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    水產(chǎn)品中氯霉素酶聯(lián)免疫吸附分析法的構建與應用

    2023-12-16 02:55:58蔡丹鳳姚天擇郎一涵傅炎勇申屠旭萍俞曉平
    中國食品學報 2023年11期
    關鍵詞:脫脂乳包被氯霉素

    張 彪,蔡丹鳳,姚天擇,郎一涵,傅炎勇,申屠旭萍,俞曉平

    (1 中國計量大學生命科學學院 杭州310018 2 杭州銘治醫(yī)學檢驗實驗室有限公司 杭州 310020)

    氯霉素(Chloramphenieol,CAP)作為廣譜抑菌抗生素,曾作為特效藥應用于治療人類的傷寒、副傷寒及敏感菌所致的嚴重感染性疾病[1],也曾作為畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖投入品,多用于畜禽、水產(chǎn)品中厭氧菌感染和敏感微生物所致各種感染性疾病[2-4]。消費者長期使用氯霉素易引起造血系統(tǒng)、消化系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)疾??;氯霉素殘留易誘發(fā)致病菌的耐藥性,且經(jīng)食物鏈被攝入消費者體內(nèi)后,長期慢性積累后具有潛在的危害[5-7]。因此,歐美等國家已明令禁止使用氯霉素,我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部也相繼發(fā)布并完善了《食品動物禁用的獸藥及其它化合物清單》《動物性食品中獸藥最高殘留限量》,規(guī)定氯霉素不得用于食品和動物,動物性食品中不得檢出氯霉素[8-9]。然而,由于利益的驅(qū)使以及檢測難度大,動物性食品特別是水產(chǎn)品中氯霉素非法使用問題未得到有效控制和解決,仍然較為突出。因此開發(fā)一種操作簡單、檢測快速、高效靈敏的氯霉素分析方法顯得極為重要。

    目前,氯霉素的分析方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[10]、氣相色譜法(GC)[11]、液質(zhì)聯(lián)用法(LC-MS/MS)[12]、氣質(zhì)聯(lián)用法(GC-MS)[13]、微生物法[14]和酶聯(lián)免疫分析法[15-17]。液相與氣相色譜法分析氯霉素,檢測樣本少,難以實現(xiàn)大規(guī)模樣品檢測;與前兩種色譜法相比,液質(zhì)聯(lián)用法和氣質(zhì)聯(lián)用法雖然靈敏度高,檢測限低,但需要專業(yè)化人員操作,儀器成本和維護費用昂貴,不宜大規(guī)模應用;微生物法操作時間長且誤差大,靈敏度不高,難以大規(guī)模普及應用[18-19]。因此,急需開發(fā)一種檢測成本低、檢測效率高的氯霉素快速檢測方法。

    近年來,抗體-抗原免疫分析技術因具有靈敏度高、檢測成本低、產(chǎn)品可商業(yè)化及可實現(xiàn)現(xiàn)場即時檢測等優(yōu)點,而成為最具有發(fā)展和應用前景的痕量分析技術之一[20]。本研究利用氯霉素抗體與抗原,系統(tǒng)優(yōu)化工作條件,構建氯霉素的間接競爭酶聯(lián)免疫吸附測定法(ic-ELISA),并應用水產(chǎn)品中氯霉素殘留量的快速檢測,以期為其它小分子目標物酶聯(lián)免疫吸附測定法的開發(fā),動物性食品中氯霉素的快速檢測提供高效的檢測手段。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    氯霉素,德國Dr.Ehrenstorfer 公司;氯霉素抗體,天津泰進科技有限公司;卵清白蛋白(OVA)、牛血清白蛋白(BSA)、過氧化氫脲、3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB),Sigma 公司;氯霉素包被原(CAP-OVA)實驗室制備;其它試劑均為分析純級。

    Genics 酶標儀,TECAN 公司;96 孔酶標板,丹麥Nunc 公司;Millipore/Rios8 超純水系統(tǒng),法國Millipore 公司;CP80WX 超速離心機,日本日立公司。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 包被原添加量和抗體稀釋倍數(shù)的優(yōu)化 96微孔板每孔包被原的添加量依次為0.01,0.05,0.10 μg,抗體稀釋倍數(shù)為1∶2 000,1∶4 000,1∶6 000,1∶8 000,1∶12 000,1∶16 000,1∶24 000,1∶32 000,二抗稀釋倍數(shù)為1∶1 000,進行組合試驗,加入底物溶液顯色后,利用酶標儀測定不同條件下在波長450 nm 處的OD 值,并按照式(1)計算抑制率[21]。

