GC-IMS fingerprints of volatile compounds in different cheddar cheese samples

在成熟60 d 時，在添加YN2-1 菌株的切達干酪中3-甲基丁醛含量顯著高于對照樣品，表明YN2-1 菌株在切達干酪中產3-甲基丁醛能力強，同時驗證了2.2 節(jié)中GC-MS 的檢測結果。此外，YN 60 d 中的2，3-丁二酮、丁醛M、2-甲基丁醛、正戊醛、正丙醇、正庚醇、3-甲基丁酸、乙酸丁酯等物質的含量較成熟0 d 時增加明顯，且顯著高于成熟60 d 的未添加附屬發(fā)酵劑干酪。在這些顯著增加的物質中，2，3-丁二酮主要由檸檬酸進一步代謝形成，具有奶香味[28-29]；2-甲基丁醛的香氣貢獻同3-甲基丁醛類似，主要由氨基酸代謝形成，賦予切達干酪以可可和堅果類香氣[6]；乙酸丁酯主要來源于成熟過程中發(fā)生的酯化反應，可使切達干酪具有類似梨子味的水果香氣[29]。3-甲基丁酸來源于異戊醇或異戊醛的氧化，有一定的異味，然而干酪中含有的正丙醇可以抑制酸類物質所帶來的汗味屬性，從而使干酪的香氣更加柔和[30]。

當切達干酪樣品成熟120 d 時，添加YN2-1組和空白對照組中的揮發(fā)性化合物均發(fā)生較大的變化。在成熟120 d 的添加YN2-1 菌株的干酪樣品中3-甲基丁醛含量雖較成熟60 d 的有所下降，但仍顯著高于對照組。由于醛類的化學性質較為活潑，隨干酪成熟時間的增加易被還原成醇和相應的酸[31]，因此YN 120 d 樣品中2-甲基丁醛、3-甲基丁醛的含量較YN 60 d 中的含量有所降低。在YN 120 d 樣品中，檢測到含量較高的丙烯酸乙酯、丁酸丁酯、庚酸乙酯、2，5-二甲基吡嗪、2-乙烷基-3，5-二甲基吡嗪、3-甲基-1-丁醇、2-壬酮、2-辛酮，而在其它樣品中上述揮發(fā)性化合物含量極低。其中的酯類物質主要是由酯化反應或酯交換反應產生，因具有較低的氣味閾值而在干酪中類似果香和花香的風味貢獻較大[32]。吡嗪類來源于美拉德反應和微生物代謝，是干酪中的重要風味物質，具有典型的堅果類、烘烤類香氣[33]，加之YN 120 d 中同時含有堅果香氣的3-甲基丁醛等支鏈醛，因此在前期感官評價中樣品的堅果風味屬性得分較高。除上述特征物質外，相較于作為對照組的KB 120 d 樣品，YN 120 d 中的糠醇D、異丁醇、2-甲基-1-丁醇、異丁酸、二甲基二硫、正戊醛的含量更高，其中的丁酸、異丁酸被認為是天然切達干酪中重要的風味貢獻者[34-35]。

2.4 電子鼻分析結果

為了驗證感官評價、GC-MS 及GC-IMS 分析結果，直觀體現(xiàn)不同樣品間的氣味差異，將成熟0，60，120 d 的添加YN2-1 菌株切達干酪及其空白對照組干酪進行電子鼻分析。Heracles II 快速氣相型電子鼻是一種新型電子氣味分析儀器，結合了快速氣相色譜技術的優(yōu)點，其原理是通過兩根極性不同的色譜柱MXT-5 和MXT-1701 對氣味進行分離，并通過Arochembase 數據庫分析，具有快捷簡便、重復性好等優(yōu)點[36-38]。3 個成熟度條件下，添加YN2-1 菌株的切達干酪樣品在大多數出峰位置的峰面積大于未添加YN2-1 菌株的干酪（圖4），表明添加YN2-1 菌株的干酪樣品的多數香氣物質含量及香氣強度高于未添加組，再次證明添加乳酸乳球菌YN2-1 對切達干酪的多種揮發(fā)性香氣成分的含量具有一定的提升作用。

圖4 不同切達干酪樣品電子鼻雷達圖Fig.4 Electronic nose radar chart of different cheddar cheese samples

為進一步區(qū)分不同切達干酪樣品，且在縮小組內誤差的基礎上更好地體現(xiàn)樣品間的差異，對電子鼻數據進行判別因子分析（見圖5）。判別因子分析是判定個體所屬類別的統(tǒng)計分析方法，它通過兩個或多個已知類別的樣本數據優(yōu)化區(qū)分，在主成分分析法的基礎上使組間距離最大的同時保證組內差異最小[39-40]。如圖5 所示，6 個切達干酪樣品分布區(qū)域不重疊且分布間隔較大，在第1判別因子軸上不同成熟時間切達干酪樣品得到有效區(qū)分，同時添加YN2-1 菌株干酪與空白對照組在第2 判別因子軸上區(qū)分明顯，與電子鼻雷達圖結果一致。電子鼻分析表明：將YN2-1 作為切達干酪的輔助發(fā)酵劑，可顯著影響切達干酪的香氣表現(xiàn)，驗證了感官評價、GC-MS 及GC-IMS 的分析結果。

圖5 不同切達干酪樣品的判別因子分析圖Fig.5 DFA chart of different cheddar cheese samples

3 結論

采用GC-MS、GC-IMS 及電子鼻技術探究切達干酪中添加乳酸乳球菌YN2-1 作為附屬發(fā)酵劑對其風味的影響。結果表明，添加YN2-1 的切達干酪樣品與對照組的香氣品質、風味物質種類及含量均有顯著差異。YN2-1 菌株作為附屬發(fā)酵劑，可顯著提高干酪中3-甲基丁醛含量，增強堅果風味，并使干酪的消費者喜好度提高。此外，YN2-1 對于成熟60 d 或120 d 的切達干酪中2，3-丁二酮、2-戊酮D、2-壬酮、2-甲基丁醛、正丙醇、乙酸丁酯、丁酸丁酯、2，5-二甲基吡嗪、2-乙烷基-3，5-二甲基吡嗪等風味物質的產生以及奶香、果香風味的增強也有作用。綜上所述，乳酸乳球菌YN2-1 具有較好的應用潛力，適于開發(fā)適合中國消費者口味的干酪產品。