    1.2.2 包被原包被條件與封閉液的優(yōu)化 在1.2.1節(jié)試驗結果上,分別選4 ℃-12 h,4 ℃-14 h,4℃-16 h,37 ℃-2 h,37 ℃-3 h,37 ℃-4 h 6 種方式進行包被原包被,測定不同條件下OD 值,并計算IC50值;然后分別選0.5%脫脂乳粉,1.0%脫脂乳粉,0.5% BSA,1.0% BSA,0.5%明膠和1.0%明膠進行封閉液優(yōu)化試驗。

    1.2.3 氯霉素間接競爭酶聯(lián)免疫分析方法(ic-ELISA)的構建 競爭反應時間及溫度,酶標二抗反應時間等參考前期工作[22]。ic-ELISA 方法的構建步驟如下[22]:在最佳包被條件下,包被原包被96微孔(100 μL/孔);磷酸鹽緩沖液(PBST)洗板3次,200 μL/孔封閉液37 ℃封閉1 h;PBST 洗板3次,加入梯度標準或5 倍稀釋樣品提取液(50 μL/孔)和抗體(50 μL/孔),37 ℃孵育1 h;PBST 洗板4 次,加入酶標二抗(100 μL/孔),37 ℃孵育0.5 h;PBST 洗板5 次,加入底物37 ℃顯色15 min,1.25 mol/L 硫酸(50 μL 孔)終止反應,測定波長450 nm 處OD 值,計算不同標準品的抑制率,以氯霉素質(zhì)量濃度為橫坐標,抑制率為縱坐標擬合S 型標準曲線,根據(jù)標準曲線獲得本方法的靈敏度(IC50)和檢測限(IC15)。

    1.2.4 氯霉素ic-ELISA 特異性評價 選取氯霉素結構類似物(氟苯尼考、甲砜霉素)和孔雀石綠、隱色孔雀石綠、恩諾沙星、諾氟沙星、磺胺甲惡唑、磺胺二甲嘧啶、四環(huán)素、沙丁胺醇、慶大霉素、甲硝唑、結晶紫等11 種同類抗生素進行方法特異性評價,評價的指標為交叉反應率,計算方法見式(2)[22]。

    1.2.5 氯霉素ELISA 的穩(wěn)定性和應用性評價 日內(nèi)和日間變異系數(shù)(CV)評價方法的穩(wěn)定性[23],選取大黃魚、縊蟶、牛蛙等水產(chǎn)品進行方法應用性評價。樣品處理如下[3]:首先準確稱取2.0 g 肌肉樣品,加入到含6.0 mL 乙酸乙酯中,充分振蕩5 min,5 000 r/min 離心5 min 后,取3.0 mL 上清液,50 ℃下氮氣吹干,依次加入2.0 mL PBS 溶液和2.0 mL 正己烷均渦旋60 s,5 000 r/min 離心5 min 后,取下層水相用于分析。樣品加標水平為5.0,10.0,20.0 μg/kg。LC-MS/MS 檢測氯霉素的樣品處理和分析條件參考GB/T 20756-2006 《可食動物肌肉、肝臟和水產(chǎn)品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》[24]。

    2 結果與討論

    2.1 包被原添加量和抗體稀釋倍數(shù)的優(yōu)化

    包被原添加量和抗體的稀釋倍數(shù)是影響酶聯(lián)免疫吸附分析法靈敏度和檢測限的重要因素之一[25]。試驗結果如圖1 所示,每孔的包被量相同,隨著抗體稀釋倍數(shù)增加,OD 值和IC50值整體呈現(xiàn)下降趨勢;當每孔包被原包被量為0.05 μg,抗體稀釋倍數(shù)為1∶16 000 時,IC50值最小,OD 值為0.84,因而選擇每孔包被量為0.05 μg,抗體稀釋倍數(shù)為1∶16 000 進行后續(xù)研究。

    圖1 包被量與抗體稀釋條件的優(yōu)化Fig.1 Optimization of coating antigen amount and antibody dilution conditions

    包被原包被條件和封閉液的種類及濃度是影響酶聯(lián)免疫分析方法靈敏度(IC50)的重要因素[25]。如圖2 所示,不同包被條件的OD 值差異顯著(P<0.05),其中包被條件為4 ℃-14 h,4 ℃-16 h,37 ℃-3 h,37 ℃-4 h 時,IC50值較低,且IC50值差異不顯著(P>0.05),變異系數(shù)小于4.53%,說明上述的包被條件下方法的穩(wěn)定性好,結合檢測時間和實際情況考慮,本研究選擇包被條件為4 ℃-14 h 進行后續(xù)試驗。如圖3 所示,選取BSA和明膠封閉時,IC50值高于同質(zhì)量分數(shù)的脫脂乳粉,差異極顯著(P<0.01);0.5%脫脂乳粉為封閉液,IC50值最低。因此封閉液選擇0.5%脫脂乳粉。

    圖2 包被條件的優(yōu)化Fig.2 Optimization of temperature and time of coating condition

    圖3 封閉液種類的優(yōu)化Fig.3 Optimization of the type of blocking solution

    2.2 氯霉素ic-ELISA 標準曲線的構建

    經(jīng)過上述試驗條件的優(yōu)化,構建氯霉素ic-ELISA 最佳工作條件:包被量為0.05 μg/孔,包被條件為4 ℃-14 h,0.5%脫脂乳粉為封閉液,抗體稀釋倍數(shù)為1∶16000。如圖4 所示,本研究構建的氯霉素的“S”型標準曲線的方程為y=98.6856+(11.3477-98.6856)/[1+(x/6.1134)1.0235](R2=0.9994),計算得靈敏度IC50=(4.88±0.33)μg/L,檢測限IC15=(0.29±0.13)μg/L。

    圖4 氯霉素ic-ELISA 方法標準曲線Fig.4 Standard curve of CAP by ic-ELISA

    2.3 氯霉素ic-ELISA 方法特異性評價

    為進一步驗證氯霉素ic-ELISA 方法的有效性,本研究通過交叉反應率進行氯霉素ic-ELISA 特異性評價[26]。如表1 所示,氯霉素ic-ELISA 方法結果分析表明,氟苯尼考、甲砜霉素、孔雀石綠、隱色孔雀石綠、恩諾沙星、諾氟沙星、磺胺甲惡唑、磺胺二甲嘧啶、四環(huán)素、沙丁胺醇、慶大霉素、甲硝唑和結晶紫的交叉率低于0.1%,說明氯霉素抗體不能識別氯霉素的結構類似物和11 種同類抗生素,構建的氯霉素ic-ELISA 方法特異性良好。

    表1 交叉反應率檢測結果Table 1 The detection results of cross-reaction rate

    2.4 氯霉素ic-ELISA 方法穩(wěn)定性和應用性評價

    本研究采用日內(nèi)和日間變異系數(shù)評價氯霉素ic-ELISA 方法的穩(wěn)定性,實際樣品檢測和加標回收評價氯霉素ic-ELISA 方法的應用性。如表2 所示,氯霉素ic-ELISA 方法的日內(nèi)變異系數(shù)(CV)在2.28%~4.63%之間,日間CV 值在3.56%~6.96%之間,LC-MS/MS 方法CV 值在0.69%~1.94%之間,構建的氯霉素ic-ELISA 方法穩(wěn)定性良好。對大黃魚、縊蟶、牛蛙樣品中氯霉素進行檢測,儀器分析與本方法均未檢測到本底濃度,樣品中添加5.0,10.0,20.0 μg/kg 3 個水平,加標回收試驗結果表明,ic-ELISA 方法對氯霉素回收率在83.90%~100.73%之間。對ic-ELISA 和LC-MS/MS 進行氯霉素檢測結果進行線性回歸分析(圖5),日內(nèi)(日間)檢測數(shù)據(jù)與LC-MS/MS 檢測數(shù)據(jù)相關系數(shù)R2=0.9924(R2=0.9793),說明ic-ELISA 檢測結果與LC-MS/MS 檢測結果具有很好的一致性。本文構建的氯霉素ic-ELISA 方法,穩(wěn)定性良好,可應用于水產(chǎn)品中氯霉素含量的檢測。

    圖5 ic-ELISA 與LC-MS/MS 檢測結果相關性分析Fig.5 Correlation analysis of detection results between ic-ELISA and LC-MS/MS

    3 結論

    本文以食品動物禁用獸藥氯霉素為研究對象,系統(tǒng)優(yōu)化間接競爭酶聯(lián)免疫分析(ic-ELISA)方法的包被原添加量、抗體稀釋倍數(shù)、包被條件、封閉液種類等工作參數(shù),建立ic-ELISA 方法。所構建氯霉素ic-ELISA方法,靈敏度為(IC50)4.88 μg/L,檢測限(IC15)為0.29 μg/L,本方法只特異性識別氯霉素,不能識別結構類似物和同類抗生素,交叉反應率均低于0.1%。 本文構建的氯霉素ic-ELISA對大黃魚、縊蟶、牛蛙添加回收率范圍為83.90%~100.73%,變異系數(shù)(CV)范圍為2.28%~6.96%, 檢測結果與LC-MS/MS檢測結果具有較好的一致性。 綜上所述,本文構建的氯霉素ic-ELISA 方法,可應用于水產(chǎn)品中氯霉素殘留進行準確檢測,為食品安全提供一份保障。同時,本方法為禁止使用的農(nóng)獸藥殘留、生物毒素、非法添加劑以及其它食品危害因子間接競爭酶聯(lián)免疫分析方法開發(fā)與應用提供技術參考。

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